Tạp chí NN và PTNT số 117-2007, trang 59-64 SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH MỤC GỖ BẠCH ĐÀN Eucalyptus obliqua L. Her. Trần Thanh Trăng Viện Khoa học Lâm nghiệp Viêt Nam TÓM TẮT Phương pháp phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn Eucalyptus obliqua được dựa vào phân tử DNA tách chiết từ 26 mẫu gỗ bạch đàn bị mục thu thập tại Tasmania (Australia). Ri-bô-xôm DNA được khuyếch đại (PCR) bởi cặp mồi điền hình ITS1-F/ITS4 chỉ phát hiện được 18 mẫu có DNA. Trên bản gel cho thấy có 11 mẫu chỉ có 1 dải DNA và 7 mẫu cho nhiều dải DNA. Vùng sao chép nội bộ (ITS) của 11 mẫu được xác định trình tự chuỗi trực tiếp và 7 mẫu có sản phẩm PCR thể hiện có nhiều loài nấm cùng xuất hiện được tách dòng. Sản phẩm tách dòng được phân tích bằng phương pháp PCR-RFLP, đại diện của mỗi nhóm PCR-RFLP được xác định trình tự chuỗi. Để xác định các loài nấm mục gỗ trong mẫu thí nghiệm, các chuỗi ITS được so sánh hoặc phân tích sự tiến hóa với các cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen (Genbank) và các cơ sở dữ liệu cá nhân. Kết quả phân tích DNA từ các mẫu gỗ mục đã xác định được 15 loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, 17 loài nấm thuộc lớp Ascomycetes và 1 loài thuộc lớp Zygomycetes. Trong tổng số 33 loài nấm phát hiện được trong mẫu gỗ, chỉ có 13 loài thuộc lớp nấm Basidiomycetes và 7 loài thuộc lớp nấm Ascomycetes là những loài gây mục gỗ thực sự, còn 13 loài khác là các loài thứ sinh. Từ khóa: Bạch đàn Eucalyptus obliqua, DNA, nấm gây mục gỗ, PCR-RFLP. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch đàn là loài cây phổ biến tại bang Tasmania (Australia), chiếm khoảng 883.000 ha trong tổng số 3,17 triệu ha rừng tự nhiên tại bang này, bao gồm loài E. obliqua. Gỗ bạch đàn được sử dụng để đóng đồ gia dụng, trong công nghiệp được dùng làm nguyên liệu giấy. Tuy nhiên, một số loài nấm gây mục gỗ tấn công cây bạch đàn sống, một số khác lại gây hại trên gỗ gia dụng, gỗ thành phẩm. Nấm mục gỗ gây cho gỗ bị biến chất, làm mất màu, mất trọng lượng và độ bền. Xác định được nấm bệnh và các đặc điểm sinh thái của chúng sẽ mang lại các lợi ích quản lý. Có rất nhiều loài nấm không thể nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm (Johannesson và Stenlid 1999) bởi vậy một số kết quả phân lập nấm bệnh không phản ánh chính xác loài nấm gây bệnh trong mô thực vật. Bên cạnh đó, hầu hết các loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, loài nấm gây mục gỗ chủ yếu, có thể phân lập được nhưng hệ sợi lại không sinh ra bào tử hữu tính, đó là đặc điểm chính để xác định bằng phương pháp hình thái (Nobles 1948). Đã có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định nấm gây bệnh mục gỗ, như phân lập sợi nấm và xác định bằng hình thái sợi, nhuộm màu hóa học, cộng hưởng phân tử từ, phương pháp huyết thanh (hay phương pháp ELISA) (Jasalavich 2000). Bên cạnh đó, phương pháp phân tử PCR (Polymerase Chain Reaction) có thể sử dụng để khuyếch đại các phân đoạn điển hình của DNA, ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả nhanh, chính xác và phát hiện nấm bệnh ở giai đoạn rất sớm mà một số phương pháp trên không thể áp dụng. Phát hiện nấm bệnh bởi phương pháp PCR và xác định nấm bệnh bằng phương pháp xác định trình tự chuỗi trực tiếp từ các mẫu mô thực vật sẽ tránh được các bước khó khăn trong phân lập và duy trì sợi nấm tinh khiết trên môi trường nhân tạo. Vùng sao chép nội bộ ITS (internal transcribed spacer) của ri-bô-xôm DNA là vùng phù hợp cho sự phân biệt các loài nấm (Mitchell et al. 1995). Bài viết này trình bày kết quả nghiên cứu về phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua tại bang Tasmania. II. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 1. Nội dung - Phát hiện nấm trong mẫu gỗ mục bằng kỹ thuật DNA. - Giám định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua bằng kỹ thuật DNA. 2. Vật liệu Đề tài sử dụng 26 mẫu gỗ mục được lấy mẫu từ các khúc gỗ mục ở giai đoạn trung bình của rừng bạch đàn E. obliqua tại Tasmania để xác định nấm mục gỗ bằng phương pháp phân tử và được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Khoa học Nông nghiệp, trường Đại học Tasmania, Australia. 3. Phương pháp Tách DNA: Lấy phoi gỗ mục được thực hiện theo phương pháp của Jasalavich và đồng tác giả (2000) bằng cách sử dụng khoan sách tay. Phương pháp khử trùng bề mặt và thay thế mũi khoan trong mỗi lần khoan được áp dụng để tránh sự lấy nhiễm DNA giữa các mẫu gỗ. Tách DNA của các loài nấm mục gỗ sử dụng phương pháp glassmilk của Glen và đồng tác giả (2002). Cho một lượng nhỏ phoi gỗ đến vạch 200 µl trên ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vật liệu trên trong ống eppendorf bằng chày kết hợp với nitơ lỏng. Thêm vào đó khoảng 300-500 µl chất tách chiết DNA (Reader & Broda 1985). Ống eppendorf được ủ trong bể nước ở nhiệt độ 65 o C trong 60 phút. Sau đó được ly tâm với tốc độ 14,000 vòng/phút trong 15 phút. Khoảng 200 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới trong có chứa 800 µl NaI 100% (trạng thái lạnh) và 7 µl glassmilk. Hỗn hợp được làm lạnh và lắc đều trong vòng 15 phút để DNA gắn vào glassmilk, sau đó được ly tâm với tốc độ 14,000 vòng/phút trong 10 giây. Phần kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch đệm và cồn. Sau đó hỗn hợp được ly tâm, tách phần kết tủa và làm khô. Phần kết tủa được hòa tan trong 25 µl dung dịch TE (10 mM Tris HCl pH8, 1 mM EDTA), hỗn hợp được ủ trong bể nước ở 45 o C trong vòng 5 phút. Ống eppendorf được ly tâm ở 14,000 vòng/phút trong 2 phút, phần hỗn hợp chứa DNA được chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 4 o C. Khuyếch đại PCR: Vùng ITS 1 và 2 được khuyếch đại từ DNA vừa thu trên bằng cặp mồi được thiết kế điển hình cho nấm ITS1-F (Gardes và Bruns 1993) và ITS4 (White et al. 1990). Trong 50 µl phản ứng PCR, 10 µl DNA được sử dụng như bản mẫu. Mỗi phản ứng PCR gồm có 1x polymerase chất đệm (Fisher Biotec), 2 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTPs, 0.25 µM cho mỗi loại mồi, và 0.08 U TTH + polymerase (Fisher Biotec) và 0.2 mg/ml chất BSA (Bovine Serum Albumin, Fisher Biotec). Thông số khuyếch đại PCR như sau: bước khởi đầu tách đôi sợi DNA ở 95 o C trong 3 phút. Sau đó là 35 chu kỳ: tách sợi DNA ở 94 o C trong 30 giây, gắn mồi ở 55 o C trong 30 giây, kéo dài ở 72 o C trong 30 giây, ở chu kỳ cuối cùng sự kéo dài được thực hiện ở 72 o C trong 7 phút. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR loại PTC 225 Peltier Thermal Cycler. Điện ly: các sản phẩm PCR được điện ly trên bản gel (2,5% agarose) ở 4 volts/cm, trong 30 phút. Thang DNA 100bp (Fisher Biotec) được sử dụng để ước lượng kích cỡ DNA. Bản gel được nhuộm trong ethidium bromide (1µg/1ml), lắc ở tốc độ chậm trong 15 phút. DNA được quan sát dưới tia cực tím và được chụp ảnh với máy ảnh Kodak EDAS290. Tách dòng nấm từ sản phẩm PCR: Sau khi được khuyếch đại (PCR), các sản phẩm PCR từ các mẫu gỗ mục có nhiều dải DNA trên bản gel được tách dòng bằng bộ kít tách dòng, sử dụng véc-tơ pGEM R -T (Promega). Quá trình gắn DNA vào véc-tơ pGEM R -T được tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm (các dòng) sau đó được phân tích biến động chuỗi bằng phương pháp PCR – RFLP. Các enzym giới hạn Hinf I và Tag I được sử dụng riêng rẽ để cắt các dòng. Sản phẩm cắt được điện ly 2 trên bản gel 25 cm với 2.5% Hi-Resolution agarose (Progen Industries Limited) ở 100 volts trong 5 giờ. Các dòng của mỗi mẫu gỗ được phân nhóm dựa trên hình thái PCR-RFLP và đại diện của mỗi nhóm được khuyếch đại PCR (như trên) và xác định trình tự chuỗi. Xác định trình tự chuỗi phân tử DNA: 90-100 µl sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kít MO BIO Laboratories, Inc. UltraClean TM PCR Lean-up. Phản ứng xác định trình tự chuỗi: sử dụng bộ kít Quick Start với một số thay đổi như sau: Mỗi phản ứng xác định trình tự chuỗi DNA gồm 10 µl, trong đó sử dụng 3-5 µl DNA mẫu cùng với 3.2 pmol mồi (ITS1-F) và 2 µl DTCS Quick Start Master Mix. Kết tủa bằng cồn: 0.25 µl của 20 mg/ml glycogen, 2 µl của 3 M Sodium Acetate và 2 µl của 100 mM Na 2 -EDTA được bổ xung vào mỗi phản ứng. Trình tự chuỗi DNA được xác định trên hệ thống phân tích gen và được sửa trên phần mềm Chromas Lite, phiên bản 2.0, 2004. Các chuỗi DNA được sắp xếp trên ClustalW (Thompson et al. 1994). Sau đó các chuỗi DNA này được so sánh sự giống nhau với các dữ liệu trên ngân hàng gen, sử dụng phần mềm BLAST (Altschul et al. 1997) trên BioManager (ANGIS 2005) và với các dữ liệu cá nhân, sử dụng phần mềm FASTA, phiên bản 3.4 (Pearson và Lipman 1998). Ngoài ra phân tích sự tiến hóa cũng được thực hiện. Các chuỗi DNA mẫu và DNA tham khảo được sắp xếp với nhau, biểu đồ Dendrogram được tạo trên phần mềm ClustalW và DNA ml trên phần mềm Phylip (ANGIS 2005; Felsenstein 1998) sau đó được xem trên phần mềm TreeView, phiên bản 1.6.6. III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Phát hiện nấm mục gỗ Trong tổng số 26 mẫu gỗ làm thí nghiệm chỉ phát hiện được 18 mẫu gỗ có phân tử DNA của sợi nấm bằng phương pháp PCR với cặp mồi ITS1-F/ITS4. Mười một (11) mẫu gỗ chỉ có một dải DNA trên mỗi mẫu (Hình 1a, các làn từ 6 đến 16) được xác định trình tự chuỗi trực tiếp, còn 7 mẫu có 2 dải DNA (Hình 1a, các làn 2, 3, 4, 5, 17, 18, 19) được tách dòng và phân tích biến động chuỗi bằng phương pháp PCR-RFLP (ví dụ Hình 1b) trước khi xác định trình tự chuỗi. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 a) Sản phẩm PCR trên bản gel từ mẫu gỗ mục Làn 1: thang DNA, các làn từ 2 đến 19 tương đương với các mẫu S21, S23, S24, S40, S34, S41, S45, S46, S52, S53, S60, S66, S69, S70, S71, S51, S62, S80. b) Sản phẩm PCR-RFLP trên bản gel từ mẫu gỗ mục S40 Hình 1. Sản phẩm PCR và PCR-RFLP trên bản gel Như vậy, bằng phương pháp tách chiết DNA và khuyếch đại PCR bằng cặp mồi điển hình cho nấm ITS1F/ITS4, có thể phát hiện sự tồn tại của các loài nấm có trong mẫu gỗ mục cho dù trong mẫu gỗ mới có sợi nấm. 3 2. Xác định nấm mục gỗ Trong đó 11 mẫu được xác định trình tự chuỗi ITS trực tiếp và 7 mẫu được xác định sau khi tách các dòng nấm bằng véc-tơ tách dòng. Kết quả phân tích DNA từ 18 mẫu gỗ bạch đàn mục được trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Kết quả phân tích DNA từ các mẫu gỗ mục Mẫu số Xác định Mã số trên