29 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 49, 2008 SỬ DỤNG 17α – HYDROXY - 20β -DIHYDROPROGESTERON (17,20P) VÀ PROGESTERON (P) KÍCH THÍCH SINH S ẢN CÁ CHÉP CYPRINUS CARPIO Lê Văn Dân Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế Nguyễn Tường Anh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG - HCM TÓM TẮT Đã thử nghiệm kích thích cá chép Cyprinus carpio sinh sản chỉ trong một lần tiêm bằng 17 α - hydroxy - 20 β - dihydroprogesteron (17,20P) ở liều lượng lần lượt là 1; 2; 3 và 4 mg/kg cá và Progesteron (P) ở liều lượng 10; 12,5 và 15 mg/kg cá. Kết quả thử nghiệm cho biết liều tối ưu của 17,20P là 3 và 4 mg/kg cá và liều tối ưu của P là 15 mg/kg cá. Nghiên cứu này cũng đã thảo luận về kết quả so sánh hiệu quả kích thích cá chép sinh sản bằng 17,20P; P và LRH-A 3 (thuốc đang sử dụng tại địa phương) ở liều tối ưu. I. Đặt vấn đề Trong th ực nghiệm in vitro 17α - hydroxy - 20β - dihydroprogesteron (17,20P) và Progesteron (P) được chứng minh là những steroid có hiệu quả gây rụng trứng cho nhi ều loài cá nuôi. Trong điều kiện sản xuất 17,20P được dùng một cách hiệu quả khi kích thích sinh s ản cá chép Cyprinus carpio (Jalabert và cs., 1977; Nguyễn Dương D ũng, Nguyễn Tường Anh, 2003; Nguyễn Thị Yến Linh et al., 2006). Cũng trên đối t ượng cá chép, Progesteron cũng có hiệu quả tương tự (Popov & Budarin, 1976). Tuy nhiên, t ất cả các công bố trong và ngoài nước đều cho rằng các steroid C 21 nói chung, c ụ thể là 17,20P không thể phát huy tác dụng một cách đơn độc. Phản ứng chín và r ụng trứng đầy đủ của cá cái, ngoài 17,20P cần có thêm một ít kích dục tố. Đó có th ể là dịch chiết não thùy cá chép, HCG hay một số chất kích dục tố khác. Nguyễn T ường Anh (2003) đã thử nghiệm kích thích cá chép sinh sản nhân tạo bằng liều sơ bộ v ới LRH – A 3 (5 – 6 mcg/kg + 3 – 4 mg Dom/kg) và liều quyết định với 5 mg 17,20P/kg cho k ết quả rụng trứng trên 90%. Jalabert et al., (1977) kích thích sinh sản cá chép b ằng liều sơ bộ não thùy cá chép 0,6mg/kg và liều quyết định với 2mg17,20P/kg cho k ết quả 50 – 70% cá rụng trứng. M ục đích của nghiên cứu này là thử nghiệm các loại steroid 17,20P và P để kích thích sinh s ản cá chép trong điều kiện sản xuất một cách đơn độc không sử dụng kích d ục tố. 30 II. Vật liệu và phương pháp Thí nghi ệm được tiến hành tại trại cá Đại An Khê - Quảng Trị. Cá bố mẹ được dùng trong thí nghi ệm là cá chép Cyprinus carpio được chúng tôi trực tiếp nuôi vỗ để ti ến hành nghiên cứu và được chọn theo những tiêu chí thành thục dựa vào ngoại hình bình th ường cùng với thao tác thăm trứng và vuốt sẹ. P là Progesteron (Merck – Đức), d ạng bột, được pha trong dầu ăn tinh luyện. 