-1- ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA    NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT CÂY RAU MÁ HUYỆN HÒA VANG – THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC GVHD: ThS Võ Kim Thành SVTH : Hồ Thị Thu Trang Lớp : 08CHD -2- MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ xa xưa, trong quá trình đấu tranh với thiên nhiên, bệnh tật, để bảo vệ cuộc sống, con người đã biết sử dụng nguồn thực vật và cả động vật làm các bài thuốc chữa bệnh có giá trị. Ngày nay, việc dùng các loại thuốc có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng và các công trình nghiên cứu về chúng cũng không ngừng phát triển. Qua các công trình nghiên cứu cho thấy khi sử dụng các loại thuốc có nguồn gốc thực vật có ít tác dụng phụ gây hại và đây chính là lí do quan trọng mà ngày nay các loại thuốc có nguồn gốc thiên nhiên ngày càng chiếm được lòng tin của người tiêu dùng. Trong khi đó, rau má (Centella Asiatica) là nguồn nguyên liệu dễ trồng, dễ kiếm, rẻ tiền mà lại có hiệu quả kinh tế cao. Rau má là loại thân thảo mọc phổ biến ở các quốc gia vùng nhiệt đới như : Ấn Độ, Madagascar, Indonesia, Việt Nam… Người dân ở các vùng này đã sử dụng rau má làm thực phẩm như một loại rau ăn hằng ngày.Bên cạnh đó, do có nhiều đặc tính quý nên nó được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền ở nhiều nước. Về mặt dược học, nhờ chứa các saponin triterpenoid như Asiaticoside, Madecassoide, rau má là một loại rau thông dụng có tác dụng sát trùng, giải độc, thanh nhiệt lương huyết. Asiaticoside đã được công nhận là chất có tác dụng tái tạo mô liên kết,giúp lên da non vết thương nhanh chóng có thể ứng dụng rất rộng rãi trong dược phẩm và cả hóa mỹ phẩm. Asiaticoside còn được sử dụng trong chữa trị bệnh phong, bệnh lao, làm chậm quá trình lão hóa. Ngoài ra, rau má cũng là loại thảo dược có tính bổ dưỡng rất cao, có nhiều sinh tố, khoáng chất, những chất chống oxy hóa, có thể dùng để dưỡng âm, cải thiện trí nhớ, làm chậm sự lão hóa, cải thiện vi tuần hoàn và chữa nhiều chứng bệnh về da… Ở nước ta, vùng trồng rau má phân bố rất rộng từ Bắc vào Nam với diện tích đáng kể, đặc biệt ở các tỉnh duyên hải miền Trung, nơi khí hậu có độ ẩm khá cao và thường có loại đất sét pha cát nên thích hợp cho loại cây này phát triển. Tuy vậy tiềm năng của loại -3- thảo dược quý này vẫn chưa được khai thác và tận dụng đúng mức, hầu như nó chỉ được sử dụng như một loại rau quen thuộc và gần gũi trong đời sống hằng ngày. Trên thế giới, y học hiện đại đã có những nghiên cứu lâm sàng về tác dụng chữa bệnh của dịch chiết và các hợp chất trong rau má. Tuy nhiên ở nước ta việc nghiên cứu chỉ mới bước đầu, chưa đi sâu vào việc xác định thành phần và hoạt tính sinh học của loài cây này. Để góp phần vào nguồn tài liệu về cây rau má phục vụ nghiên cứu khoa học, tôi chọn đề tài tài u chit tách và xánh thành phn hóa hc ca dch chit cây rau má huyn Hòa Vang  Thành ph ng. 2. Mục đích nghiên cứu  Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của rau má.  Khảo sát một số điều kiện chiết tách thích hợp.  Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo của một số cấu tử chính trong dịch chiết rau má. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu a. Đối tƣợng nghiên cứu Cây rau má thu hái vào buổi sáng sớm tháng 3 tại huyện Hòa Vang – Thành phố Đà Nẵng. b. Phạm vi nghiên cứu Cây rau má được trồng và thu hái tại Đà Nẵng Nguyên liệu rau má tươi và khô -4- 4. Phƣơng pháp nghiên cứu a. Nghiên cứu lý thuyết  Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài.  Trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô giáo và đồng nghiệp. b. Phƣơng pháp thực nghiệm  Phương pháp hóa học xác định một số chỉ số hóa lý của nguyên liệu.  Phương pháp vật lý: quang phổ hấp thụ phân tử để khảo sát điều kiện chiết, sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS xác định một số cấu tử chính trong dịch chiết. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài a. Ý nghĩa khoa học  Cung cấp những thông tin khoa học về điều kiện chiết tách, xác định thành phần hóa học của dịch chiết rau má ở Đà Nẵng.  Cung cấp những thông tin, tư liệu làm cơ sở cho việc nghiên cứu sau này. b. Ý nghĩa thực tiễn  Nhằm giúp cho việc ứng dụng rau má ở phạm vi rộng một cách khoa học hơn trong vấn đề chăm sóc sức khỏe.  Giải thích một cách khoa học một số kinh nghiệm dân gian về ứng dụng của rau má.  Tổng hợp kiến thức về hợp chất thiên nhiên phục vụ cho công tác sau này. 6. Cấu trúc đề tài Đề tài gồm trang, ngoài phần mở đầu, kết luận, tài liệu tham khảo còn có các chương sau: Chương 1: Tổng quan, gồm trang Chương 2: Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm, gồm trang Chương 3: Kết quả và thảo luận, gồm trang -5- CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Họ Hoa tán Họ Hoa tán hay họ Cà rốt theo tiếng Latinh là Umbelliferae hay Apiaceae (cả hai tên gọi này đều được ICBN cho phép, nhưng tên gọi họ Cà rốt là mới hơn) là một họ của các loài thực vật thường có mùi thơm với các thân cây rỗng, bao gồm các cây như mùi tây, cà rốt, thì là và các loài cây tương tự khác. Nó là một họ lớn với khoảng 430- 440 chi và trên 3.700 loài đã biết. Tên gọi ban đầu Umbelliferae có nguồn gốc từ sự nở hoa trong dạng "tán" kép. Các hoa nhỏ là đồng tâm với 5 đài hoa nhỏ, 5 cánh hoa và 5 nhị hoa. Họ này có một số loài có độc tính cao, chẳng hạn như cây độc cần, là loài cây đã được sử dụng để hành hình Socrates và cũng được sử dụng để tẩm độc các đầu mũi tên. Nhưng họ này cũng chứa nhiều loại cây có ích lợi cao cho con người như cà rốt, mùi tây, ca rum và thì là…. Nhiều loài cây trong họ này, chẳng hạn cà rốt hoang có các tính chất của estrogen (hooc môn sinh dục nữ), và được sử dụng trong y học truyền thống để kiểm soát sinh đẻ. Nổi tiếng nhất trong số loài cây dùng cho việc này là loài Thì là khổng lồ đã tuyệt chủng: A ngụy (chi Ferula hay cụ thể là loài Ferula tingitana). Một số loại cây đáng chú ý của Họ Hoa tán:  Anethum graveolens - thì là  Anthriscus cerefolium - hồi cần  Chi Angelica - bạch chỉ  Apium graveolens - cần tây  Carum carvi - ca rum  Centella asiatica - rau má  Conium maculatum - độc cần  Foeniculum vulgare - tiểu hồi hương  Cuminum cyminum - thì là Ai Cập  Daucus carota - cà rốt  Eryngium - chi nhựa ruồi biển  Myrrhis odorata - điềm một dược  Pastinaca sativa - củ cải vàng  Petroselinum crispum - mùi tây  Coriandrum sativum - mùi Tàu  Pimpinella anisum - tiểu hồi cần  Levisticum officinale - cây cần núi -6- 1.2. Tổng quan về cây rau má Rau má là loại rau dại mọc tương đối phổ biến ở các vùng đất nhiệt đới đặc biệt là ở Châu Á. Nó được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: Tích tuyết thảo (Trung Quốc), Phanok (Lào), Trachiek – Kranh (Campuchia), Gotu – Kola (Sri Lanka), Pegagan (Indonesia), Takip – Kohol (Philippine), Bua – Bok (Thái Lan)… Rau má là loại thực vật mọc lan trên mặt đất có lá trông giống như những đồng tiền tròn được xếp nối tiếp nhau nên còn gọi là Liên tiền thảo. Tên khoa học là Centella asiatica (L.) Urb. (Hydrocotyle asiatica L., Trisanthus cochinensis Lour) thuộc họ Hoa tán Apiacece (Umbelliferae). Hình 