Đang tải... (xem toàn văn)
Nuôi cấy tế bào và tái tạo mô sẹo từ huyền phủ tế bào cây thông đỏ himalaya
Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007 243 NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ TÁI TẠO MÔ SẸO TỪ HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY THÔNG ĐỎ HYMALAYA (THÔNG ĐỎ LÂM ĐỒNG) (Taxus wallichiana Zucc.) Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn Khiêm, Phan Xuân Huyên Phân viện sinh học tại Đà lạt TÓM TẮT Thông đỏ Taxus wallichiana là loài cây trong vỏ có chứa nhiều Taxol, được dùng để chữa ung thư buồng trứng và ung thư vú. Đây cũng là loài thực vật rất khó nuôi trồng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết lập điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo T. wallichiana. Điều kiện tốt để khởi tạo huyền phù tế bào là môi trường B5 cơ bản có bổ sung 20% nước dừa tươi, 60 g/L sucrose, 4 mg/L 2,4-D và 1mg/L kinetin. Tuy nhiên, môi trường này không thích hợp cho sự tăng trưởng mô sẹo. Tế bào nuôi cấy tăng trưởng tốt trong 24 ngày khảo sát, trong đó tám ngày đầu là giai đoạn phát triển chậm (phase lag). Chúng tôi thu tế bào từ huyền phù nuôi cấy vào nhiều thời điểm và trải lên các môi trường thạch khác nhau để khảo sát sự hình thành mô sẹo. Mô sẹo tái tạo tốt nhất là từ huyền phù 25 ngày trải lên môi trường thạch B5 cơ bản có bổ sung 4 mg/L 2,4-D, 1 mg/L kinetin, 20 g/L sucrose và nuôi cấy trong điều kiện tối. Tế bào và mô sẹo thu được từ nghiên cứu này là nguyên liệu cho nuôi cấy trên quy mô lớn, đồng thời phục vụ việc tách chiết và định lượng taxoid. Từ khóa: Mô sẹo, huyền phù tế bào, Taxol, Taxus wallichiana Zucc. TỔNG QUAN Thông đỏ (Taxus) là một chi gồm nhiều loài phân bố ở các vùng ôn đới của bắc bán cầu. Trong những thập niên gần đây, thông đỏ được coi là một nguồn dược liệu quan trọng sau việc khám phá một hợp chất diterpene amide chống ung thư mới với tên thương mại là “Taxol” từ vỏ cây thông đỏ Thái Bình Dương (Taxus brevifolia) (Wani et al., 1971; Edgington 1991). Hợp chất này còn được gọi là paclitaxel, hay tên đầy đủ theo IUPAC (Liên đoàn hóa học thuần túy và ứng dụng quốc tế) là 5-α-20- epoxy-1,2-α-4,7-β-10-β-13-α-hexahydroxytax-11- en-9-one-4,10-diacetate-2-benzoate-13-ester. Taxol đã được Cục quản lý thực phẩm & dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chứng nhận khả năng chữa ung thư buồng trứng và ung thư vú; ngoài ra, hợp chất này còn có khả năng chống các khối u ác tính, ung thư phổi và một số dạng khối u rắn khác (Wickremesinhe và Arteca, 1993, 1994). Taxol cũng đã được tách chiết từ nhiều bộ phận của nhiều loài thông đỏ khác nhau bao gồm hạt phấn, hạt, lá, thân non, thân gỗ, vỏ và rễ (Wani et al., 1971; Witherup et al., 1990; Vidensek et al., 1990; Fett-Neto et al., 1992; Wickremesinhe và Arteca, 1994). Nguồn cung cấp Taxol cho nhu cầu chữa trị phụ thuộc phần lớn vào cây thông đỏ, gần 7 tấn vỏ cây mới sản xuất được 1 kg Taxol (Cragg et al., 1993). Vì thông đỏ tăng trưởng rất chập và thời gian ngủ của hạt kéo dài từ 1,5 đến 2 năm (Steinfeld, 1992) nên việc tìm kiếm các nguồn nguyên liệu để tách chiết Taxol khác ngoài vỏ cây là điều rất cần thiết. Nuôi cấy mô Taxus spp. được coi như một cách tiếp cận rất khả quan trong việc cung cấp nguồn nguyên liệu quý