49 XÁC ĐỊNH TÝP EBV TRONG TỔ CHỨC SINH THIẾT VÒM CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG BẰNG KỸ THUẬT PCR Phan Thị Minh Phương Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế I. ĐẶT VẤN ĐỀ Epstein-Barr Virus (EBV) thuộc nhóm Lymphocryptovirus, liên quan mật thiết với họ gamma herpesvirus ở người. EBV được biết là tác nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và liên quan chặt chẽ với một số bệnh lý ác tính ở người như: u lympho Burkitt (BL), ung thư vòm mũi họng [7], [10], [12], [14]. Theo tổ chức nghiên cứu ung thư Quốc tế (IARC-1993) thì ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là bệnh phổ biến ở miền Nam Trung Quốc, Đông Nam Á và là 1 trong 8 loại ung thư hay gặp [1], [6],[8],[13]. Việt Nam là nước có tỉ lệ mắc bệnh trung bình song điều đáng quan tâm là UTVMH đứng hàng đầu các ung thư vùng đầu, cổ và đứng hàng thứ năm trong các loại ung thư chủ yếu gặp ở nam 50 giới [1], [4]. Hơn thế nữa bệnh có đặc điểm là các biểu hiện lâm sàng thường là “mượn”, dễ chẩn đoán nhầm, trên 95% bệnh nhân được phát hiện đã ở giai đoạn III và IV [2],[4]. Nhiều nghiên cứu về UTVMH cho thấy bệnh là do sự phối hợp giữa yếu tố di truyền (HLA) và yếu tố môi trường, trong đó nhiễm EBV là quan trọng nhất. Hàng loạt dấu ấn EBV được phát hiện thông qua các kháng thể (KT) kháng các kháng nguyên (KN) của EBV như IgA/VCA, IgA/EA, IgG/VCA trong huyết thanh bệnh nhân UTVMH. Tiếp đó, DNA- EBV cũng như các gien, sản phẩm gien của EBV cũng được tìm thấy trong huyết thanh, trong tổ chức sinh thiết vòm họng, trong dịch tiết đường mũi họng của bệnh nhân UTVMH [1],[3],[4],[9],[11] càng khẳng định vai trò của EBV trong bệnh sinh UTVMH. Nhằm mục đích xác định tỷ lệ và phân bố của týp EBV trong UTVMH của người Việt Nam và góp phần tìm hiểu mối liên quan giữa các týp EBV với UTVMH giúp quản lý và theo dõi bệnh. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành xác định týp EBV trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH thể không biệt hóa, thể hay gặp nhất ở Việt Nam (trên 80%)[4]. 51 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng - Nhóm nghiên cứu: 91 mẫu sinh thiết vòm họng hoặc khối paraffin của bệnh nhân UTVMH thể không biệt hóa (đã xác chẩn mô bệnh học) ở miền Bắc và miền Trung. - Nhóm chứng: 32 mẫu sinh thiết tươi hoặc khối paraffin của bệnh nhân ung thư vùng đầu, cổ khác không phải UTVMH (có xác chẩn mô bệnh học). 2. Phương pháp nghiên cứu - Tách DNA: + Tổ chức sinh thiết tươi vòm họng của bệnh nhân UTVMH thể không biệt hóa và ung thư vùng đầu, cổ khác được chiết tách DNA theo quy trình Rapid prep micro genomic DNA isolation kits. + Tổ chức sinh thiết trong khối paraffin chiết tách DNA theo quy trình của Choon Kook Sam 1995, có bổ sung. + Hoá chất của Amersham Pharmacia Biotech. 52 - Tiến hành PCR cho DNA thu được sau chiết tách. PCR được tiến hành theo nguyên lý của KaryMullis (1986) với các cặp mồi đặc hiệu cho gien EBNA - 2A và EBNA - 2B, trình tự mồi: Gien EBV Kích thước sản phẩm Vị Trí Trình tự mồi EBNA 2A- 5’ (B95-8) 115 bp 49213 - 49232 AACTTCAACCCACACCA TCA EBNA-2A-3’ 49309 - 49328 TTCTGGACTATCTGGAT CAT EBNA-2B-5’ (AG876) 119 bp 2060 - 2079 TACTCTTCCTCAACCCA GAA EBNA-2B-3’ 2160 - 2179 GGTGGTAGACTTAGTTG ATG Điều kiện chu kỳ nhiệt để làm phản ứng PCR: + 94 0 C/90 giây 53 + 94 0 C/1 phút + 55 0 C/2 phút 25 chu kỳ + 72 0 C/1 phút + 72 0 C/10 phút + 4 0 C Hóa chất cần thiết của hãng Perkin - Elmer 54 III. KẾT QUẢ Bảng 1: Tỷ lệ phát hiện DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH Vùng n DNA - EBV % p Miền Bắc 61 56 91, 8 Miền Trung 30 27 90, 0 >0,05 Tổng số 91 83 91, 2 Bảng 2: Tỷ lệ phát hiện DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B trong tổ chức sinh thiết bệnh nhân ung thư đầu, cổ khác Vùng n DNA - EBV % p Miền Bắc 14 4 28,56 >0,05 55 Miền Trung 18 2 11,11 Tổng số 32 6 18,75 76,9% 11% 3,3% 12,5% 6,25% 0 20 40 60 80 % UTVMH UT §Çu, cæ kh¸c Týp 1 Týp 2 Týp 1 & 2 0% Biểu đồ 1: Tỷ lệ phát hiện các týp của EBV trong UTVMH và ung thư đầu, cổ khác. 56 IV. BÀN LUẬN EBV là loại gamma Herpesvirus, được Epstein và Barr phát hiện từ năm 1964, kể từ đó EBV không ngừng được nghiên cứu. Cho đến nay, EBV được phân thành 2 týp: týp 1 (týp A), týp 2 (týp B) dựa trên sự khác biệt về trình tự nucleotide của các gien mã cho các kháng nguyên nhân của nó (EBNA- 2,3,4&6)[5]. Nhiều công trình nghiên cứu về EBV đã nhận định rằng EBV là loại virus ái tế bào biểu mô và lympho bào B. Người ta thấy rằng EBV lây truyền chủ yếu qua nước bọt, sau đó xâm nhập vào các tế bào lympho B, tế bào biểu mô vòm họng, liên bào tuyến nước bọt trực tiếp qua thụ thể CD21 và gián tiếp qua lgA nhờ các phân tử gp350/250 của EBV. Tại các tế bào này, virus được lưu trữ, sao chép đồng thời thiết lập một quá trình nhiễm tiềm ẩn. Như vậy, tế bào biểu mô vòm họng là nơi lưu giữ virus ở khu vực vòm họng. Sự nhiễm EBV ở tế bào biểu mô thường dai dẳng, còn số lượng tế bào lympho B nhiễm EBV tiềm ẩn trong máu ngoại vi thường thấp (ít hơn 0,001%). Số lượng thấp của tế bào lympho B nhiễm EBV tiềm ẩn được quy là do hoạt động của tế bào lympho T độc (Tc) đối với EBV, hoạt động này xuất hiện sau nhiễm EBV tiên phát. Chính vì vậy, trong đề tài này chúng tôi chọn mẫu bệnh phẩm là tổ chức sinh thiết vòm họng chứ không chọn mẫu là máu hay huyết thanh của bệnh nhân UTVMH (mặc dù mẫu máu hay huyết thanh dễ thu thập hơn) để khả năng phát hiện EBV cao. Kết quả bảng 1 cho thấy 91,8% trường hợp ở miền Bắc phát hiện có DNA-EBV trong tổ chức sinh thiết vòm họng và ở miền Trung là 90,0% trường hợp không có sự khác biệt về tỷ lệ phát hiện DNA-EBV giữa hai vùng (p> 0,05). Kết quả của chúng tôi có hơi thấp hơn một ít so với kết quả của một số tác giả trong và ngoài nước khác là do các tác giả khác sau PCR đã sử dụng thêm những kỹ thuật đặc biệt hơn để phân tích. Ví dụ, tác giả Uraiwan Kositanont [14] và 57 Choon - Kook - Sam [5] sau PCR, sản phẩm khuếch đại thay vì được đọc trực tiếp trên gel agarose thì được tiếp tục lai southern blot giúp cho việc phát hiện tốt hơn, nên kết quả của họ đạt đến 94,1% và 96,0%. Nghiêm Đức Thuận [4] của Việt Nam, sản phẩm PCR tiếp tục được lai dot blot làm cho số lượng acid nucleic được tăng cường nên càng dễ dàng phát hiện và vì thế mà tỷ lệ có DNA-EBV trong mẫu sinh thiết vòm họng rất cao 98,1% và 95,7%. Hoặc các tác giả Kantakamalakul W. của Thái Lan, Peh S. C của Malaysia [12] thì sử dụng kỹ thuật PCR lồng (nested - PCR) thay vì PCR đơn thuần. Độ nhạy của PCR lồng rất cao do sản phẩm PCR được tiếp tục khuếch đại lại một lần nữa, vì thế kết quả đạt được ở mức cao nhất là 96,5% và 100%. Bảng 2 cho thấy trong tổng số 32 mẫu ung thư