1 THÍ NGHIỆM VI SINH BÀI 1 CÁC QUI TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Sinh viên tham gia thực tập vi sinh cần tuân thủ một số qui tắc sau để đảm bảo an toàn: 1. Mặc áo blouse trong thời gian thực tập. 2. Lắng nghe và thực hiện nghiêm túc các hướng dẫn của cán bộ phụ trách thực tập. 3. Đọc kỹ tài liệu thực tập và nắm vững nguyên tắc, phương pháp thí nghiệm với vi sinh vật. 4. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm. Không đưa vật thể bên ngoài vào miệng khi đang thao tác với vi sinh vật. 5. Chỉ mang những vật dụng tối thiểu cần cho thực tập (tài liệu thực tập, tập ghi, bút) vào chỗ làm thí nghiệm. Tất cả các vật dụng cá nhân khác phải để ở vò trí cách ly riêng. 6. Trước khi bắt đầu làm thí nghiệm, sinh viên cần sát trùng mặt bàn thí nghiệm bằng khăn giấy tẩm cồn 70 o và để khô. Thực hiện khử trùng tương tự cho 2 tay của người làm thí nghiệm. Sau khi hoàn thành thí nghiệm, tắt đèn cồn, sau đó lặp lại việc sát trùng mặt bàn và 2 tay với cồn như trên. 2 7. Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. 8. Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các đóa petri, ống nghiệm môi trường, bình nuôi cấy. 9. Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác với ống hút đònh lượng (pipette), không hút bằng miệng. 10. Không mở đóa petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật vào đường hô hấp. 11. Khi đốt que cấy có dính sinh khối vi sinh vật, cần đặt vòng hoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào không khí. 12. Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật lên bàn thí nghiệm, dùng khăn giấy tẩm cồn 70 o lau kỹ mặt bàn. 13. Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả các mảnh vỡ vào một túi rác riêng. 14. Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng. Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khử trùng trước khi thải bỏ. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dòch chất diệt khuẩn trước khi rửa và tái sử dụng. 15. Sát trùng và rửa tay sạch sẽ bằng xà phòng trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm. 16. Khi xảy ra tai nạn hoặc sự cố, cần báo ngay với cán bộ phụ trách thực tập để có biện pháp xử lý thích hợp, kòp thời. 3 BÀI 2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 1. Nguyên tắc: Để phân lập, nuôi cấy và bảo quản các vi sinh vật, người ta sử dụng các môi trường dinh dưỡng đặc hoặc lỏng. Môi trường dinh dưỡng cần chứa đầy đủ các thành phần về nguồn carbon, nguồn nitơ, khoáng đa lượng và vi lượng cần cho sự biến dưỡng vật chất và năng lượng của vi sinh vật quan tâm. Ngoài các thành phần dinh dưỡng cần thiết, môi trường còn cần có hàm lượng nước thích hợp, độ pH xác đònh và có kết cấu lý tính thích hợp cho sự tăng trưởng của vi sinh vật mục tiêu. Người ta thường gọi tên các môi trường bằng cách dựa vào tên người tìm hoặc gọi theo nguồn chất dinh dưỡng chính của môi trường. Dựa vào tính chất vật lý, người ta có thể phân biệt thành các loại môi trường dinh dưỡng sau đây: - Môi trường lỏng: được dùng để nuôi tăng sinh, thử nghiệm các đặc tính sinh lý và sinh hóa, giữ giống và bảo quản giống… - Môi trường rắn: được dùng để phân lập khuẩn lạc đơn, nghiên cứu các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm tăng trưởng, đònh lượng mật độ vi sinh vật, cấy chuyền, giữ giống… - Môi trường bán rắn: được dùng trong lên men vi sinh trong công nghiệp. 