Genbank Kết quả tìm kiếm trên BLAST Lớp nấm S34 Trực tiếp AF377204 Tricholoma sp. Basidiomycetes S41 Trực tiếp AJ635314 Oidiodendron myxotrichoides Ascomycetes S45 Trực tiếp AJ415551 Fomitopsis rosea Basidiomycetes S46 Trực tiếp AY112936 Hymenoscyphus ericae 1 Ascomycetes S52 Trực tiếp AF508346 Bridgeoporus nobilissimus Basidiomycetes S53 Trực tiếp AJ006682 Diplomitoporus lindbladii 2 Basidiomycetes S60 Trực tiếp AJ006682 Diplomitoporus lindbladii Basidiomycetes S66 Trực tiếp AF486129 Sporendocladia foliicola Ascomycetes S69 Trực tiếp AF486129 Sporendocladia foliicola Ascomycetes S70 Trực tiếp AJ415551 Fomitopsis rosea Basidiomycetes S71 Trực tiếp AY220542 Ganoderma sp.3 Basidiomycetes AJ006677 Skeletocutis amorpha Basidiomycetes AJ 416069 Oligoporus placentus Basidiomycetes S21 Tách dòng AY805585 Cadophora malorum Ascomycetes AY491667 Serpula lacrymans Basidiomycetes AY618685 Sporothrix sp. Ascomycetes AY786143 Togninia minima 3 Ascomycetes AY781213 Zygomycete sp. Zygomycetes AF062787 Oidiodendron pilicola Ascomycetes S23 Tách dòng AY606305 Phialocephala dimorphospora Ascomycetes AF486120 Mycelium radicis-atrovirens Ascomycetes AY805586 Phialophora sp. Ascomycetes AJ784399 Oidiodendron setiferum Ascomycetes AY781242 Cadophora sp. Ascomycetes S24 Tách dòng AY373933 Penicillium spinulosum Ascomycetes AY618685 Sporothrix sp. Ascomycetes AJ293884 Ophiostoma grandicarpum 4 Ascomycetes AF062803 Oidiodendron rhodogenum Ascomycetes S40 Tách dòng AY618687 Ascomycete sp. Ascomycetes AY854085 Grifola sordulenta Basidiomycetes AB084621 Phlebia uda 5 Basidiomycetes S51 Tách dòng AY006666 Postia balsamea Basidiomycetes AF506468 Scytinostroma ochroleucum Basidiomycetes AY916743 Crinipellis perniciosa Basidiomycetes S62 Tách dòng AY373864 Aspergillus restrictus Ascomycetes AF335445 Mycena sp. Basidiomycetes S80 Tách dòng AY506466 Scytinostroma galactinum Basidiomycetes Ghi chú: 1 Hymenoscyphus ericae: tên mới = Rhizoscyphus ericae; 2 Diplomitoporus lindbladii: tên mới = Poria lindbladii; 3 Togninia minima: têm mới = Phaeoacremonium aleophilum; 4 Ophiostoma grandicarpum: tên mới = Ceratocystis grandicarpa; 5 Phlebia uda: tên mới = Mycoacia uda. Kết quả bảng 1 cho thấy có 15 loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, các loài nấm thuộc lớp này được coi là các loài nấm chính gây bệnh mục gỗ (Rayner and Boddy 1988) và 17 loài được xác định thuộc lớp nấm Ascomycetes và 1 loài thuộc lớp Zygomycetes. Schwarze và cộng sự (2000) 4 cho rằng các loài nấm thuộc lớp Ascomycetes này cũng có khả năng gây ra bệnh mục gỗ, thường gây bệnh mục gỗ mềm (Soft rot). Tuy nhiên không phải tất cả các loài nấm được xác định từ các mẫu gỗ mục trong bảng 1 đều là nguyên nhân chính dẫn đến gỗ bị mục. Đối với nhóm nấm thuộc lớp Basidiomycetes như là Tricholoma, đối với nhóm nấm thuộc lớp Ascomycetes, ví dụ Penicillium spinulosum, Aspergillus restrictus và thậm trí một loài thuộc lớp Zygomycetes hoàn toàn không có khả năng gây ra bệnh mục gỗ. Sự hiện diện của chúng hoàn toàn là thứ sinh, tức là gỗ sau khi đã bị các loài khác gây mục chúng mới xuất hiện. Sử dụng các chuyên khảo của Jasalavich và đồng tác giả (2000), Allmér và đồng tác giả (2006), David và đồng tác giả (2005) để loại bỏ các loài nấm thứ sinh, gây mốc và danh mục các loài nấm gây mục gỗ bạch E. obliqua được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Các loại nấm gây mục chính Loài nấm Lớp