1 Kỷ yếu Hội nghị Khoa học toàn quốc “Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản”, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 2005. 89-92. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (họ Dipterocarpaceae) dựa trên các chỉ thị phân tử Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Đức Thành* Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CNVN Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam I. Mở đầu Cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố rộng khắp trên thế giới, là một họ thực vật điển hình của rừng nhiệt đới Đông Nam á gồm 13 chi và 470 loài. Họ này có ý nghĩa lớn về kinh tế và sinh thái học. Chi Dipterocarpus là một trong 8 chi thuộc tộc Dipterocarpeae thuộc họ phụ Dipterocarpoideae, gồm 69 loài phân bố ở Srilanka, ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Bali, Boneo, Trung Quốc ở Việt Nam các loài thuộc chi Dipterocarpus gồm 14 loài phân bố ở cả hai miền Bắc và Nam. Ngoài việc cung cấp gỗ dùng trong gia dụng, chế biến ván ép, ván sàn, các loài cây họ Dầu còn cho một số sản phẩm làm sơn véc-ni, trồng làm cây cảnh trên đường phố, cây bóng mát trong công viên. Do chiến tranh phá hoại và do khai thác không hợp lý mà diện tích rừng có cây họ Dầu giảm đi đáng kể cả về diện tích và trữ lượng rừng. Có những loài chỉ còn thấy như những cá thể đơn lẻ còn xót lại (Chò nâu) ở Yên Bái, Phú Thọ, Thái Nguyên, Bắc Cạn. Bên cạnh đó có những loài không còn tìm thấy ở rừng tự nhiên mà chỉ tìm thấy ở rừng tái sinh ( Dầu song nàng). Do tính chất có chứa dầu nên những cây họ này thường mất sức nảy mầm vì vậy số lượng cây ngày càng ít. Trước thực trạng này, việc tìm hiểu đa dạng di truyền loài này rất cần thiết từ đó có phương án bảo tồn nguồn gen cây rừng . Phân loại và đánh giá mức độ đa dạng của thực vật dựa vào hình thái mất nhiều thời gian và độ chính xác hạn chế. Để khắc phục những nhược điểm đó trong những năm gần đây, chỉ thị phân tử đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền, mối quan hệ họ hàng và phân biệt các cá thể, giống, loài, trong đó họ Dầu (Dipterocarpaceae) cũng được nghiên cứu nhiều trên thế giới. Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã tìm hiểu mối quan hệ di truyền của 6 chi thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae). Trong nghiên cứu này,dựa vào chỉ thị RAPD và chỉ thị ADN lục lạp, chúng tôi đi sâu nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (Dipterocarpaceae). II. Nguyên liệu và phương pháp Mẫu lá Các mẫu lá của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus do Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp bao gồm: D.alatus Roxb Dầu rái, D. baudii Korth - Dầu bao, D.chartaceus Sym - Dầu cát, D.costatus Gaertn. - Dầu mít, D.dyeri Pierre - Dầu song nàng , D.gandiflorus Blco - Dầu đọt tím, D.intricatus Dyer- Dầu lông, D.obtusifolius Teysm - Dầu trà beng, D. tuberculatus Roxb.ssp grandifolius Craib - Dầu đồng, D. turbinatus Gaertn Dầu lá bóng, D.hasseltii Bl - Dầu Haselt, D.tonkinensis Chev Chò nâu. Hoá chất - Mồi RAPD: OPB11, OPB12, OPB15, OPC8, OPC9, OPC12, OPC20 mua từ hãng Operon, Mỹ. - Mồi lục lạp: trnD-trnT, trnH-trnK, psbC- trnS, trnM-rbcL được cung cấp bởi hãng IDT, Mỹ. - Enzim giới hạn: HaeIII, HhaI, RsaI mua từ hãng Promega, Mỹ. Tách chiết ADN ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromicle) của Saghai Maroof và cs (1994). PCR và chạy điện di Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD và mồi lục lạp được