1.1. Cây ngò tây Hình 1.2. Cây bạch chỉ Hình 1.3. Cây thì là Hình 1.4. Cây độc cần -7- 1.2.1. Vị trí phân loại Theo phân loại khoa học Giới: Plantae Bộ: Apiales Họ: Apiaceae Phân họ: Mackinlayoideae Chi: Centella Loài: C. asiatica 1.2.2. Đặc điểm phân bố Rau má thích hợp mọc ở những nơi ẩm ướt như thung lũng, bờ mương thuộc những vùng có khí hậu nóng ẩm. Ở Việt Nam và các nước nhiệt đới như Lào, Campuchia, Indonesia, Ấn Độ… rau má mọc hoang khắp nơi, thường gặp ở các bãi cỏ, bờ ruộng, ven suối, sườn đồi, những vùng ẩm ướt. Rau má có thể thu hái cả bốn mùa nên khả năng mở rộng diện tích trồng và tăng năng suất rất dễ dàng. Bên cạnh đó, việc trồng rau má không đòi hỏi đầu tư nhiều và việc chăm sóc tương đối dễ dàng. Ở đất bùn, rau má có thể đạt năng suất 1 – 1,2 tấn/ 500m 2 / lứa thu hoạch, ở đất khô thì năng suất khoảng 500kg/ 500m 2 / lứa. Mỗi năm có thể thu hoạch 7 – 10 lứa. 1.2.3. Đặc điểm hình thái Thân rau má gầy và nhẵn, thuộc loại thân bò lan, màu xanh lục hay lục ánh đỏ, có rễ ở các mấu. Nó có các lá hình thận, khía tai bèo rộng 2 – 5 cm, màu xanh với cuống dài và phần đỉnh lá tròn, kết cấu trơn nhẵn với các gân lá dạng lưới hình chân vịt. Các lá mọc ra từ cuống dài khoảng 5 – 20 cm. Bộ rễ bao gồm các thân rễ, mọc thẳng đứng có màu trắng kem và được che phủ bằng các lông tơ ở rễ Hoa rau má có màu từ ánh hồng tới đỏ, mọc thành các tán nhỏ, tròn gần mặt đất. Mỗi hoa được bao phủ một phần trong 2 lá bắc màu xanh. Các hoa lưỡng tính này khá nhỏ (nhỏ hơn 3mm), với 5 – 6 thùy tràng hoa. Hoa có 5 nhị và 2 vòi nhụy, quả có hình Hình 1.5. Cây rau má -8- mắt lưới dày đặc. Quả của nó chín sau 3 tháng. Toàn bộ cây, bao gồm cả rễ thường được thu hái thủ công. 1.2.4. Một số loại rau má a. Rau má lá sen  Tên khoa học: Hydrocotyle bonariensis  Mô tả Rau má thân mọc bò, có rễ ở mấu. Lá mọc so le hoặc tụ tập nhiều lá trên mấu, lá hơi tròn, có khía tai bèo, rộng 2- 3cm, cuống dài 3-5cm, phiến lá xanh, toàn cây khi tươi có mùi hăng, vị đắng. Lá đài nhọn có màu lục, ra hoa từ đầu mùa xuân đến mùa thu. Quả hình bầu dục, dày 1,5- 2mm, rộng 2,5- 3 mm, đáy và đỉnh có khía sống lưng và phần bên gân nổi rõ.  Phân bố và sinh thái: Cây sống dễ trong nước, những nơi đất cát, bờ biển, mương rãnh nhưng cũng chịu được môi trường khô, xuất xứ Nam Mĩ, gần đây phát hiện mọc ở Việt Nam. b. Rau má m  Tên khoa học: Hydrocotyle Sibthorpioides Lam  Tên khác: Rau má họ, rau má chuột.  Mô tả Cây thân cỏ nhỏ, mọc quanh năm, thân mọc bò, mang rễ ở mấu, lá hơi tròn, mép khía răng không đều. Hình 1.6. Rau má lá sen Hình 1.7. Rau má mỡ -9- Cụm hoa nhiều tán mọc ở nách lá, mang hoa màu trắng. Lá và cụm hoa đều có cuống màu trắng dài. Quả dẹt nhẵn hoặc có lông nhỏ.  Phân bố và sinh thái Cây mọc ở những nơi ẩm ướt, ven ruộng, bờ ao Ra hoa vào tháng tư. Rau má mỡ thường gặp mọc hoang khắp nơi ở nước ta và các nước châu Á, Châu Phi, ngoài ra còn phân bố ở Châu Mỹ và Ôxtrâylia. c. Rau má di  Tên khoa học: Hydrocotyle Chinenisis (Cunn) Craib  Tên khác: Rau má rừng.  Mô tả Cây thân cỏ sống dai, có thân dài, cành mọc vươn lên dài 5 -20 cm, có lông mềm, mang ít lá nhẵn, phiến lá hình thận mắt chim, lõm sâu hình tim, chia 5 thùy hình tròn hay khía tai bèo, cuống lá dài, hơi có lông, lá kèm mỏng, hình tròn hay hình trái xoan. Cụm hoa ở nách đối diện với lá, thường đơn độc to hơn lá, cuống tán dài hơn cuống lá, nhẵn hay có lông dài, cuống hoa ngắn. Bao chung có lá bắc nhỏ hình trái xoan, khi nguyên mang khía răng ở gốc, quả khi chín hình tròn, có màu đen, mang vòi ngắn.  