này vì nó có thể tạo ra một lượng lớn cây trong thời gian ngắn ở điều kiện có thể kiểm soát được. Tuleke (1959) là một trong những nhà khoa học tiên phong trong nuôi cấy in vitro giao tử thể và hạt phấn Taxus mặc dù con người vẫn chưa biết đến Taxol vào thời điểm đó. Nhiều nghiên cứu vi nhân giống Taxus spp. khác đã được thực hiện rộng rãi như các nghiên cứu sự nảy mầm của phôi T. baccata, đặc biệt chú trọng đến việc khảo sát sự ngủ của hạt (Lepage-Degivry, 1973; Lepage-Degivry và Garello, 1973), các phương pháp nuôi cấy phôi để giảm thời gian ngủ của hạt T. brevifolia (Flores và Sgrignoli, 1991; Chee, 1994), và phương pháp nuôi cấy đoạn cắt thân để tạo cây con T. brevifolia (Eccher, 1988; Chee 1994). Đã có nhiều báo cáo về các phương pháp sản xuất Taxol từ mô Taxus spp. trong nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào (Fett-Neto et al., 1992; Wickremesinhe và Arteca, 1994). Để tăng hàm lượng các hợp chất thứ cấp, các nhà khoa học cũng nghiên cứu việc bổ sung các hợp chất kích thích (elicitor) (Christen et al., 1991; Zhong et al., 1995) hay các tiền chất của paclitaxel như kalium acetate, mevalonolactone, glucose, leucine và phenylalanine (Strobel et al., 1992; Fett-Neto et al., 1994; Shuler et Duong Tan Nhut et al. 244 al., 1994) vào môi trường. Phương pháp nuôi cấy lỏng đã cho thấy nhiều ưu thế vượt trội trong việc thu nhận tế bào so với phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch truyền thống vì nó cho phép việc tối ưu hóa tốc độ tăng trưởng, cho phép thu nhận tế bào bằng cách lọc, và quan trọng là tế bào trong nuôi cấy lỏng vẫn giữ được khả năng phát triển thành mô sẹo (Phillips et al., 1996). Nuôi cấy tế bào trong các bình phản ứng sinh học (bioreactor) cũng đã được thực hiện để thu một lượng lớn sinh khối và Taxol (Park et al., 1994; Yoon và Park, 1994). Loài thông đỏ T. wallichiana đã được CITES (Công ước quốc tế về buôn bán các loài động thực vật nguy cấp) coi là mộ loài đang nguy cấp. Loài cây này có hàm lượng cao các taxoid (0.01–0.02%) và 10-deacetyl baccatin III trong vỏ và lá (Nhut et al., chưa công bố). Người ta dự đoán rằng loài thông đỏ này sẽ hoàn toàn biến mất khỏi thiên nhiên trong vài thấp niên tới do sự khai thác ngoài tầm kiểm soát Taxol và gỗ; sự nguy cấp đối với loài này còn có nguyên nhân từ bản chất đơn tính và thời gian ngủ kéo dài của chồi. Nguyễn Thị Thanh Hiền et al. (2005) đã tạo mô sẹo thành công từ thân non và chồi của T. wallichiana. Tuy nhiên, các loại nguyên liệu khác như huyền phù tế bào và mô sẹo tái tạo vẫn có thể được thu nhận để góp phần bảo tồn loài và tách chiết Taxol. Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu về việc thiết lập quy trình sản xuất lượng lớn sinh khối Taxus ở dạng mô sẹo và huyền phù tế bào nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tương lại về tách chiết và định tính taxoid, đồng thời góp phần bảo tồn loài T. wallichinana đang trong tình trạng nguy cấp. Bài báo mô tả chi tiết điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo từ huyền phù. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguồn mẫu thực vật Để tạo mô sẹo, chúng tôi nuôi cấy các đoạn cắt từ chồi 14 đến 25 ngày tuổi của cây Taxus wallichiana trồng tại Phân viện sinh học tại Đà Lạt (Đà Lạt, Lâm Đồng). Môi trường nuôi cấy được ký hiệu là C3, là môi trường B5 cơ bản (Gamborg et al., 1968) có bổ sung 4 mg/L 2,4-D (acid 2,4- dichlorophenoxyacetic) và 1 mg/L kinetin. Mô sẹo tạo thành được tiếp tục duy trì trên cùng môi trường dưới ánh sáng cường độ 45 μmol/m 2 /s (12 giờ chiếu sáng/ngày) và sử dụng làm mẫu cấy tiếp theo. Môi trường và điều kiện thí nghiệm Môi trường với các thành phần khoáng và vitamin B5 được dùng làm môi trường cơ bản cho tất cả các thí nghiệm. Ảnh hưởng của 2,4-d, kinetin, nước dừa tươi và sucrose được khảo sát bằng cách bổ sung các thành phần này vào môi trường với các nồng độ khác nhau (Bảng 1). Môi trường được làm rắn với 9 g/L thạch (Agar Hải Phòng). Chúng tôi dùng bình nuôi cấy 250 mL (40 mL môi trường/bình) để tạo mô sẹo, bình tam giác Erlenmeyer 250 mL (60 mL môi trường/bình) để nuôi cấy huyền phù, và bình 500 mL để tái tạo mô sẹo. Môi trường được điều chỉnh pH 5,8–5,9 trước khi hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 30–40 phút. Bảng 1. Thành phần của các môi trường thí nghiệm. Ký hiệu 2,4-D (mg/L) Kinetin (mg/L) Tỷ lệ nước dừa (theo thể tích) C2 1 - - C3 4 1 - C3∙CW 4 1 20% C4 8 - - C5 8 1 - Thí nghiệm được tiến hành trong phòng nuôi cấy, 25 ± 2 o C, độ ẩm tương đối 80%, cường độ sáng 45 μmol/m 2 /s (12 giờ/ngày). Các mẫu nuôi cấy trong tối cũng có cùng điều kiện nhiệt độ và độ ẩm. Các mảnh mô sẹo được lắc trong bình 250 mL trên máy lắc SO1 (Stuart Scientific, Anh) với tốc độ 110 vòng/phút. Đèn ống huỳnh quang trắng (Rạng Đông) được dùng cho các thí nghiệm có chiếu sáng. Thiết kế thí nghiệm Nước dừa đối với tăng trưởng mô sẹo Các mô sẹo xanh trên môi trường C3 được chuyển sang môi trường đặc C3 và C3∙CW có 20 g/L sucrose. Lượng mô sẹo ban đầu là 7.25 mg/mL môi trường. Sau 5 tuần, trọng lượng tươi và khô cùng Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007 245 hình thái mô sẹo được ghi nhận. Thí nghiệm được lặp lại ba lần. Một số yếu tố tác động đến việc khởi tạo huyền phù Chúng tôi khảo sát các yếu tố như: nguồn mô sẹo (nuôi cấy trong tối và sáng); nồng độ 2,4-D và kinetin; nước dừa; điều kiện sáng (trong tối hoàn toàn và cường độ sáng 45 mol/m 2 /s; nồng độ sucrose (20–80 g/L). Lượng mô sẹo ban đầu là 2,30 g. Các thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Mật độ tế bào được ghi nhận sau hai đến ba tuần nuôi cấy. Tăng trưởng huyền phù tế bào Huyền phù tế bào được chuyển sang môi trường mới (50% thể tích). Mật độ và trọng lượng tươi tế bào trong huyền phù được ghi nhận 4 ngày/lần trong 24 ngày. Thí nghiệm được lặp lại ba lần. Tái tạo mô sẹo từ huyền phù Môi trường thạch bổ sung 2,4-D và kinetin được dùng để trải 2 mL huyền phù tế bào. Sự tái tạo mô sẹo được ghi nhận sau 1, 2, 3, và 4 tháng. Mỗi nghiệm thức được tiến hành với 30 bình nuôi cấy. Đo sinh khối Trọng lượng tươi và khô của mô sẹo và tế bào huyền phù thu bằng cách lọc qua giấy lọc được đo bằng cân phân tích (Sartorius, Đức). Để tính mật độ tế bào, chúng tôi trải 10 µL huyền phù tế bào lên một lamelle úp ngược trên một lame kính lõm. Số lượng tế bào được đếm với một buồng đếm dưới kính hiển vi (Olympus, Hoa Kỳ) với độ phóng đại 10 X. Phân tích số liệu Số liệu được phân tích bằng phương pháp kiểm tra Duncan (Duncan, 1995). KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nước dừa đối với tăng trưởng mô sẹo Mô sẹo T. wallichiana tăng trưởng tốt trên các môi trường không có nước dừa, trong đó môi trường C3 trong tối là điều kiện tối ưu, cho các mô sẹo mềm và màu trắng ngà (Hình 1). Trong môi trường có nước dừa (C3∙CW medium), một ít mô sẹo chuyển sang màu nâu rồi chết dần (Bảng 2). Tỷ lệ mô sẹo hóa nâu là 7.45% dưới điều kiện sáng và 3.88% trong tối. Mô sẹo trong tối tăng trưởng tốt hơn mô sẹo dưới điều kiện sáng do tác động ức chế của ánh sáng đối với mô sẹo (Gibson et al., 1993). Ảnh hưởng của nước dừa đối với sự tăng trưởng và phát triển in vitro của thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi nhưng riêng cho đối với nuôi cấy Taxus và tách chiết Taxol thì vẫn chưa có nhiều công trình. Kết quả trong nghiên cứu này cho thấy nước dừa ở nồng độ 20% là không phù hợp cho sự tăng trưởng mô sẹo T. wallichiana cho dù nước dừa có tác động tốt đến nhiều loài khác. Ảnh hưởng của nguồn mô sẹo, ánh sáng, nồng độ sucrose đối với sự hình thành huyền phù Huyền phù từ nguồn mô sẹo sinh trưởng trong tối sẽ cho màu đỏ đặc trưng, trong khi mô sẹo dưới ánh sáng sẽ tạo ra huyền phù có màu hơi vàng. Huyền phù tăng trưởng chậm hơn khi mật độ tế bào ban đầu thấp hơn do khả năng phân chia thấp (Torres, 1989). Trong nghiên cứu của chúng tôi, mô sẹo nuôi cấy trong bong tối bở xốp hơn so với mô sẹo dưới điều kiện sáng, do đó chúng dễ dàng hình thành các tế bào đơn và cụm tế bào hơn nếu được chuyển qua nuôi cấy lỏng lắc (Bảng 3). Bảng 2. Ảnh hưởng của nước dừa và ánh sáng đối với sự tăng trưởng mô sẹo của thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 6 tuần nuôi cấy. Môi trường Sáng/tối Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Hình thái C3 Sáng 1.25 ± 0.11a 0.12 ± 0.03a Hơi xanh, cứng, tăng trưởng chậm C3∙CW Sáng 0.45 ± 0.12c 0.05 ± 0.02b Hơi xanh, tăng trưởng chậm C3 Tối 1.37 ± 0.11a 0.13 ± 0.04a Hơi vàng, mềm, tăng trưởng mạnh C3∙CW Tối 0.87 ± 0.09b 0.03 ± 0.02b Nâu, bở Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD). Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý nghĩa theo Phương pháp kiểm tra Duncan ở mức 5% xác suất. Duong Tan Nhut et al. 246 Hình 1. Ảnh hưởng của nước dừa và ánh sáng lên sự tăng trưởng mô sẹo: Trên môi trường C3 dưới điều kiện sáng (a) và tối (c); và trên môi trường C3∙CW dưới điều kiện sáng (b) và tối (d). Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn mô sẹo đối với sự khởi tạo huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 3 tuần nuôi cấy. Nguồn mô sẹo Mật độ (tế bào/mL) Trọng lượng tươi sinh khối (mg/mL) Nuôi cấy có ánh sáng 3.884.15 ± 114.03b 12.56 ± 1.44b Nuôi cấy trong tối 6.421.22 ± 105.11a 21.94 ± 1.58a Số liệu được trình bày với ± độ lệch chuẩn (SD). Ký tự giống nhau trong cùng một cột thể hiện không có sự khác biệt có ý nghĩa theo Phương pháp kiểm tra Duncan ở mức 5% xác suất. Môi trường C3 là môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo, đồng thời cho sự hình thành huyền phù tế bào T. wallichiana (Hình 2, 3). Huyền phù tế bào hình thành tốt nhất trong môi trường C3∙CW trong điều kiện tối. Nước dừa có chứa zeatin và một số cytokinin khác có tác dụng thúc đẩy hoạt động phân chia tế bào; nước dừa cũng có chứa một số acid amine hạn chế khác (Letham, 1974). Tổ chức y tế thế giới (WHO) cũng cho biết trong nước dừa có nhiều protein, carbohydrate, calcium, các hợp chất sắt, đường, và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic. Các Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007 247 chất này có thể đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy hoạt động tăng trưởng và phân chia tế bào. Các thành phần trong nước dừa cũng có thể có tác động lên sự phân tách các tế bào trong huyền phù; quan sát dưới kính hiển vi cho thấy trong môi trường có nước dừa, các cụm gồm 20–30 tế bào hình thành với tế bào tách rời nhiều hơn so với môi trường không nước dừa. Ánh sáng có tác dụng ức chế đối với sự hình thành huyền phù tế bào và mô sẹo (Gibson et al., 1993). Trong cả hai trường hợp, nuôi cấy trong tối cho kết quả tốt hơn dưới điều kiện sáng (Bảng 4) với mật độ tế bào và trọng lượng tươi sinh khối cao hơn khoảng 1,5 lần. Huyền phù tế bào hình thành tốt nhất trong môi trường có 60 g/L sucrose (Hình 4). Nồng độ đường cao hơn làm giảm sự tăng trưởng của huyền phù. Trong giai đoạn tăng trưởng hàm mũ (phase log), vách tế bào và tinh bột được tổng hợp mạnh bằng nguồn carbon từ môi trường (Stepan-Sarkissian and Grey, 1990); tuy nhiên, đường ở nồng độ cao có thể gây stress thẩm thấu cho tế bào. Hình 2. Ảnh hưởng của môi trường đối với mật độ tế bào huyền phù cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện sáng. Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE). Hình 3. Ảnh hưởng của môi trường đối với trọng lượng tươi sinh khối huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng. Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE). Tế bào/mL Môi trường Môi trường Trọng lượng tươi sinh khối (µg/mL) Duong Tan Nhut et al. 248 Hỡnh 4. nh hng ca nng sucrose i vi s hỡnh thnh huyn phự t bo cõy thụng Lõm ng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 2 tun nuụi cy. Thanh sai s biu din sai s chun (SE). Bng 4. nh hng ca ỏnh sỏng i vi s hỡnh thnh huyn phự t bo cõy thụng Lõm ụng (Taxus wallichiana Zucc.) sau 2 tun nuụi cy. Mụi trng Sỏng/ti Mt t bo (t bo/mL) Trng lng ti sinh khi (mg/mL) C3 Sỏng 4.625.17 205.22d 14.75 3.44b C3CW Sỏng 5.968.89 240.02c 19.33 2.05b C3 Ti 6.450.13 187.76b 19.35 2.11b C3CW Ti 7.656.26 322.24a 26.15 2.47a S liu c trỡnh by vi lch chun (SD). Ký t ging nhau trong cựng mt ct th hin khụng cú s khỏc bit cú ý ngha theo Phng phỏp kim tra Duncan mc 5% xỏc sut. Tng trng huyn phự t bo S tng trng ca huyn phự t bo trong bỡnh nuụi cy lc cao hn rt nhiu so vi h thng nuụi cy lng tnh (Hỡnh 5, 6). Nuụi cy lc thỳc y s phõn chia v tng trng ca t bo trong mụi trng lng (Torres, 1989) vỡ nú lm tng thoỏng khớ v giỳp cht dinh dng v cỏc thnh phn khoỏng phõn b ng u trong ton b mụi trng. Nh ú, t bo cú th thu nhn c cỏc cht dinh dng v iu hũa sinh trng t mi hng trong mụi trng. Phase lag ca huyn phự t bo kộo di hn 1 tun. Trong 24 ngy nuụi cy, huyn phự vn cha t n phase tng trng n nh (Hỡnh 5, 6). Torres (1989) ó cụng b kt qu nghiờn cu cho thy mt t bo thp vo lỳc u cú th dn n phase lag v phase log kộo di. Trong nghiờn cu ca chỳng tụi, mt t bo ban u 15.610 1.040 t bo/mL cú th cũn tng i thp dn n s kộo di ca hai phase tng trng núi trờn. Di kớnh hin vi, chỳng tụi ghi nhn cỏc t bo n v cỏc cm vi vi chc t bo (Hỡnh 7). Nc da cú th cú vai trũ quan trng trong vic tỏch ri t bo. Tuy rt ớt nghiờn cu cp n nh hng ca t l auxin/cytokinin i vi s tỏch ri ca t bo trong huyn phự, nhng lng auxin/cytokinin trong nghiờn cu ny l tng i phự hp cho s tỏch ri cỏc t bo trong huyn phự T. wallichiana. Tỡnh trng tỏch ri ca cỏc t bo cng tựy thuc thi im. Sau khi cy chuyn, s t bo n trong mụi trng rt cao; sau ú nhiu cm t bo hỡnh thnh t ngy th 12, cú cm lờn n hng trm t bo. Nng sucrose (g/L) Mt t bo (t bo/mL) Trng lng ti sinh khi (àg/mL) Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007 249 Hình 5. Mật độ tế bào huyền phù cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) trong 24 ngày nuôi cấy. Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE). Hình 6. Trọng lượng tươi sinh khối huyền phù tế bào cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) trong 24 ngày nuôi cấy. Thanh sai số biểu diễn sai số chuẩn (SE). Thời gian nuôi cấy (ngày) Mật độ tế bào (tế bào/mL) Nuôi cấy lỏng lắc Nuôi cấy lỏng tĩnh Thời gian nuôi cấy (ngày) Nuôi cấy lỏng lắc Nuôi cấy lỏng tĩnh Trọng lượng tươi sinh khối (µg/mL) Duong Tan Nhut et al. 250 Tái tạo mô sẹo từ huyền phù Thí nghiệm tái tạo mô sẹo từ huyền phù được thực hiện trong tối và sáng; kết quả cho thấy, không có mô sẹo nào được tái tạo dưới điều kiện chiếu sáng. Những mô sẹo đầu tiên được ghi nhận khoảng 1 tháng sau khi trải tế bào từ huyền phù 25 ngày lên môi trường C3 rắn trong tối. Tế bào lấy từ huyền phù nuôi cấy được 5 ngày hoặc sớm hơn không tái tạo được mô sẹo. Mẫu huyền phù vào ngày 10 và 20 chỉ tạo được mô sẹo sau 3 tháng nuôi trên môi trường C2, C3, và C4 trong tối. Rất ít mô sẹo tái tạo trên môi trường C5 (Hình 8). Từ ngày thứ 12, có thể huyền phù tế bào đã đi vào phase log và tiền ổn định. Giai đoạn này diễn ra các hoạt động phân chia tế bào và sinh tổng hợp mạnh. Những tế bào này khi được lấy để trải lên môi trường C3 thì tái tạo mô sẹo tốt và tăng trưởng mạnh (Bảng 5). Ngược lại, nếu lấy tế bào từ những ngày trước đó, có thể huyền phù tế bào còn trong phase lag, sẽ cho kết quả tái tạo mô sẹo kém và không đồng đều. Sự tăng trưởng và phát triển của mô sẹo được tái tạo cho thấy tình trạng sinh lý của tế bào ban đầu trong huyền phù, thông tin này sẽ có ích cho việc quyết định giai đoạn nào là phù hợp để tách chiết taxoid từ tế bào. Trải tế bào từ huyền phù cũng có thể cố định tình trạng trao đổi chất để nhân các dòng tế bào về sau. Sau 3 hoặc 4 tháng nuôi cấy, phần tiếp xúc giữa mô sẹo và môi trường bắt đầu hóa nâu. Đây là kết quả của sự sản sinh các chất polyphenol trong mô sẹo. Hiện tượng này cũng được ghi nhận ghi các mô sẹo ban đầu được nuôi cấy trên môi trường rắn. Điều này cho thấy trạng thái trao đổi chất của mô sẹo tái tạo cũng tương tự như ở mô sẹo ở các giai đoạn khác trong quy trình. Ảnh hưởng ức chế của ánh sáng cũng thể hiện rõ, đặc biệt trong điều kiện chuyển tế bào từ huyền phù sang môi trường rắn. Nghiên cứu này cho thấy tế bào T. wallichiana có thể tăng trưởng tốt trong huyền phù và mô sẹo có thể được tái tạo từ huyền phù bằng một hệ thống nuôi cấy đơn giản. Chúng tôi đã thiết lập được quy trình tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo cho T. wallichiana. Nguyên liệu tạo ra từ quy trình này có thể được dùng cho nuôi cấy bioreactor để thu nhận Taxol/taxoid và các dẫn xuất của chúng. Hình 7. Tế bào Taxus wallichiana dưới kính hiển vi. a, b: tế bào đơn; c: cụm tế bào. Thước = 10 µm Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2): 243-253, 2007 251 Hình 8. Mô sẹo tái tạo sau 4 tháng trên môi trường rắn: C2 (a), C3 (b), C4 (c), và C5 (d). Bảng 5. Ảnh hưởng của môi trường và thời gian lấy mẫu từ huyền phù đối với sự tái tạo mô sẹo cây thông đỏ Lâm Đồng (Taxus wallichiana Zucc.) trong điều kiện tối hoàn toàn. Thời điểm Thời điểm ghi nhận C2 C3 C4 C5 Ngày 5 Sau 1 tháng – – – – Sau 2 tháng – – – – Sau 3 tháng – – – – Sau 4 tháng – – – – Ngày 15 Sau 1 tháng – – – – Sau 2 tháng – – – – Sau 3 tháng + + – – Sau 4 tháng + + – – Ngày 25 Sau 1 tháng + + – – Sau 2 tháng + ++ + – Sau 3 tháng ++ +++ + + Sau 4 tháng +++ ++++ ++ ++ Ghi chú: Thời điểm: là thời điểm tế bào huyền phù được lấy để trải lên môi trường rắn. Tại thời điểm ghi nhận: không có mô sẹo (–); có thể thấy mô sẹo (+); mô sẹo có tăng trưởng (++); mô sẹo tăng trưởng tốt (+++); mô sẹo tăng trưởng rất tốt với cụm mô sẹo lớn (++++). Lời cảm ơn: Các tác giả chân thành cảm ơn Trung tâm nghiên cứu Châu Á (ĐHQG Hà Nội và Quỹ nghiên cứu tiên tiến Hàn Quốc) đã tài trợ cho nghiên cứu này, GS. Pierre Debergh và TS. Kien Nguyen vì những ý kiến đóng góp cho bài báo. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chee PP (1994) In vitro culture of zygotic embryos of Taxus species. Hort Sci 29(6): 695-697. Duong Tan Nhut et al. 252 Christen AA, Gibson DM, Bland J (1991) Production of taxol or taxol-like compounds with Taxus breviofolia callus cell culture. US Patent US 5019504 (Patent). Cragg GM, Schepartz SA, Suffness M, Grever MR (1993) The taxol supply crisis. New NCI policies for handling the large-scale production of novel natural product anticancer and anti-HIV agents. J Nat Prod 56(10): 1657-1668. Duncan DB (1995) Multiple range and multiple F test. Biomet 11: 1-42. Eccher T (1998) Response of cuttings of 16 Taxus cultivars to rooting treatments. Acta Horticult 227: 251-253. Edgington SM (1991) Taxol: out of the woods. Bio/Technol 9(10): 933–938. Fett-Neto AG, DiCosmo F, Reynolds WF, Sakata K (1992) Cell culture of Taxus as a source of the antineoplastic drug taxol and related taxanes. Bio/Technol 10: 1572-1575. Fett-Neto AG, Melanson SJ, Nicholson SA, Pennington JJ, DiCosmo F (1994) Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and amino acid feeding to cell cultures of Taxus cuspidata. Biotech Bioeng 44: 967-971. Flores H, Sgrignoli PJ (1991) In vitro culture and precocious germination of Taxus embryos. In Vitro Cell Dev Biol–Plant 27: 139-142. Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res 50: 151-158. Gibson DM, Ketchum REB, Christen AA (1993) Initiation and growth of cell lines of Taxus brevifolia (Pacific yew). Plant Cell Rep 12(9): 479-482. Hien NTT, Khiem DV, Vu NH, Don NT, Nhut DT (2005) Primary study on the induction and growth of callus of Taxus wallichiana Zucc., a valuable medicinal plant in Lam Dong Province. In Tuyen BC, Giang TT, Mien BV, Hien PP, Hay N, Tri BM, eds. Proc Vietnam- Korea Intl Sym Biotech Bio-system Eng, Ho Chi Minh City: 191-197. Lepage-Degivry MT (1973) Intervention d’un inhibiteur lie dans la dormance embryonnaire de Taxus baccata L. CR Acad Sci 277: 177-180. Lepage-Degivry MT, Garello G (1973) La dormance embryonnaire chez Taxus baccata: Influence de la composition du milieu liquide sur l’induction de la germination. Physiol Plant 29: 204-207. Letham DS (1974) Regulators of cell division in plant tissues. XX. The cytokinins of coconut water. Physiol Plant 32: 66-70. Park IS, Kim JH, Youn JH, Byun SY, Kim DI (1994) Effects of sugar concentration on growth and taxol production in Taxus cuspidata cell cultures. In Teo WK, Yap MGS, Oh SKW, eds. Better living through innovative biochemical engineering. National University of Singapore, Singapore: 131-133. Phillips GC, Hubstenberger JF, Hansen EE (1996) Plant regeneration by organogenesis of callus and cell suspension cultures. In Gamborg OL, Phillips GC, eds. Plant cell, tissue and organ culture - Fundamental methods. Narosa Publ House, New Delhi, India: 67-79. Shuler ML, Hirasuna TJ, Moser S (1994) Effects of media manipulation on growth and taxol production in Taxus sp. Abstr Pap Am Chem Soc 207 Meeting, Pt 2, BTEC 21. Steinfield D (1992) Early lessons from propagating Pacific yew. Rocky Mountain Forest and Range. Expt Sta Tech Res Rep: 221. Stepan-Sarkissian G, Grey D (1990) Selection of media for tissue and cell culture. In Pollard JW, Walker JM, eds. Methods in molecular biology. 6. Plant cell and tissue culture. The Humana Press, New Jersey, the USA: 1-27. Strobel GA, Stierle A, van Kuijk FJGM (1992) Factors influencing the in vitro production of radiolabeled taxol by Pacific yew, Taxus brevifolia. Plant Sci 84(1): 65-74. Torres KC (1989) Overview of cell suspension culture. In Torres KC, ed. Tissue culture techniques for horticultural crops. Chapman & Hall Publisher, USA: 151-160. Tuleke W (1959) The pollen cultures of CD Larue: A tissue from the pollen of Taxus. Bull Torrey Bot Club 86: 283-289. Vidensek N, Lim P, Campbell A, Carson C (1990) Taxol content in bark, wood, root, leaf, twig and seedling from several Taxus species. J Nat Prod 53: 1609-1610. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, McPhail AT (1971) Plant antitumour agents V1. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumour agent from Taxus brevifolia. J Am Chem Soc 93: 2325-2327. Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus cultures: initiation, growth optimization, [...]... Singapore, Singapore: 68-70 Zhong JJ, Shen LN, Wang SJ (1995) Recent advances in plant cell culture engineering Chinese J Ind Microbiol 25(1):25-29 CELL CULTURE AND CALLUS RECOVERY FROM SUSPENSION OF HIMALAYAN YEW (TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) Duong Tan Nhut, Nguyen Trinh Don, Nguyen Thi Thanh Hien, Dinh Văn Khiem, Phan Xuan Huyen Dalat Affiliate Institute of Biology SUMMARY Taxus wallichiana is well-known . Sinh học 5(2): 243-253, 2007 243 NUÔI CẤY TẾ BÀO VÀ TÁI TẠO MÔ SẸO TỪ HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY THÔNG ĐỎ HYMALAYA (THÔNG ĐỎ LÂM ĐỒNG) (Taxus wallichiana Zucc.). Bài báo mô tả chi tiết điều kiện tạo huyền phù tế bào và tái tạo mô sẹo từ huyền phù. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguồn mẫu thực vật Để tạo mô sẹo, chúng