tiến hành như đã công bố. Phân tích số liệu Dùng chương trình NTSYS pc để xử lý số liệu, xây dựng biểu đồ quan hệ di truyền và tính hệ số di truyền giữa các loài cây nghiên cứu [13]. III. Kết quả và thảo luận Kết quả đa hình RAPD Trong tổng số 250 phân đoạn được tạo ra sau nhân bản các mẫu ADN của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus với 7 mồi RAPD có 194 phân đoạn cho đa hình. Số phân đoạn đa hình giao động từ 8 đến 44 tương đương với 44,44% đến 100% (Hình 1). Điều này chứng tỏ giữa các loài trong chi này có mức độ đa dạng cao, Đặc biệt trong các mồi RAPD được sử dụng có mồi OPB15 và mồi OPC9 cho tỷ lệ băng đa hình 100%. 1,5 kb 3 kb 0,5 kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1,5 kb 3 kb 0,5 kb Hình 1. Sản phẩm PCR của mồi OPC8 (A) và OPB11 (B) với ADN genome với 12 loài chi Dipterocarpus M- Marker 1kb; 1- Dầu rái, 2- Dầu bao, 3- Dầu cát, 4- Dầu song nàng, 5- Dầu lông, 6- Dầu trà beng, 7-Dầu đồng, 8- Dầu lá bóng, 9- Dầu Haselt, 10- Chò nâu, 11- Dầu đọt tím, 12- Dầu mít Xét về đa hình các loài cây thuộc chi Dipterocarpus cho thấy: tất cả các loài đều cho tỷ lệ đa hình lớn hơn 64%, trong đó loài Dầu cát cho tỷ lệ băng đa hình cao nhất (83.33%), và loài Dầu đọt tím cho tỷ lệ băng đa hình thấp nhất (64,29%). Những số liệu nhận được chứng tỏ các loài cây nghiên cứu này rất khác nhau về mặt di truyền. Kết quả phân tích AND lục lạp Kết quả PCR ADN genome của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus với 4 cặp mồi lục lạp trnD-trnT, trnH-trnK, psbC- trnS và trnM- rbcL nhận được là mỗi mồi lục lạp đều cho một băng đặc hiệu có kích thước tương ứng 1600 bp, 1750 bp, 1650bp, 2700 bp (Hình 2A). 1,6 kb 3 kb 0,5 kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 B 1,6 kb 3 kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Hình 2. Sản phẩm PCR của mồi trnD-trnT với ADN genome của 12 loài chi Dipterocarpus A- sản phẩm chưa cắt và B - sản phẩm cắt bằng enzym HaeIII M-Marker phân tử 1kb, 1- sản phẩm PCR chưa cắt; 2-Dầu rái, 3- Dầu bao, 4- Dầu cát, 5- Dầu song nàng, 6- Dầu lông, 7- Dầu trà beng, 8-Dầu đồng, 9- Dầu lá bóng, 10- Dầu Haselt, 11- Chò nâu, 12- Dầu đọt tím, 13- Dầu mít Các sản phẩm PCR được cắt với ba enzim giới hạn là HaeIII, HhaI, RsaI. Kết quả là sau khi cắt với mỗi loại enzym các sản phẩm PCR đều cho tỷ lệ đa hình thấp.Tổng số băng nhận được là 169 trong đó có 44 băng đa hình tương ứng với 26% (Hình 2B). Mức độ đa hình nhận được ở đây thấp hơn so với mức độ đa hình chúng tôi nhận được trước đây ở 17 loài thuộc 6 chi khác nhau của họ Dầu (Dipterocarceae) [3]. Kết quả nghiên cứu này cho thấy các loài trong cùng một chi có mức độ đa dạng di truyền thấp hơn so với các loài ở các chi khác nhau. Khi dùng enzym HaeIII để cắt sản phẩm của mồi psbC - trnS đã tạo ra 3 băng có kích thước 800bp, 300bp, 200bp, trong 12 loài nghiên cứu chỉ duy nhất có loài Dầu rái không có băng 300bp. Như vậy chúng ta có thể nhận biết được loài Dầu rái bằng cặp mồi psbC- trnS với việc cắt sản 2 phẩm PCR với enzym HaeIII. Ngoài ra, sản phẩm PCR với mồi trnH - trnK được cắt bằng enzym RsaI cũng tạo ra 3 băng có kích thước 400bp, 300bp, 100bp, tất cả các loài nghiên cứu đều có 3 băng trên, riêng loài Dầu mít không có băng 100bp, đây chính là điểm có thể nhận biết được loài Dầu mít. Quan hệ di truyền giữa 12 loài cây họ Dầu Dựa vào số liệu RAPD và số liệu ADN lục lạp, khoảng cách di truyền giữa các loài nghiên cứu được tính toán. Kết quả cho thấy mức độ tương đồng di truyền giao động từ 0,18 đến 0,41. Biểu đồ quan hệ di truyền (Hình 3) được xây dựng trên cơ sở các hệ số tương đồng di truyền giữa 12 loài nghiên cứu cho thấy: hai loài Dầu đọt tím và Dầu rái có quan hệ di truyền xa so với 10 loài còn lại và có hệ số tương đồng di truyền tương ứng là 0,18 và 0,21. 