Phân bố và sinh thái Cây mọc trên đất ẩm, gần khe suối trong rừng, núi cao. Ra hoa vào mùa thu. Ở nước ta thường gặp ở Cao Bằng, Sơn La, Hòa Bình vào đến KonTum. 1.2.5. Thành phần hóa học Một số nghiên cứu cho thấy thành phần hóa học của rau má rất phong phú (bảng 1.1). Ngoài ra rau má còn chứa Sterol, Saponin, Flavonol, Saccharide, Magnesium, Hình 1.8. Rau má dại -10- Manganese, Potassium, Zinc, các loại vitamin B 2 , B 3 , B 6 và K. Tùy theo khu vực trồng hoặc mùa vụ thu hoạch mà tỉ lệ các hoạt chất trong rau má có thể sai khác nhau. Toàn bộ cây rau má đều chứa tinh dầu, dầu béo. Chất béo chủ yếu là Glyceride của các loại acid: Oleic, Linoleic, Lignoceric, Palmitic và Stearic. Trong rau má còn chứa một lượng Alkaloid Hydrocotylin, chất đắng Vellarin và đặc biệt là Glycoside Asiaticoside. Lượng Asiaticoside này khi thủy phân cho Asiatic acid và Glucose, Rhamnose. Hàm lượng Asiaticoside trong mô rau má theo từng bộ phận khác nhau sẽ chiếm tỷ lệ khác nhau. Trong thành phần hóa học của cây rau má, nhóm Saponin hay còn gọi là Triterpene được xem là nhóm chất đặc biệt có ý nghĩa nhất, nó bao gồm Triterpene acid và Triterpene glycoside. Triterpene acid chứa Asiatic acid, Brahmic acid, Isobrahmic acid, Madecassic acid và Bentulinic acid. Còn hợp chất triterpene glycoside có chứa Asiaticoside, Madecassoside, Brahmoside, Brahminoside và Thankuniside. Đây là nhóm những hoạt chất được nghiên cứu khá nhiều trong lĩnh vực y dược nhằm phục vụ việc chữa bệnh cho con người trong đó phải kể đến vai trò của Asiaticoside và Madecassoside. Asiaticoside là một Triterpene glycoside chiếm hàm lượng nhiều nhất. Asiaticoside là 1-O-acyl-D-glucose pyranose được tìm thấy trong tự nhiên, nó là Trisacharide ester của acid Asiatic. Người ta cho rằng, trong cơ thể Asiaticoside thủy phân thành đường và acid Asiatic – sản phẩm trao đổi chất chịu trách nhiệm trong việc chữa bệnh. Asiaticoside có khả năng kháng khuẩn và hoạt tính diệt nấm chống lại được mầm bệnh và nấm. Asiaticoside giúp chữa lành vết thương nhanh chóng nhờ vào cơ chế kích thích tạo collagen và sự tổng hợp glycosaminoglycan. Hoạt chất Asiaticoside cũng đã được ứng dụng trong điều trị bệnh phong và bệnh lao. Người ta cho rằng trong những bệnh này, vi khuẩn được bao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiễm của cơ thể không thể tiếp cận. Chất Asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làm tan lớp màng mỏng này để hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng. [...]... cần được tách được làm giàu thêm trong dung môi -32- 2.5 Thành phần hóa học trong dịch chiết cây rau má Thành phần hóa học trong dịch chiết cây rau má được xác định bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) Dịch chiết rau má thu được tiến hành cất quay chân không thu được cao rau má Gửi mẫu này tới Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng II, số 2 Ngô Quyền, thành phố Đà Nẵng Phương... sản phẩm chiết xuất từ rau má với công dụng rất tốt như trà rau má Gotu Kola, bột rau má trong viên nang mềm Cendital, kem trị mụn rau má, … Đặc biệt tinh rau má tươi đã được Viện Công nghiệp thực phẩm sản xuất thành công với các chế phẩm rau má tan, rau má FOS… trên thị trường Hiện nay ở Việt Nam, các nghiên cứu về rau má phần nhiều đi theo vào phân tích khả năng kích hoạt các tiến trình sinh học trong... thêm các biện pháp để xác định được chính xác loại hợp chất mới này -36- CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định các chỉ số hóa lý của rau má 3.1.1 Độ ẩm Cây rau má tươi tiến hành xác định độ ẩm Số lượng mẫu được lấy để xác định độ ẩm là 3 mẫu Độ ẩm chung