2. Vật liệu: - Cốc thủy tinh 4 - Bình tam giác - Ống nghiệm - Phễu thủy tinh - Ống hút - Ống đong - Cân - Lò viba - Nồi hấp áp lực - Các hóa chất pha môi trường 3. Thực hành: a. Môi trường cao thòt – pepton: Cao thòt 3g Pepton 10g NaCl 5g Agar 15g Nước cất đủ 1000ml pH = 6 b. Môi trường Hansen: Glucose 50g Pepton 10g KH 2 PO 4 3g MgSO 4 3g Agar 20g 5 Nước cất đủ 1000ml pH = 6 c. Môi trường PGA: Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g Nước cất đủ 1000ml pH = 6,5 6 BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG 1. Nguyên tắc: Khử trùng có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một số tác nhân lý hóa như: nhiệt độ, bức xạ, lọc và hóa chất. - Nhiệt độ cao có thể tiêu diệt vi sinh vật do tác dụng làm biến tính enzyme, mất nước và oxy hóa các thành phần của tế bào; nhiệt độ thấp ức chế sự tăng trưởng của chúng. Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hoặc nhiệt ẩm. - Năng lượng chiếu xạ ở bước sóng ngắn có khả năng ion hóa phân tử nước tạo gốc tự do tác dụng phá hủy DNA, màng lipid và protein trong tế bào; tia xạ có bước sóng dài hơn như tia tử ngoại không có tác dụng ion hóa nhưng có thể cảm ứng việc tạo thành dimer giữa các base pyrimidine trong nucleic acid, tạo nên đột biến, có thể gây chết tế bào. - Các dòch lỏng có thể được khử trùng bằng cách lọc qua màng lọc vô trùng, cho phép dòch lỏng đi qua và giữ lại tất cả các vi sinh vật có kích thước lớn hơn lỗ của màng lọc. - Nhiều hóa chất có thể kiểm soát sự tăng trưởng của vi sinh vật như: ethylen oxide, triethylen glycol, kháng sinh… 2. Vật liệu: - Bình tam giác - Ống nghiệm 7 - Đóa petri - Nồi hấp áp lực - Tủ sấy - Bông không thấm 3. Thực hành: Khử trùng bằng nồi hấp áp lực: Phương pháp khử trùng bằng nồi hấp áp lực sử dụng nhiệt ẩm để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng và bào tử của vi sinh vật, dựa trên nguyên tắc làm gia tăng nhiệt độ bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suất bình thường của khí quyển. Trình tự các bước sử dụng nồi hấp áp lực như sau: - Bổ sung nước ở đáy nồi đến vạch quy đònh. - Xếp dụng cụ và vật liệu cần khử trùng vào giá đặt, không xếp quá chặt để hơi nước lưu thông dễ dàng. - Đậy kín nắp nồi hấp. Trường hợp nắp có nhiều ốc vặn, cần vặn ốc theo từng cặp đối xứng nhau. - Mở van thông hơi nước giữa hai nồi (trường hợp nồi hấp hai lớp). - Bật công tắc điện, đun nồi hấp. - Khi nhiệt độ lên đến 80 o C hoặc 0,5 atm, mở từ từ van xả để đuổi hết không khí ra khỏi nồi cho đến khi luồng hơi nước thoát ra liên tục, đóng van lại. - Khi áp suất nồi trong lên đến áp suất cần hấp, bắt đầu tính thời gian hấp. 8 - Khi đủ thời gian khử trùng, tắt điện, chờ nhiệt độ và áp suất hạ xuống giá trò 0 mới được mở nắp để tránh gây tai nạn hoặc tránh áp suất thay đổi đột ngột làm hư môi trường. Sau khi hấp khử trùng xong, cần lấy sớm dụng cụ, bình chứa môi trường ra khỏi nồi hấp và làm nguội nhanh nhằm giảm thiểu tác dụng của nhiệt lên môi trường. Các bình chứa môi trường có thể được làm nguội nhanh dưới vòi nước chảy. Các bình tam giác, chai lọ, ống nghiệm chứa môi trường trước khi được khử trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm cần được đậy chặt, nhưng đảm bảo cho phép không khí và hơi nước thông qua bằng cách sử dụng nút bông không thấm nước, nắp nhôm, giấy nhôm… Thông thường, các đóa petri hoặc nút bông còn được bao gói bằng giấy hoặc giấy nhôm để giảm thiểu nguy cơ bò nhiễm sau khi khử trùng. Sau khi hấp, các đóa petri vô trùng cần được sấy khô trước khi dùng. 9 BÀI 4 KỸ THUẬT THAO TÁC VÔ TRÙNG 1. Nguyên tắc: Trong phòng thí nghiệm, vi sinh vật cần được nuôi cấy vào nhiều dạng môi trường khác nhau để tăng sinh, khảo sát đặc tính tăng trưởng và biến dưỡng, thử nghiệm sinh hóa, đònh danh… Việc cấy chủng cần được thực hiện sao cho không đưa vi sinh vật khác hay vi sinh vật tạp nhiễm vào môi trường. Kỹ thuật thao tác vô trùng được sử dụng để loại trừ các vi sinh vật gây nhiễm. Môi trường, các dụng cụ chứa môi trường, dụng cụ nuôi cấy hoặc các dụng cụ cần thiết khác cần được khử trùng một cách thích hợp để có được trạng thái vô trùng trước khi sử dụng. Chủng có thể được cấy vào môi trường lỏng hoặc lên bề mặt môi trường rắn bằng một số dụng cụ sau: - Que cấy thẳng - Que cấy móc - Que cấy vòng - Ống hút thủy tinh - Tăm bông vô trùng… Các thao tác vô trùng được thực hiện trong không gian vô trùng tạo ra bởi ngọn lửa của đèn cồn trong tủ cấy vô trùng. Ngọn lửa đèn cồn có tác dụng ôxy hóa không khí tạo không gian vô trùng; đồng thời còn được dùng 10 để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ và ống nghiệm khi mở nắp hoặc nút bông. Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, người thao tác cần mang găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay với cồn 70 o hoặc các dung dòch diệt khuẩn khác, tương tự tiến hành sát trùng bề mặt bàn thí nghiệm trước khi bắt đầu thao tác vô trùng. Sau khi thực hiện xong việc cấy chủng, tiến hành sát trùng tay và bề mặt bàn làm việc tương tự như trên trước khi ra khỏi phòng thí nghiệm. 2. Vật liệu: - Que cấy thẳng - Que cấy móc - Que cấy vòng - Đèn cồn - Mơi trường ni cấy - Giống vi sinh vật 3. Thực hành: a) Cấy giống từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng: - Sau khi khử trùng que cấy, dùng tay phải để mở nút bông, hơ nóng miệng ống nghiệm, xoay vài vòng qua ngọn lửa. - Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm, làm nguội que cấy. - Thu sinh khối bằng cách nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống nghiệm. [...]... khơng có vách ngăn 2 Vật liệu: - Phiến kính - Lá kính - Que cấy - Đèn cồn - Kính hiển vi quang học - Xanh methylen - Dầu cèdre - Cồn - Giống vi sinh vật 3 Thực hành: Thực hiện làm các tiêu bản quan sát vi sinh vật 18 Sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát các vi sinh vật Mơ tả hình dạng của các vi sinh vật khác nhau dưới kính hiển vi quang học Vẽ hình dạng của các tế bào vi sinh vật khác nhau khi... đậy đóa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm 14 BÀI 6 QUAN SÁT VI SINH VẬT 1 Nguyên tắc: Kính hiển vi là thiết bò cần thiết trong nghiên cứu hình thái và nhận diện vi sinh vật Kính hiển vi cho phép phóng đại và quan sát rõ, chân thật các đối tượng vi sinh vật, các nội bào quan khác nhau Dưới đây là một số kính hiển vi thường gặp: - Kính hiển vi soi nổi: là dạng kính lúp có độ phóng... hiển vi quang học 21 BÀI 9 ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT 1 Ngun tắc: Vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau Sau đây là 2 phương pháp thơng dụng: a) Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu: Mật độ các vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn có thể được xác định bằng cách đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu Phương pháp này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật. .. trưởng 2 Vật liệu: - Phiến kính - Lá kính - Que cấy - Đèn cồn - Kính hiển vi quang học - Xanh methylen - Dầu cèdre - Cồn - Giống vi sinh vật 3 Thực hành: a) Quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống hay nhuộm màu với vật kính không quá 40X: - Mẫu vật được chuẩn bò trên phiến kính với một giọt nước - Đặt lá kính lên giọt nước - Đặt phiến kính lên bàn mang vật - Hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng - Chọn vật kính... lên vết nhuộm và đưa mẫu lên bàn mang vật - Nâng tụ quang, mở chắn sáng - Hạ từ từ vật kính X100 sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu cèdre - Dùng nút chỉnh thô nâng từ từ bàn mang vật cho đến khi thoáng thấy ảnh thì ngừng lại Sau đó, dùng nút chỉnh tinh chỉnh cho đến khi nhìn thấy ảnh rõ nét 17 BÀI 7 HÌNH THÁI VI SINH VẬT 1 Ngun tắc: - Vi khuẩn: là các vi sinh vật đơn bào, có nhiều hình dạng khác... độ, thời gian thích hợp - Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu (M): M = A x D / V (CFU/ ml) A: số khuẩn lạc trung bình/ 1 đĩa petri D: độ pha lỗng V: dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa petri (ml) 2 Vật liệu: - Đĩa petri - Ống nghiệm - Ống hút - Que gạt thủy tinh - Buồng đếm hồng cầu - Đèn cồn 3 Thực hành: - Thực hiện làm mẫu để đếm số lượng vi sinh vật 23 - Thực hiện đếm vi sinh vật trực tiếp... X10, dùng nút chỉnh thô hạ vật kính hoặc nâng bàn mang vật Chỉnh từ từ theo chiều ngược lại cho đến khi thấy ảnh vi sinh 16 vật trong thò trường của kính Dùng tay di chuyển phiến kính hoặc dùng bộ phận di chuyển bàn mang vật sao cho vùng muốn quan sát nằm ở giữa thò trường của kính - Chuyển sang vật kính X40, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh b) Quan sát vi sinh vật với vật kính X100: - Mẫu được... bào vi sinh vật khác nhau khi quan sát dưới kính hiển vi quang học 19 BÀI 8 NHUỘM VI SINH VẬT 1 Ngun tắc: Phương pháp nhuộm Gram phân biệt 2 nhóm vi khuẩn dựa vào khả năng bắt màu với các thuốc nhuộm tím kết tinh và iốt 2 nhóm vi khuẩn này là: - Các vi khuẩn Gram dương: giữ được phức chất tạo thành giữa tím kết tinh và iốt khi xử lý bằng cồn - Các vi khuẩn Gram âm: khơng có khả năng giữ được phức chất... thường dùng trong quan sát và thao tác trên những vật có kích thước tương đối lớn Nguồn sáng thường được chiếu trực tiếp từ phía trên xuống vật và phản xạ vào kính - Kính hiển vi quang học: là hệ thống dùng để phóng đại vi sinh vật kích thước nhỏ Độ phóng đại của kính có thể từ vài chục lần đến 2000 lần Cấu tạo kính gồm: thò kính, vật, thân kính, bàn mang mẫu vật, tụ quang, hệ thống chiếu sáng, nút chỉnh...- Hơ nóng miệng ống nghiệm, đậy nút bông Đặt ống nghiệm vào giá đỡ Đầu que cấy có chứa vi sinh vật được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn - Dùng tay trái lấy ống nghiệm môi trường mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm, rồi đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường Khuấy nhẹ que cấy, rút thẳng đầu lấy que cấy ra - Khử trùng miệng ống nghiệm, đậy nút bông lại - Khử trùng . 1 THÍ NGHIỆM VI SINH BÀI 1 CÁC QUI TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Sinh vi n tham gia thực tập vi sinh cần tuân thủ một số qui tắc sau để. vi sinh vật. 19 Sử dụng kính hiển vi quang học để quan sát các vi sinh vật. Mô tả hình dạng của các vi sinh vật khác nhau dưới kính hiển vi quang học. Vẽ hình dạng của các tế bào vi sinh. phương pháp thí nghiệm với vi sinh vật. 4. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm. Không đưa vật thể bên ngoài vào miệng khi đang thao tác với vi sinh vật. 5. Chỉ mang những vật dụng