17,20P được chế từ 17P (17α - hydroxyprogesteron – Sigma) theo Norymberski & Woods (1955) b ằng phản ứng khử b ởi NaBH 4 . Hormon steroid 17,20P được hòa tan một phần và ở dạng huyền phù trong c ồn 95 o . Thể tích dung dịch được tiêm cho mỗi kg cá cái là 1 ml. LRH-A được sản xuất ở Trung Quốc. 17,20P và P được tiêm vào xoang thân, LRH-A được tiêm vào cơ, chỉ tiêm một l ần cho cá cái, cá đực không tiêm. Kết quả kích thích sinh sản được đánh giá theo 3 tiêu chí là: (1) đẻ róc – cá đẻ hết trứng; (2) rụng trứng - cá đẻ không róc hoặc cá rụng trứng nh ưng không đẻ và (3) cá không rụng trứng. Các thông số khác như tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ n ở, năng suất cá bột được đánh giá theo cách thông dụng trong sản xuất. III. Kết quả và thảo luận 3.1. Th ử nghiệm kích thích sinh sản cá chép bằng 17,20P 17,20P có hi ệu quả gây chín và rụng trứng trên cá hồi (Salmo gairdneri) với liều hi ệu quả 2 mg/kg (Jalabert et al., 1977), cá chép Cyprinus carpio 2 mg/kg sau liều sơ bộ 0,6 mg não thu ỳ cá /kg (Jalabert et al., 1977); cá mè vinh Barbodes gonionotus 1mg/kg và cá he vàng B. altus 2,5 mg/kg sau li ều sơ bộ bằng não thuỳ cá 0,5 mg/kg (Nguyễn T ường Anh, 2002). Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành thử nghiệm 17,20P kích thích sinh s ản cá chép Cyprinus carpio với các mức 1; 2; 3; 4 mg 17,20P /kg. Kết quả được th ể hiện qua bảng 1. Bảng 1: Kết quả thử nghiệm kích thích sinh sản cá chép bằng 17,20P Lô Cá thử nghiệm Liều (mg17,20P/kg) Kết quả sinh sản Số cá cái Tổng trọng lượng cá cái ( kg) % đẻ róc % rụng trứng % không rụng trứng 1 4 2,0 1 25 50 25 2 6 2,4 2 66,6 16,7 16,7 3 5 2,0 3 80 20 0 4 5 2,2 4 80 20 0 5 10 4,0 0 tiêm 20 30 50 Ghi chú: - Thời gian cho đẻ ngày 9/3/2007. - Nhiệt độ nước lúc cá đẻ là 25 0 C. - Tỷ lệ đực: cái = 45/30 =1,5. 31 Kết quả bảng 1 cho thấy, khi tiêm một liều duy nhất với mức 1; 2; 3; 4 mg 17,20 P/kg đều kích thích sinh sản nhân tạo cá chép nhưng ở mức 3 và 4 mg/kg cho kết quả cao, t ỷ lệ đẻ róc đạt 80%, tỷ lệ rụng trứng 20%. Ở mức 1 mg/kg 17,20P thì % tỷ lệ đẻ róc đạt 25%, tỷ lệ rụng trứng 50% là thấp nhất, điều này có thể giải thích là khi đưa vào c ơ thể cá cái 1 mg 17,20 P/kg là thấp nên chỉ gây chín và rụng những tế bào gần thành th ục. Kết quả dẫn đến sự chín của cả buồng trứng sẽ không hoàn toàn (Nguyễn Tường Anh, 2003). So sánh v ới lô đối chứng cho cá đẻ tự nhiên (không tiêm), chúng tôi thu được kết quả đẻ róc chỉ đạt 20% và rụng trứng đạt 30%. Con số này cho thấy phương pháp cho đẻ tự nhiên không sử dụng chất kích thích không đạt yêu cầu của sản xuất. Tuy nhiên, trong nghiên c ứu này, chúng tôi, kích thích sinh sản cá chép bằng 17,20P chỉ trong m ột lần tiêm vẫn cho kết quả cao, ở mức 3 mg; 4 mg 17,20 P/kg. Kết quả này có ý ngh ĩa quan trọng trong thực tiễn cũng như trong khoa học, nó làm tăng khả năng chín đồng loạt của trứng cá chép dưới tác dụng của 17,20P, mặt khác giảm stress cho cá, gi ảm giá thành sản xuất, nâng cao hiệu quả kinh tế cho các trại sản xuất giống cá. Theo k ết quả nghiên cứu gần đây của chúng tôi, khi sử dụng 17,20P kích thích sinh sản cá tr ắm cỏ Ctenopharyngodon idellus và cá trôi Ấn Độ Labeo Rohita cần phải tiêm liều kh ởi động cụ thể là 13,3 mcgLRH-A 3 /kg cá cái (Lê Văn Dân, Nguyễn Tường Anh, Võ V ăn Phú, 2007). Điều này cho thấy cách sử dụng 17,20P để kích thích sinh sản các loài cá khác nhau thì khác nhau, có th ể những loài cá có khả năng đẻ tự nhiên trong ao chỉ c ần tiêm 17,20P. Tuy nhiên, để có kết luận chính xác cần phải nghiên cứu trên nhiều loài cá, đặc biệt là những loài cá bản địa. 3.2. Thử nghiệm kích thích sinh sản cá chép bằng Progresteron Progesteron được coi là chất hình thành trong nang trứng dưới tác dụng của kích d ục tố và gây ra sự chín noãn bào. Những công trình sử dụng Progesteron để kích thích sinh s ản cá đã được nghiên cứu từ rất lâu, trước hết là thử nghiệm trên cá chạch Misgurnus fossilis (Kirshenblat, 1952), cá đối Crenimugil labrosus (Cassifour, Chambolle, 1975), cá chép (Popov & Budarin, 1976), cá trê phi Clairas gariepinus (Nguyễn Tường Anh, 1981) và cá bống tượng Oxyeleotris marmoratus (Nguyễn Tường Anh, 1985). V ới cách thức tiêm và liều lượng thuốc cũng khác nhau tuỳ theo loài cá: cá chép tiêm d ạng dung dịch dầu, tiêm xoang với liều hiệu qủa 7,5 - 16,25 mg P/kg; cá trê phi tiêm vào bu ồng trứng liều 15 – 25 mg P/kg; cá chạch tiêm vào cơ với liều 25 mg/kg; cá b ống tượng tiêm vào xoang với liều 40 mg P/kg; cá đối tiêm vào xoang với liều hiệu q ủa 20 x 6 ngày. Dựa trên cơ sở đó, liều Progesteron mà chúng tôi thăm dò ở cá chép là 10; 12,5 và 15 mg P/kg và tiêm m ột lần duy nhất như ở thí nghiệm 1. Kết quả bảng 2 cho thấy, khi tiêm một liều duy nhất với mức 10, 12,5 và 15 mg P/kg đã cho tỷ lệ đẻ róc lần lượt là 25, 50 và 70%. Tỷ lệ rụng trứng ở liều 15 mg/kg là r ất cao 100%, trong khi đó ở liều 10 mg; 12,5 mg/kg tỷ lệ rụng trứng là 66,6% và 75%. Lô đối chứng cho cá đẻ tự nhiên trong bể đẻ có nước chảy, tỷ lệ rụng trứng chỉ đạt 40%. 32 Bảng 2: Kết quả thử nghiệm kích thích sinh sản cá chép bằng Progresteron Lô Cá thử nghiệm Liều (mg/kg) Kết quả sinh sản Số cá cái Tổng trọng lượng cá cái (kg) % đẻ róc % rụng trứng % không rụng trứng 1 12 3,6 10,0 25,0 41,6 33,4 2 8 3,0 12,5 50,0 25,0 25,0 3 10 2,2 15,0 70,0 30,0 0 4 10 4,0 0 tiêm 20,0 20,0 60,0 Ghi chú: - Thời gian cho đẻ 3/3/2007. - Nhiệt độ nước lúc cá đẻ là 29 0 C. - Tỷ lệ đực: cái = 52/35 ≈ 3/2. So với lô đối chứng thì thực tế bằng cách chuNn bị các điều kiện cho cá đẻ gần giống với điều kiện tự nhiên cá vẫn đẻ, nhưng sự biến động v ề hàm lượng các hormon trong thời gian sinh sản của cá đực phụ thuộc vào sự có hay không hành động đẻ trứng của cá cái đã được thả chung với chúng (Hukutuna M. M., 1983). Hay nói cách khác là s ự hiện diện của steroid sinh dục trong cơ thể cá cái có đủ để gây ra sự chín và rụng trứng hay không? Do vậy, đẻ tự nhiên thường đem lại tỷ lệ r ụng trứng thấp và không ổn định do phụ thuộc nhiều vào yếu tố bên ngoài và sự thành th ục của đàn cá. K ết quả thử nghiệm kích thích sinh sản cá chép cái bằng một lần tiêm duy nhất thành công có ý ngh ĩa quan trọng trong thực tiễn sản xuất cũng như trong khoa học. M ột lần nữa khẳng định vai trò của steroid làm tăng khả năng chín và thành thục của tr ứng cá chép. Mặt khác, P có rất nhiều ưu