ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái nguyên - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH Thái nguyên - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lêi c¶m ¬n! Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS. Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư Phạm - Đại Học Thái Nguyên. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó! Hà nội, tháng 9 năm 2008 Học viên Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1 DANH MỤC CÁC BẢNG 2 DANH MỤC CÁC HÌNH 3 MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 8 1.1.1. Tính chất hóa lý 8 1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng sống 10 1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH 13 1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam 13 1.2.2. Nguồn gốc phát sinh 14 1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH 15 1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý 16 1.3.2. Phƣơng pháp phân hủy sinh học 16 1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 19 1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH 19 1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV 21 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 25 1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật 29 1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống 29 1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử 30 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1.1. Nguyên liệu 33 2.1.2. Hóa chất 33 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy 33 2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu 34 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nƣớc nhiễm dầu 34 2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn 35 2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn 36 2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase 36 2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phƣơng pháp của Sambrook, Russell 36 2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phƣơng pháp PCR 37 2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng 38 2.4.4.4. Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động 40 2.4.4.5. Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại 41 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH 42 3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 44 3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31 45 3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR 49 3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 50 3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp 52 3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 54 3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng BQN31 57 IV. KẾT LUẬN 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ) LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) POP Persistent Organic Pollutant DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid VSV Vi sinh vật X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside μl Microlit μm Micromet PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa nhân) ppm đơn vị một phần triệu (mg/l) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH 9 Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH 20 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật 30 Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH 42 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 44 Bảng 3.3: phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng BQN31 46 Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 46 Bảng 3.5: Độ tương đồng của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế 56 Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế 60 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân (PAH) 8 Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật 21 Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm 22 Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 43 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31 45 Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 45 Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 50 Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 50 Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 51 Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng được lựa chọn 52 Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 53 Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng vi khuẩn BQN31 53 Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 54 Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000 nucleotide so sánh 55 [...]... tiêu nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1 Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH 2 Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập 3 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn có khả. .. catechol được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu và thực hiện đề tài Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn tốt nghiệp 7 Khoa Sinh -... và các điều kiện sống thích hợp Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng dụng cho vi c kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa trong vi c phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm Để tăng cường quá trình phân hủy sinh học, vi c... trọng phân hủy PAH và các chất ô nhiễm trong môi trường đất [27] Thống kê ở bảng 1.2 cho thấy, vi sinh vật phân hủy PAH thuộc nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau [3], [6], [11], [27], [33], [42], [51], [60], [58], [61], [62] Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa PAH phần lớn thuộc vi khuẩn, vi khuẩn lam và một số vi tảo [16], [38], [58], [39], [60] Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy. .. thái sinh trưởng tốt trước khi các vi sinh vật bản địa kịp thích nghi, tấn công và làm thay đổi cấu trúc cơ chất Tuy nhiên, vi c lên men vi sinh vật với khối lượng lớn là điều không dễ dàng và vô cùng tốn kém, mặt khác cũng không đảm bảo vi sinh vật giữ nguyên được các đặc tính phân hủy ô nhiễm [26], [27] 1.4 Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 1.4.1 Vi sinh vật phân hủy PAH Hiện nay, có nhiều nghiên. .. vậy, công nghệ phân hủy sinh học đã trở thành công nghệ thân thiện với môi trường Phương pháp phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt được khá nhiều thành tựu Công nghệ sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn tất cả các công nghệ khác Đặc biệt, trong điều kiện sinh thái đa hệ, vi c áp dụng công nghệ phân hủy sinh học PAH... có nhiều nghiên cứu về khả năng của vi sinh vật sử dụng các PAH có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene, phenanthrene và anthracene Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tiềm năng phân hủy các PAH có trọng lượng phân tử cao như chrysene và benzo[a]pyrene [16] Vi sinh vật phân hủy PAH phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn... Trọng lượng phân tử vào khoảng 128 – 278 g/mol (Hình 1.1) Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) PAH là những chất kỵ nước Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48] Đặc điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển... tới 31 mg/l Nếu khả năng hòa tan trong nước của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng chúng bị phân hủy sinh học bởi vi sinh vật [10] Ngược lại, khả năng hòa tan trong nước của PAH cao thì khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật cũng cao Điều đó cho thấy khả năng hòa tan trong nước của các PAH có... truyền bổ sung vào các môi trường bị ô nhiễm Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong vi c bổ sung vi sinh vật vào các nơi bị ô nhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao do nhiều nguyên nhân (sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường; sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật) [26] Kích thích sinh học là quá . PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học. tiêu nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập và tuyển chọn một. loại vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH. 2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập. 3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một