nấm Kiểu mục Bridgeoporus nobilissimus Basidiomycetes Mục nâu Crinipellis perniciosa Basidiomycetes Mục nâu Diplomitoporus lindbladii 1 Basidiomycetes Mục nâu Fomitopsis rosea Basidiomycetes Mục nâu Oligoporus placentus Basidiomycetes Mục nâu Postia balsamea Basidiomycetes Mục nâu Serpula lacrymans Basidiomycetes Mục nâu Skeletocutis amorpha Basidiomycetes Mục nâu Ganoderma sp.3 Basidiomycetes Mục trắng Grifola sordulenta Basidiomycetes Mục trắng Phlebia uda 2 Basidiomycetes Mục trắng Scytinostroma galactinum Basidiomycetes Mục trắng Scytinostroma ochroleucum Basidiomycetes Mục trắng Cadophora sp. Ascomycetes Mục mềm Hymenoscyphus ericae 3 Ascomycetes Mục mềm Oidiodendron pilicola Ascomycetes Mục mềm Oidiodendron rhodogenum Ascomycetes Mục mềm Oidiodendron setiferum Ascomycetes Mục mềm Phialocephala dimorphospora Ascomycetes Mục mềm Phialophora sp. Ascomycetes Mục mềm Ghi chú: 1 Diplomitoporus lindbladii: tên mới = Poria lindbladii; 2 Phlebia uda: tên mới = Mycoacia uda; 3 Hymenoscyphus ericae: tên mới = Rhizoscyphus ericae Kết quả từ bảng 2 cho thấy có 8 loài thuộc lớp Basidiomycetes gây ra bệnh mục gỗ màu nâu (Brown rot). Nấm gây bệnh mục gỗ màu nâu phân hủy cellulose và hemicellulose rất nhanh ở giai đoạn mới bắt đầu thâm nhập vào gỗ. Thành tế bào bị các-bon hóa, dẫn đến gỗ bị mất độ bền. Chúng thường gây bệnh trên cây sống, gỗ đã được chặt hạ. Bên cạnh đó, có 5 loài cũng thuộc lớp Basidiomycetes gây ra bệnh mục gỗ màu trắng (White rot). Nấm gây bệnh mục gỗ màu trắng chủ yếu phân hủy lignin, nhưng cũng có khả năng phân hủy tất cả các thành phần của thành tế bào. Chúng thường làm cho gỗ mất màu và có màu trắng, làm cho gỗ mất độ bền, mất trọng lượng và tỷ trọng. So với nấm gây bệnh mục gỗ màu nâu, nấm gây bệnh mục gỗ màu trắng phân hủy gỗ chậm hơn. Và có 7 loài thuộc lớp nấm Ascomycetes gây ra bệnh mục gỗ mềm. Nấm gây bệnh mục gỗ mềm phân hủy thành tế bào ngoài của gỗ theo chiều dọc và thường xuất hiện ở giai đoạn cuối của quá trình mục gỗ. Trong số các loài nấm ở bảng trên (Bảng 2), có 5 loài nấm gây mục gỗ (Diplomitoporus lindbladii, Fomitopsis rosea, Oligoporus placentus, Postia balsamea, Ganoderma sp.) cũng được Hopkins (2006) tìm thấy trên các mẫu gỗ bạch đàn E. obliqua thu tại bang Tasmania. 5 Xác định nấm mục gỗ bằng phân tích biểu đồ Dendrogram dựa trên phân tích chuỗi ITS của phân tử DNA được thể hiện ở hình 2. 0.1 AY569451 Ganoderma weberianum LF159 Ganoderma sp. AY569450 G. cupreum AJ627585 G. mastoporum AY593864 AY593865 AY220542 Ganoderma sp. GB-1 AY220540 Ganoderma sp. BJ-8 16453C3 S71 AY220539 Ganoderma sp. BJ-7 16453C2 16452D1 16453C1 16732C 167311B AJ608709 G. applanatum LF157 G. applanatum LF400 Ganoderma sp.2 LF569 G. applanatum E7587 G. a pp lanatum AJ006685 G. adspersum AY593855 AY593856 AY593854 AF255117 Ganoderma sp. JM95/5 AF255121 Ganoderma sp. JM95/6 16722A Ganoderma sp.1 AY456341 G. lucidum AJ627584 AJ608713 G. philippii G. gibbosum G. japonicum Ganoderma sp.3 Ganoderma sp.3 Hình 2. Biểu đồ Dendrogram phân tích chuỗi ITS của nấm gây mục gỗ, mẫu S71. Nhóm ngoài Ganoderma weberianum và các chuỗi ITS tham khảo được tải từ Genbank và thư viện tham khảo cá nhân của trường Đại học Tasmania (các chuỗi ITS từ thể quả Ganoderma: E7587, 16722A, 167311B, 16732C, 16453C1, 16453C2, 16453C3, 16452D1 và sợi nấm gây mục gỗ: LF157, LF159, LF400, LF569). Thanh bar: biến động chuỗi tương đương với 10%. Qua hình 2 cho thấy