đầu, cổ khác chỉ phát hiện được 6 mẫu có chứa DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B, chiếm tỷ lệ 18,75%. Phân tích giữa 2 vùng (miền Bắc và miền Trung) cho thấy tỷ lệ phát hiện DNA- EBV ở miền Bắc cao hơn (28,56%) so với miền Trung (11,11%) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Tỷ lệ chênh lệch giữa hai vùng có thể quy cho số mẫu được thu thập. Kết quả của chúng tôi (18,75%) cũng tương đối phù hợp so với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác nghĩa là tỷ lệ phát hiện DNA-EBV trên đối tượng chứng thấp hơn nhiều so với bệnh nhân UTVMH. Tuy nhiên, những con số cụ thể có thể hơi khác nhau tùy thuộc vào số lượng nghiên cứu, chất liệu nghiên cứu, kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu và cũng không loại trừ tính chất của dân tộc nghiên cứu. Như vậy, tỷ lệ phát hiện cao (91,2%) DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH và tỷ lệ thấp (18,75%) 58 DNA-EBV trong các ung thư đầu, cổ khác. Nghiên cứu của chúng tôi hoàn toàn phù hợp với những khẳng định trước đây rằng UTVMH có liên quan chặt chẽ với EBV. Liên quan của EBV với UTVMH nói riêng và với các bệnh lý ác tính nói chung đã đặt ra câu hỏi rằng: có những dưới nhóm khác nhau của EBV có thể liên quan đến các bệnh lý này hay không? Và câu trả lời được khẳng định qua biểu đồ về tỷ lệ phát hiện các týp của EBV. Biểu đồ trên cho thấy sự vượt trội của týp 1 trong UTVMH (76,9%) so với týp 2(11%), týp 1&2(3,3%) cũng như so với nhóm ung thư đầu cổ khác (12,5%). Kết quả này của chúng tôi là hoàn toàn tương tự với các nghiên cứu của các tác giả khác. Theo Uraiwan K. và cs [14] phân tích 34 mẫu sinh thiết UTVMH với cặp mồi EBNA - 2A, -2B phát hiện 82,3 % là týp 1, 5,9% týp 2 và 5,9% cả týp 1&2. Tác giả Janse van Rensburg E. và cs [7] nghiên cứu trên 15 bệnh nhân UTVMH ở Nam Phi cho thấy 14/15 trường hợp tế bào có EBV týp 1, chỉ có 1 trường hợp có cả týp 1&2. Nghiên cứu tại Malaysia, Choon Kook Sam và cs [5] cũng thấy EBV týp 1 gặp ở 72% số mẫu sinh thiết và dịch tiết đường mũi họng bệnh nhân UTVMH. Peh SC. và cs [12] thấy EBV týp 1 trong tất cả 38 trường hợp u lympho và 14 trường hợp UTVMH được nghiên cứu (100%). Từ kết quả trên có thể nói rằng EBV týp 1 là týp chiếm ưu thế trong UTVMH thể không biệt hóa người Việt Nam. Như vậy, phát hiện chủ yếu của đề tài chúng tôi là sự nổi trội của EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH so với một tỷ lệ thấp trong tổ chức tương ứng của nhóm chứng bệnh nhân ung thư đầu, cổ khác (76,9% so với 12,5%); sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,0001. Mức độ cao của sự biểu lộ EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH cho thấy mối liên quan giữa EBV týp 1 với tế bào u trong sinh thiết UTVMH. [...]... 91,2%, ở bệnh nhân ung thư vùng đầu, cổ khác là 18,75% - EBV týp 1 chiếm ưu thế với tỷ lệ 76,9% trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH, tỷ lệ EBV týp 2 là 11,0% và EBV týp 1&2 là 3,3% - Tỷ lệ EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết của bệnh nhân ung thư đầu, cổ khác là 12,5%, týp 2 là 6,25% Không phát hiện nhiễm phối hợp EBV týp 1&2 trong những trường hợp này TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Phạm Hoàng...Việc xác định týp 1 của EBV là týp chiếm ưu thế trong UTVMH cùng với sự hiểu biết về đặc tính sinh