điểm như dễ bảo quản, dễ sử dụng, giá thành th ấp. Tính đến thời điểm hiện tại chi phí P để kích thích 1kg cá cái sinh sản chỉ bằng ½ so v ới LRH-A của Trung Quốc. Cũng tương tự như 17,20P khi sử dụng P để kích thích sinh s ản cá trắm và cá trôi Ấn Độ, cũng cần phải có liều khởi động. 3.3. So sánh kết quả kích thích sinh sản cá chép bằng 17,20P; P và LRH-A 3 D ựa trên những kết quả của thí nghiệm thăm dò, chúng tôi sử dụng liều 3 mg 17,20 P/kg (lô A), 15 mgP/kg (lô B) và li ều 20 mcg LRH-A 3 /kg (lô ĐC) cho cá chép cái. K ết quả được thể hiện qua bảng 3. K ết quả bảng 3 cho thấy, tỷ lệ đẻ róc của cá khi sử dụng LRH –A 3 (chất kích thích đang sử dụng tại địa phương) là cao nhất, tiếp đến là 17,20P và sau cùng là P. Tuy nhiên, t ỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở khi sử dụng 17,20P và P là cao hơn nhiều khi sử dụng LRH-A 3 (p<0,05). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của nhóm Dettlaf, Skoblina và Davydova (1969,1979). Các tác gi ả này đã chứng minh được rằng khả năng phản ứng c ủa noãn bào đối với Progesteron để chín xuất hiện sớm hơn và được duy trì lâu dài hơn kh ả năng phản ứng của nang trứng đối với kích dục tố gây chín noãn bào. Có nghĩa là P; 17,20P (ch ất gây chín mạnh nhất đối với cá xương) mở rộng mùa vụ sản xuất, giảm mức 33 độ nghiêm ngặt khi chọn những noãn bào có khả năng chín hay những cá cái thành thục được chọn theo ngoại hình cho sinh sản nhân tạo. Bảng 3: So sánh kết quả kích thích sinh sản cá chép bằng 17,20P; P và LRH-A 3 Ghi chú: Thí nghiệm vào các ngày 16, 17, 18 tháng 4 năm 2007; Cá cái chỉ tiêm một liều, cá đực không tiêm, tỷ lệ đực: cái gần 3/2; Nhiệt độ nước giữ cá 28-29 0 C. IV. K ết luận Th ử nghiệm kích thích cá chép sinh sản bằng 17,20P và P chỉ trong một lần tiêm đều cho kết quả tốt, trong đó 17,20P có hiệu quả kích thích cao nhất ở liều 3 mg; 4 mg/kg và P là ở liều 15 mg/kg. K ết quả so sánh việc kích thích sinh sản cá bằng P ở liều 15 mg/kg; 17,20P ở li ều 3 mg/kg với chất kích thích hiện đang sử dụng tại địa phương (LRH-A 3 ở liều 20 mcg/kg) cho k ết quả tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở và năng suất cá bột cao hơn. TÀI LỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Tường Anh. Kích thích cá đẻ bằng Progesteron. Báo Khoa học Phổ thông (1981), số 136. 2. Nguyễn Tường Anh. Một số vấn đề về Nội tiết học sinh sản cá. NXB Nông Nghiệp, (1999), 72-96. 3. Nguyễn Tường Anh, Phan Văn Kỳ. Dùng 17 α , 20 β -dihydroxy-4-pregnen-3-one kích thích cá Mè Vinh và He vàng đẻ. Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học và công nghệ trong nuôi trồng Thủy sản. Vũng Tàu, (2004), 22-23/12/2004. 4. Nguyễn Tường Anh, Nguyễn Thị Ngọc Duyên, Nguyễn Hà Thanh Phong. Kích thích cá Tra và cá Hú đẻ: Dùng 17 α , 20 β – dihydroxy-4 –pregnen-3-one trong liều quyết định. Tuyển tập Nghề cá Sông Cửu long. NXB Nông Nghiệp, (2005), 378-384. 