10 loài còn lại này phân thành hai nhóm: nhóm 1 gồm 3 loài: Dầu mít, Dầu Haselt, Dầu song nàng có mức tương đồng di truyền là 0,26. Nhóm 2 gồm 7 loài: Dầu bao, Chò nâu, Dầu cát, Dầu trà beng, Dầu lông, Dầu đồng, Dầu lá bóng có mức tương đồng di truyền là 0,27. Ngoài ra các loài trong hai nhóm trên đều có mức độ tương đồng di truyền rất khác nhau và ở mức độ thấp, chỉ riêng hai loài Dầu trà beng và Dầu cát có mức độ tương đồng di truyền cao hơn cả, tuy nhiên vẫn ở mức thấp (0,41). Những kết quả trên cho thấy 12 loài nghiên cứu có quan hệ di truyền rất xa nhau. Điều này chứng tỏ sự đa dạng di truyền cao của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus ở Việt Nam. Coefficient 0.18 0.24 0.30 0.36 0.41 DR DB CN DC TB DL DD LB SN HS DM DT Dầu rái Dầu bao Chò nâu Dầu cát Dầu Trà beng Dầu lông Dầu đồng Dầu lá bóng Dầu song nàng Dầu Haselt Dầu mít Dầu Đọt tím Hình 3. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 12 loài thuộc chi Dipterocarpus Từ những kết quả nhận được có thể đi đến các kết luận sau: 12 loài cây họ Dầu thuộc chi Dipterocarpus có mức độ đa dạng về mặt di truyền cao, hệ số di truyền giao động từ 0,18 đến 0,41. Hai loài Dầu trà beng và Dầu cát có mối quan hệ di truyền gần nhau hơn so với các loài khác trong chi, có cùng hệ số di truyền là 0,41. Hai cặp mồi pscC – trnS và trnH - trnK có thể dùng để nhận biết hai loài Dầu rái và Dầu mít bằng việc cắt sản phẩn PCR tương ứng với hai enzym HaeIII và RsaI. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999. Một số loài cây bị đe doạ ở Việt Nam. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 2. Nguyễn Đức Thành, 1999. ứng dụng và phát triển các chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội: 1205-1215. 3. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp. Hội Nghị khoa học toàn quốc, Hà Nội 2005 - Những vấn đề Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Bài đã gửi đăng. 4. Ashton, P.S.J,1982. Dipterocarparceae. In C.G.G.J. Van Steenis [ed.], Flora Malesiana, Series 1, Spermatophyta, vol.9, 237-552. Martinus Nijhoff Pulishers, The Hague. 3 4 5. Dayanandan S., Ashton P.S., Williams S.M., Primack R.B., 1999. Phylogeny of the tropical tree family Dipterocarpaceae based on nucleotide sequences of chloroplast rbcL gene. Amer. Journal of Botany, 86: 1182-1190. 6. Lee, S. L, Tani, N, K. K. S. NG and Tsumura, Y., 2004. Characterization of 15 polymophic microsatellite loci in an endangered tropical tree Hopea bilitonensis (Dipterocarpaceae) in Peninsular Malaysia. Molecular Ecology Notes 4:147-149. 7. Lee, S. L., K. C. Ang & M. Norwati., 2000. Genetic diversity of Dryobalanops Aromatica Gaertn. F (Dipterocarpaceae) in Peninsular Malaysia and its pertinence to genetic conservation and tree improvement. Forest Genetics 7 (3): 211-219. 8. Lee, S. L., Wickneswari. R, Mahani. M. C, Zakri. A. H., 2001. Comparative genetic diversity studies of Shorea Leprosula (Dipterocarpaceae) using RAPD and Allozyme markers. Journal of Tropical Forest Science 13 (1): 202-215. 9. Lee. S. L, Wickneswari. R, Mahani. M. C, Zakri. A. H., 2000. “Mating System parameters in a Tropcal Tree Species, Shorea leprosula Miq. (Dipteerocarpaceae), from Malaysian Lowland Dipterocarp Forest”. Biotropica 32(4a): 693-702. 