học của EBV týp 1 sẽ tạo một cơ sở khoa học cho việc thiết kế vacxin phòng EBV Đồng thời cần khảo sát các biến thể của týp 1 trong chủng EBV ở Việt Nam để có thể thiết kế vacxin hiệu quả V KẾT LUẬN - Với cặp mồi EBNA-2A,-2B tỷ lệ phát hiện DNA -EBV ở bệnh nhân UTVMH là 91,2%, ở bệnh nhân ung thư vùng... cs Tần suất và sự đột biến mất đoạn gen LMP1 ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng, Tóm tắt báo cáo khoa học Hội nghị miễn dịch toàn quốc (2003) 37 - 38 4 Nghiêm Đức Thuận Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học và hoạt tính gen virut Epstein - Barr trong ung thư vòm mũi họng, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y 5 Choon Kook Sam et al A special type of EBV associated with nasopharyngeal carcinoma Asian... Hoài Nga, Trần Hồng Trường và cs Tình hình bệnh ung thư ở Hà Nội giai đoạn 1996-1999 Tạp chí Y học thực hành, Chuyên đề Ung thư học (431) (2000) 4 - 7 59 2 Nguyễn Thị Bích Hà Nghiên cứu giá trị chẩn đoán và tiên lượng ung thư vòm mũi họng bằng kỹ thuật đặc hiệu lgA kháng VCA và EA của EBV và tế bào diệt tụ nhiên trong máu ngoại vi, Luận án Tiến sỹ Y học, Học Viện Quân Y (1995) 3 Phạm Thị Nguyệt Hằng,... Uraiwan Kositanont et al Detection of EBV - DNA and HHV - 6 DNA in tissue biopsies from patients with nasopharyngeal carcinoma by PCR Southeast Asian J Trop Med Public (24) (1993) 455 - 460 61 TYPING EBV IN NASOPHARYNGEAL TISSUES OF PATINETS WITH NASOPHARYNGEAL CARCINOMA (NPC) BY PCR Phan Thi Minh Phuong College of Medicine, Hue University SUMMARY In this study, the EBV types in nasopharyngeal tissues... washing from patients with head and 60 neck tumors in Taiwan, Journal of Clinical Miccrobiology, Vol.32, No.1 (1994) 28 - 31 9 Hu L.F Nasopharyngeal carcinoma and EBV PhD thesis MTC (1996) 10 Kunimoto M., Tamura S et al One-step typing of EBV by PCR: Predominance of type 1 virus in Japan, J.Gen Virol, 73 (1992) 455 461 11 Katsuyuki Aozasa, Masahiko O et al Epstein - Barr virus - and malignant lymphoma,... (undifferentiated carcinoma nasopharyngeal type) from North and Central Vietnam and 32 controls with other head and neck tumors were determined by PCR with primers EBNA-2A, EBNA-2B (from genome of EBV strains B95- 8 and AG - 876) The results showed that: 1.DNA - EBV was detected in 91.2% patients with NPC and 18.75% patients with other head and neck tumors 2 In patients with NPC: 76.9% were positive cases... 1: 11% were positive cases of type 2and 3.3 % positive of both types 62 3 12.5% cases were of type 1 and 6.25 cases were of type 2 with other head and neck tumors The results indicated that type 1 of EBV is predominant in patients with NPC (UCNT) from North and Central Vietnam 63 . 49 XÁC ĐỊNH TÝP EBV TRONG TỔ CHỨC SINH THIẾT VÒM CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG BẰNG KỸ THUẬT PCR Phan Thị Minh Phương Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế I. ĐẶT VẤN. cao của sự biểu lộ EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH cho thấy mối liên quan giữa EBV týp 1 với tế bào u trong sinh thiết UTVMH. 59 Việc xác định týp 1 của EBV. - EBV týp 1 chiếm ưu thế với tỷ lệ 76,9% trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH, tỷ lệ EBV týp 2 là 11,0% và EBV týp 1&2 là 3,3%. - Tỷ lệ EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết