Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 1 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh 1.1. Đặt vấn đề Kim Ngân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuộc Họ Kim Ngân (Caprifolianceae) là cây dược liệu chứa tanin và một saponin. Hoa chứa một flavonoid là scolymosid lonicerin và một số carotenoid (ε. caroten, cryptoxanthin, auroxanthin). Quả mọng giàu carotenoid mà phần lớn là cryptoxanthin. Lá chứa một glucosid gọi là loganin và khoảng 8% tanin. Theo Y học cổ truyền: Kim Ngân Hoa có tác dụng thanh nhiệt giải độc. Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại chứng minh cây thuốc Kim Ngân Hoa có tác dụng: kháng khuẩn, chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làm tăng tác dụng thực bào của bạch cầu, tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh cường độ bằng 1/6 của cà phê, làm hạ cholesterol trong máu, tăng bài tiết dòch vò và mật. Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch tán và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dòch hạch, thương hàn, cận thương hàn, liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả. Tác dụng yếu hơn đối với các trực khuẩn bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng. Nước sắc lá Kim Ngân với nồng độ 201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chế trực khuẩn cận thương hàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam). Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng điều trò ung thư trong Đông và Tây y như ung thư tuyến vú, gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáp trạng, trực tràng, Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho cảnh đẹp, hoa thơm, mành che nắng và mái che nắng, Kim Ngân còn có tác dụng hấp thu nhiệt của ánh nắng mặt trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 2 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh tre, mành nhựa và mái tôn chống nóng. Ngoài ra, nó còn hút thán khí (CO 2 ), nhả dưỡng khí (O 2 ) làm sạch môi trường, tạo bầu không khí trong lành. Việt Nam được xem là một nước có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng với số lượng trên 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật và là thò trường đầy hứa hẹn khi nhu cầu sử dụng rất lớn không chỉ là thuốc mà xu thế mỹ phẩm dùng nguyên liệu từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu tổng hợp đã chiếm 90% tổng số mỹ phẩm được sản xuất. Tuy nhiên, trong vấn đề sản xuất, kinh doanh và lưu thông, phân phối dược liệu, nguồn dược liệu chưa tương xứng với tiềm năng hiện có và còn rất nhiều bất cập. Hơn 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước vẫn phải nhập khẩu, chủ yếu sản xuất những loại thuốc thông thường, ngay cả những mặt hàng thuộc về thế mạnh của Việt Nam là các loại thuốc y học cổ truyền (YHCT), dược liệu lưu hành trên thò trường cũng chủ yếu nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Singapore. Tại TP.HCM, nơi chiếm đến 70% tỷ trọng số lượng thành phẩm và nguyên liệu dược liệu của cả nước, 90% mặt hàng đông dược lưu hành trên thò trường là hàng nhập lậu. Một điều đáng lưu tâm nữa là chất lượng dược liệu hiện nay vẫn chưa được kiểm soát (trên 50% mẫu kiểm tra không đạt tiêu chuẩn chất lượng) và tỷ lệ này với các loại thuốc từ dược liệu là 10%. Ngoài ra, việc trồng dược liệu hiện nay vẫn thiếu sự quy hoạch tập trung, thiếu sự hỗ trợ căn cơ từ nhà nước khiến thò trường dược liệu không ổn đònh, cây dược liệu vì thế cũng không phát triển. Vẫn chưa có một cơ quan chuyên môn nào đảm trách khâu kỹ thuật sản xuất dẫn đến tình trạng các cây dược liệu không đảm bảo được năng suất – chất lượng – giá cả ổn đònh để cạnh tranh được với dược liệu nhập khẩu. Như vậy với giá trò to lớn của cây Kim Ngân, là cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 3 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Nam trong tình hình dược liệu của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nói riêng thì việc đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy mô công nghiệp để có thể nâng cao năng suất và số lượng cây trồng trong thời gian ngắn nhất đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ cho thò trường Việt Nam và trên thế giới là điều hết sức cần thiết. 1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro. Đồng thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trò dược lý trong cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp dược. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến mẫu cấy lá của cây Kim Ngân. SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 4 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 5 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh 2.1. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1. Khái niệm Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác đònh ở điều kiện vô trùng. Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002). 2.1.2. Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghóa vô cùng to lớn đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trò đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. 2.1.2.1. Về mặt lý luận sinh học cơ bản Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tính của cơ thể với hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra qui luật về mối tương quan giữa các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh và có thể gây ra những thay đổi đònh hướng ở mức độ tế bào (trước khi cho ra cây hoàn chỉnh). Trong một cơ thể, rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể. Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng ta có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt. Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đầy sự phát triển của cây trồng theo chiều hướng mong muốn. Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiến hành nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ. Từ đó, người ta SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 6 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh tìm ra được những cơ chế miễn dòch thực vật. Khi con người hoàn toàn làm chủ được cơ chế này thì các biện pháp phòng bệnh được hoàn thiện và như vậy việc chống bệnh sẽ trở nên đỡ tốn kém hơn rất nhiều. 2.1.2.2. Về mặt thực tiễn sản xuất Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy mô còn có những đóng góp hết sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống. Ý nghóa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuật sản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng. Những lợi ích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắt như sau:  Kiểm soát được dòch bệnh cây trồng. Bằng phương pháp nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh.  Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất.  Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch.  Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối. Sự đồng loạt này sẽ giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch. Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên. Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện cho khâu tiêu thụ và chế biến. Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớn trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp. Đây thực sự đã và đang là cuộc cách mạng xanh trong ngành trồng trọt. 2.1.3. Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp nhân giống in vitro SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 7 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Một số thuận lợi của phương pháp nhân giống in vitro (Pierik, 1975, Anonymous, 1980; van Assche, 1983; Gebhard và cộng sự, 1983; Kunneman- Kooij, 1984):  Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.  Có thể tái sinh được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo và sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô và tạo được cây sạch bệnh vì có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu vào nuôi cấy, đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy. Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất.  Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng.  Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm.  Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân giống kế tiếp.  Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy.  Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng gen.  Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma.  Một số loại cây bò mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bất thụ đực, cây bất thụ do đột biến… có thể được duy trì và nhân giống bằng phương pháp nhân giống in vitro. SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 8 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh Tuy nhiên bên cạnh những thuận lợi trên, phương pháp nhân giống in vitro có những bất lợi sau:  Kiểu gen thực vật không được ổn đònh trong một số hệ thống nuôi cấy.  Đặc biệt đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện.  Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một số cây.  Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bò tấn công bởi một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng. Vì vậy, cần phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận.  Khả năng tái sinh cây có thể bò mất đi do việc cấy chuyển mô sẹo và huyền phù tế bào được lặp lại nhiều lần.  Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện.  Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành của cây tăng lên. 2.1.4. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lónh vực như:  Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuôi cấy tế bào trần).  Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế bào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp. SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 9 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh  Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).  Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn).  Vi nhân giống những giống cây có giá trò khoa học và thương mại.  Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp.  Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử.  Nuôi cấy quang tự dưỡng. 2.1.5. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô Bảng 2.1. Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô Nguồn gốc mẫu cấy Kích thước Mẫu được tách Đỉnh sinh trưởng 0,5 – 1 mm Tế bào đỉnh sinh trưởng Chồi đỉnh 0,5 – 1 cm Chốp đỉnh có chứa một phần thân Chồi bên 0,5 – 1 cm Chồi bên có chứa một phần thân, lá và chồi nách Mẫu lá 0,2 – 0,3 cm Mẫu lá được cắt nhỏ, phân nửa được cấy chìm vào môi trường Phiến lá 0,2 – 1 cm Phiến lá non được đặt trên môi trường, mặt dưới đặt trên mặt thạch Rễ 0,5 – 1 cm Mẫu rễ được đặt trên mặt thạch Dạng củ hành 1 – 2 cm Mẫu được đặt trên mặt hay được cấy chìm phân nữa vào môi trường Hạt nảy mầm 2 – 3 mm Chồi non Hạt phấn 0,1 – 0,5 mm Hạt phấn trong túi phấn 2.1.6. Các bước nhân giống in vitro Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau: SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 10 [...]... vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển)  Vò trí của mẫu cấy trên cây Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vò trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và phát triền in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vò trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh... Caprifoliaceae  Chi: Lonicera L  Loài: Lonicera japonica Thunb Hình 2.1 Cây Kim Ngân Hoa (Lonicera japonica Thunb) Tên  nước ngoài: Japanese honeysuckle (Anh), chèvrefeuille du Japon (Pháp) Tên khác:  o Nhẫn đông hoa (Tân Tu Bản Thảo) o Ngân hoa (Ôn Bệnh Điều Biện) o Kim Ngân Hoa, Kim Ngân Hoa Lộ, Mật Ngân Hoa, Ngân Hoa Thán, Tế Ngân Hoa, Thổ Ngân Hoa, Tỉnh Ngân Hoa (Đông Dược Học Thiết Yếu) o Song Hoa... agar, pH,… 2.1.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro 2.1.8.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro: Kiểu di truyền  Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh... 2.1.6.1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác đònh đúng cây cần nhân giống Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả... của cây, nơi mô của chúng còn giữ khả năng phân sinh Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm SVTH: Nguyễn Thái Quỳnh Quyên 17 Đồ án tốt nghiệp GVHD: CN Bùi Văn Thế Vinh Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất đònh: đặc điểm di truyền của loài, tuổi của mẫu, vò trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu. .. sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957) Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của những cây. .. dài 25cm, đường kính đạt đến 5mm Mặt ngoài màu vàng đến vàng nâu, phủ đầy lông ngắn Mùi thơm nhẹ vò đắng Mùa hoa: tháng 3 – 5 Theo Tài nguyên Cây Thuốc Việt Nam, ngoài Kim Ngân nói trên người ta còn dùng một số loại Kim Ngân sau:  Kim Ngân Dại (Lonicera dasystyla Rehd): Lá hình trứng nhọn dài 28 cm, rộng 14 cm; Mép lá trên nguyên, lá gốc chia thùy; Phiến lá mỏng, mặt trên nhẵn, mặt dưới phủ lông mòn;... Biên) o Kim Đằng Hoa (Hà Bắc Dược Tài) 2.2.2 Đặc điểm quan trọng của cây Kim Ngân Hoa Kim Ngân Hoa có tên khoa học là Lonicera japonica Thunb, là loại dược liệu quan trọng thuộc họ Kim Ngân (Caprifoliaceae) Họ này gồm khoảng 800 lồi tập trung phổ biến ở khu vực ôn đới Bắc bán cầu, với trung tâm đa dạng nằm ở miền đông Bắc Mỹ và miền đông châu Á, trong khi không có mặt tại khu vực châu Phi nhiệt đới và miền... đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp + Mẫu thực vật thường bò nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu bằng các chất này trước khi khử trùng + Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuôi cấy Khi bò hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bò ức chế và lâu... Dược)  2.2.4 Điều kiện trồng trọt Kim Ngân có nguồn gốc ở vùng Đông Á, phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên Ở Việt Nam, Kim Ngân phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi và trung du phía bắc, như Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây,… Kim Ngân thích nghi với nhiều loại đất và khí hậu khác nhau Cây ưa sáng, thường mọc ở rừng thứ sinh, đồi cây bụi và rừng thưa núi đá vôi Giống SVTH: . những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trò dược lý trong cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp dược. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các. chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển).  Vò trí của mẫu cấy trên cây Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vò trí mẫu cấy lên sự. thụ cho thò trường Việt Nam và trên thế giới là điều hết sức cần thiết. 1.2. Mục đích và nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro. Đồng