10. Mohanty A, Martin . J. P, Aguinagalde. I., 2001. “Chloroplast DNA study in wild population and some cultivars of Prunus avuim L”., Theor. Appl. Genet., 100:112-117. 11. Nicese. F.P., Homaza JI., and Mc Granahan GH, 1998. Molecular Characterization and genetic relatedness among walnut (Juglans regia L) genotypes based on Rapd markers. Euphytica 101: 199- 206. 12. Noguchi. J, Hong D. Y , and Grant. W. F., 2004. The historical evolutionary development of Hemerocallis middendorfii (Hemerocallidaceae) revealed by non-coding regions in chloroplast DNA. Plant Syst. Evol, 247:1-22. 13. Rohlf F. J., 1993. “NTSYS-pc Numerical taxonomomy and multivariate analysis system”, Version 1.80. Applied Biostatitics, New York. 14. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W., 1994, Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 91: 5466-5470. 15. Yang. S X, Yang. J B, Lei. L G, Li. D Z, Yoshino. H, and Ikeda. T., 2004. “Reassessing the relationship between Gordonia and Polyspora (Theaceae) base on the combined analyses of molecular data from the nuclear, plastid, and itochondrial genomes”. Plant Syst. Evol. 248: 45- 55. Lời cám ơn. Công trình có sự hỗ trợ của Hội đồng Khoa học tự nhiên và đề tài “Bảo tồn nguồn gen cây rừng” của Viện KHLNVN. Các tác giả xin cảm ơn GS.TSKH Lê Xuân Tú đã đọc và góp ý cho bản thảo. Summary The study of genetic relationships between 12 tree species of Dipterocarpus (Dipterocarpaceae) base on molecular markers Nguyen Thuy Hanh, Nguyen Duc Thanh Institute of Biotechnology, VAST Nguyen Hoang Nghia Forest Science Institute of Vietnam Dipterocarpus are the plants of economic value which are distributed largely in Vietnam. After the war the tree of these species were considerablely decreased. In the present work, the genetic relationships between twelve species of Dipterocarpus were investigated using RAPD and cpDNA markers.The RAPD analyses using random amplified polymorphic primers revealed 194 polymorphic fragments from total number of 250 obtained fragments. Non - coding regions of cpDNA were amplified using chloroplast primers trnK - trnH, psc C - trnS, trnM - rbcL, trnD - trnT, and polymorphisms were subsequently generated by digestion of the PCR products with HaeIII, HhaI, RsaI. Of 169 generated fragments, 44 showed polymorphism in investigated species. Based on RAPD and cpDNA analysed data, a dendogram of genetic relationships between twelve Dipterocarpus species were constructed. The data obtained showed that the species are very divergent. In addition, using two primers pair psbC - trnS and trnH -trnK two specie D. costatus Gaertn and D. alatus Roxb could be discriminated by cleaving their PCR products with HaeIII and RsaI restricton enzyme , respectively. . nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (Dipterocarpaceae). II. Nguyên liệu và phương pháp Mẫu lá Các mẫu lá của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus do Viện Khoa học. nghị Khoa học toàn quốc “Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản”, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 2005. 89-92. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (họ. nghiên cứu trước, chúng tôi đã tìm hiểu mối quan hệ di truyền của 6 chi thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae). Trong nghiên cứu này ,dựa vào chỉ thị RAPD và chỉ thị ADN lục lạp, chúng tôi đi sâu nghiên