chuỗi ITS của loài nấm gây mục gỗ của mẫu S71 nằm cùng nhóm với các chuỗi ITS của các mẫu thể quả Ganoderma và các mẫu Ganoderma khác tải từ Genbank với độ biến động chuỗi dưới 1%. Như vậy việc định loại tên nấm gây mục gỗ bằng kỹ thuật DNA rất chính xác và không phụ thuộc vào sự sinh ra bào tử của các loài nấm, một đặc điểm rất cần thiết để định loại bằng phương pháp hình thái học. Tính ứng dụng của phương pháp: Phương pháp phát hiện và xác định các loại nấm mục gỗ bằng phương pháp DNA chỉ sử dụng một lượng gỗ rất nhỏ, do vậy có thể áp dụng phương pháp này trong lấy mẫu trên cây sống, thậm trí đến tận lõi cành/cây mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây. Phương pháp này cũng cho kết quả tìm kiếm và xác định nhanh, chính xác, và hơn thế nữa, cho phép xác định nhiều loài nấm cùng hiện diện một lúc trên cùng một đơn vị diện tích. 6 IV. KẾT LUẬN Bằng phương pháp sinh học phân tử phân tích DNA của các loài nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn Eucalyptus obliqua thu thập tại bang Tasmania (Australia), đề tài đã: - Phát hiện được DNA từ 18 mẫu gỗ bạch đàn E. obliqua bị mục làm thí nghiệm bằng cặp mồi ITS1-F/ITS4. Trong đó 11 mẫu chỉ có một loài nấm và 7 mẫu có nhiều loài nấm trên cùng một mẫu. - Xác định được 33 loài nấm có mặt trên 18 mẫu gỗ bạch đàn E. obliqua bị mục, trong đó chỉ có 13 loài nấm gây mục gỗ thuộc lớp Basidiomycetes và 7 loài nấm thuộc lớp Ascomycetes. Mười ba (13) loài khác chỉ là nấm thứ sinh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Allmér, J., Vassiliauskas, R., Ihrmark, K., Stenlid, J. and Dahlberg, A. (2006) Wood-inhabiting fungal communities in woody debris of Norway spruce (Picea abies (L.) Karst.), as reflected by sporocarps, mycelial isolations and T-RFLP identification. FRMS Microbiology Ecology 55:57-67. 2. Altschul, S. F., Madden, T., Schäffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. and Lipman, D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research 25: 3389-3402. 3. ANGIS (2005) BioManager by ANGIS: Australian National Genome Information Services. 2005, http://www.angis.org.au. 4. David. P, Juliet, H., Hilary, J.R., and Lynne, B. (2005) New PCR assay detects rare tooth fungi in wood where traditional approaches fail. Mycology Research 109:1187-1194. 5. Felsenstein, J. (1989) PHYLIP – Phylogeny Inference Package (Version 3.2). Cladistics 5: 164- 166. 6. Gardes, M. and Bruns, T. D. (1993) ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes – Applification to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecology 2: 113-118. 7. Glen, M., Tommerup, I. C., Bougher, N. L. and O’Brien, P. A. (2002) Are Sebacinaceae common and widespread ectomycorrhizal associates of Eucalyptus species in Australian forests? Mycorrhiza 12: 243-247. 8. Hopkins, A. J. M. (2006) The taxonomy and ecology of wood decay fungi in Eucalyptus obliqua trees and logs in the wet sclerophyll forests of southern Tasmania. PhD thesis, University of Tasmania, Australia. 9. Jasalavich, C. A., Ostrofsky, A. and Jellison, J. (2000) Detection and identification of decay fungi in spruce wood by Restriction Fragment Length Polymorphism analysis of amplified genes encoding rRNA. Applied and Environmental Microbiology 66: 4725-4734. 10. Johannesson, H. and Stenlid, J. (1999) Molecular identification of wood inhabiting fungi in an unmanaged Picea abies forest in Sweden. Forest Ecology and Management 115: 203-211. 