5. Lê Văn Dân, Nguyễn Tường Anh, Võ Văn Phú. Kích thích chín và rụng trứng bằng 17 α , 20 β -dihydroxy-4-pregnen-3-one trong liều quyết định của cá Trắm cỏ Lô Cá thí nghiệm Liều tiêm Kết quả sinh sản Kết quả ấp Số con Tổng trọng lượng kg % đẻ róc % rụng trứng % không rụng trứng % thụ tinh % nở Năng suất cá bột, vạn/kg A 21 7 3mg17,20 P/kg 66,7 23,8 9,5 84,3 ± 6,95 78,2 ± 3,96 5,34 B 21 7,9 15mgP/kg 61,9 23,8 14,3 83,9 ± 1,23 79,6 ± 2,69 5,21 ĐC 42 15,3 20mcg/kg 69,1 16,6 14,3 69,9 ± 3,58 64,0 ± 1,71 4,78 34 (Ctenopharygodon idellus Valenciennes, 1884).Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Số 99, (2007), 36-39. 6. Lê Văn Dân, Nguyễn Tường Anh, Võ Văn Phú. Tác dụng của Progestero (P),17 α ,20 β - dihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20P) và desoxycorticosteron acetat (DOCA) lên sự chín và rụng trứng in vivo của cá trôi Ấn Độ (Labeo rohita). Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ - ĐHQG_HCM. Số 4, (2007), 67-74. 7. Nguyễn Dương Dũng, Nguyễn Tường Anh. Kích thích cá chép sinh sản bằng 17 α - hydroxy-20 β -dihydroprogesteron sau liều sơ bộ bằng LHRH-A. Tuyển tập Báo cáo Khoa học về Nuôi trồng Thuỷ sản tại Hội nghị Khoa học Toàn quốc lần thứ 2 (24- 25/11/2003) NXB Nông nghiệp, (2003), 262-265. 8. Dettlaff T A and Davydova S I. Differential Sensitivity of cells of follicular Epithelium and Oocytes in the Stellate Sturgeon to Unfarorable Conditions, and correlating Influence of Triiodothyronine. Gen & Comp. Endocrinol. 39, (1979), 236-243 9. Nagahama Y,. 17 α ,20 β -Dihydroxy-4-pregnen-3-one, a maturation – inducing hormone in fish oocytes: Mechanisms of synthesis and action. Steroids 62, (1997), 190-196. USING 17 α – HYDROXY - 20β DIHYDROPROGESTERON (17,20P) AND PROGESTERON (P) TO INDUCE REPRODUCTION OF COMMON CARP, CYPRINUS CARPIO Le Van Dan College of Agriculture and Forestry, Hue University Nguyen Tuong Anh University of Sciences, National University Ho Chi Minh city SUMMARY The experiment used 17α-hydroxy-20β dihydroprogesteron (17,20P) with 1, 2, 3, 4 mg/kg doses and Progesteron (P) with 10, 12,5 and 15 mg/kg doses in only one injection to induce the oocyte maturation and ovulation of common carp Cyprinus carpio. Results from the experiment showed that optimal doses of P and 17,20P were 15, and 3, 4 mg/kg respectively. Comparative results of effectiveness of 17,20P; P and LRH-A 3 (using popularly in locaties) in optimal doses on common carp’s reproduction were discussed in the research. . 29 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 49, 2008 SỬ DỤNG 17α – HYDROXY - 20β -DIHYDROPROGESTERON (17,20P) VÀ PROGESTERON (P) KÍCH THÍCH SINH S ẢN CÁ CHÉP CYPRINUS CARPIO Lê Văn. Tường Anh. Kích thích cá chép sinh sản bằng 17 α - hydroxy- 20 β -dihydroprogesteron sau liều sơ bộ bằng LHRH-A. Tuyển tập Báo cáo Khoa học về Nuôi trồng Thuỷ sản tại Hội nghị Khoa học Toàn quốc. 20 β -dihydroxy-4-pregnen-3-one kích thích cá Mè Vinh và He vàng đẻ. Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học và công nghệ trong nuôi trồng Thủy sản. Vũng Tàu, (2004), 2 2-2 3/12/2004.