11. Mitchell, J. I., Roberts, P. J., and Moss, S. T. (1995) Sequence or structure? A short review on the application of nucleic acid sequence information to fungal taxonomy. The Mycologist 9: 67-75. 12. Mohammed, C. L. and Yuan, Z. Q. (2002) Report for Project No. C1990677: Ecologically Sustainable Forest Management: Fungal and Invertebrate Biodiversity. ARC SPIRT Project 1999- 2002, Hobart, Australia. 7 13. Nobles, M. K. (1948) Studies in forest pathology VI. Identification of cultures of wood-rooting fungi. Canadian Journal of Forest Research 26: 281-431. 14. Pearson, W. R. and Lipman, D. J. (1998) Improved Tools for Biological Sequence Analysis. Proceedings of the National Academy of Science, USA 85: 2444-2448. 15. Rayner, A. D. M. and Boddy, L. (1988) Fungal Decomposition of Wood: Its Biology and Ecology. John Wiley and Sons Ltd., Chichester, UK. 16. Raeder, U. and Broda, P. (1985) Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology 1: 17-20. 17. Schwarze, F. W. M. R., Engels, J. and Mattheck, C. (2000) Fungal Strategies of Wood Decay in Trees. Springer, Berlin, Germany. 18. Thompson, J. D., Higgins, D. G and Gibson, T. J. (1994) CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position- specific gap penalties and weight matrix choice. Nuc. Acids Res. 22: 4673-4680. 19. White, T. J., Bruns, T., Lee, S. and Taylor, T. (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. (eds Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J.) 315-322 pp. Academic Press, San Diego, USA. THE USE OF MOLECULAR BIOLOGY METHOD TO DETECT AND IDENTIFY WOOD DECAY FUNGI IN Eucalyptus obliqua L.Her. LOGS Tran Thanh Trang Summary Method to detect and identify wood decay fungi in Eucalyptus obliqua logs was based on DNA extracted from 26 rotted logs collected in Tasmania (Australia). rDNA was amplified by fungal- specific primer pairs ITS1-F/ITS4 on 18 samples. The single DNA band was obtained from 11 samples and the double DNA bands were obtained from 7 samples on gel. The internal transcribed spacer (ITS) region of the DNA from 11 samples was directly sequenced and the DNAs from 7 samples to which multiple fungal species were obtained were cloned. Clones were screened by PCR-RFLP and representatives of each of PCR-RFLP group were sequenced. To identify the fungi present in the rotted wood samples, sequences were compared to those from public databases (Genbank) and private databases. The DNA analysis of wood decay fungi in E. obliqua logs resulted in 15 species of Basidiomycetes, 17 species of Ascomycetes and one species of Zygomycetes. Among 33 species obtained from decayd logs, only 13 species of Basidiomycetes and 7 species of Ascomycetes were decay fungi, the remain 13 species were secondary. Key words: DNA, Eucalyptus obliqua, PCR-RFLP, wood decay fungi. 8 . kết quả nghiên cứu về phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua tại bang Tasmania. II. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP . NN và PTNT số 117-2007, trang 59-64 SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ ĐỂ PHÁT HIỆN VÀ XÁC ĐỊNH NẤM GÂY BỆNH MỤC GỖ BẠCH ĐÀN Eucalyptus obliqua L. Her. Trần Thanh Trăng Viện Khoa học. trọng. So với nấm gây bệnh mục gỗ màu nâu, nấm gây bệnh mục gỗ màu trắng phân hủy gỗ chậm hơn. Và có 7 loài thuộc lớp nấm Ascomycetes gây ra bệnh mục gỗ mềm. Nấm gây bệnh mục gỗ mềm phân hủy thành