là độ ẩm trung bình của 3 mẫu Kết quả xác định độ ẩm trung bình của mẫu được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết quả xác định độ ẩm STT m1(g)... phong, vẩy nến… Một số công trình khác đi vào nghiên cứu tác dụng của rau má trong tuần hoàn huyết Các hoạt chất của rau má có tác dụng cải thiện vi tuần hoàn ở các tĩnh mạch, mao mạch, bảo vệ lớp áo trong của thành mạch và làm gia tăng tính đàn hồi của mạch máu -18- Gần đây trường Đại học Đà Lạt cũng đã có công trình nghiên cứu khả năng giải độc lá ngón bằng rau má nhưng vẫn chưa có kết quả thuyết phục... bệnh ung thư Phần dịch chiết chứa các Triterpenoids của rau má được cho là có khả năng tiêu diệt được các tế bào ung thư loại lymphoma Dalton và Ehrlich, nhưng vẫn chưa xác định chính xác loại Triterpenoid nào Và các nghiên cứu về cấu trúc hóa học của các triterpenoid trong Centella cũng được đánh giá có thể chống được ung thư nhờ vào hoạt tính đối kháng hoạt động Collagen… Trong rau má, các Triterpenoids... dù có nhiều nghiên cứu về các tác dụng của rau má, vẫn chưa có nhiều công trình đi sâu nghiên cứu việc chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cây rau má nói chung và chất Asiaticoside nói riêng 1.4 Một số bài thuốc từ rau má Chữa trúng thử, say nắng, say nóng: Lấy khoảng 100g rau má tươi, rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước, thêm chút muối ăn, quấy đều cho uống Có thể kết hợp rau má với lá sen... độ Rau má ẩm đã xác định độ ẩm Ngâm chiết Làm sạch, loại tạp Sấy khô (500C) Rau má Xay nhỏ Dung môi: ethylacetate methanol ethanol Bột rau má Nung Dịch chiết Ngâm chiết Dịch Dung môi: chiết ethanol 700 ethanol 800 Ethanol 900 ethanol tuyệt đối Chiết soxhlet Thời gian: 2h 4h 6h 8h Chiết soxhlet Dung môi: ethanol tuyệt đối Thời gian: 6h HNO3 Tro loãng Đo UV - VIS Đo UV - VIS Dịch chiết Đo UV - VIS Dịch. .. Reality) Do đó, rau má thường có trong khẩu phần ăn của những vị thiền sư, những nhà yogi, những nhà thông thái Trên thực tế, rau má tác dụng lên hoạt động của hệ thần kinh trung ương, làm giảm căng thắng tâm lý, tăng cường khả năng tập trung tư tưỡng và giúp cải thiện trí nhớ của người già Từ những năm 1940 y học hiện đại đã bắt đầu nghiên cứu tác dụng của rau má Người ta cho rằng dịch chiết rau má có hiệu... tiểu Rau má còn được dùng để làm thuốc sát trùng, bổ dưỡng, chữa thổ huyết, tả lỵ, khí hư, bạch đới, mụn nhọt, rôm sảy Từ những năm 60 của thế kỷ 20, y học hiện đại đã có những nghiên cứu lâm sàng về tác dụng chữa bệnh của dịch chiết rau má và các hợp chất trong rau má Rất nhiều công trình nghiên cứu đã được thực hiện và công bố Đối với thần kinh Người ta nhận thấy rằng một số hoạt chất trong rau má. .. Lọc lấy dịch chiết, pha loãng rồi đo UV – VIS để lựa chọn dung môi chiết Khảo sát thời gian chiết tối ưu bằng phương pháp chiết soxlet với dung môi đã chọn thu dịch chiết rồi đo UV – VIS Tiến hành quy trình chiết rau má với các điều kiện đã khảo sát được, thu dịch chiết Sau đó dịch chiết được cô quay chân không và để bay hơi tự nhiên rồi định danh bằng phương pháp đo GC – MS -23Quy trình nghiên cứu Đo . ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA    NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT CÂY RAU MÁ HUYỆN HÒA VANG – THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG KHÓA. kiện chiết tách thích hợp.  Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo của một số cấu tử chính trong dịch chiết rau má. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu a. Đối tƣợng nghiên cứu Cây rau. Cây rau má thu hái vào buổi sáng sớm tháng 3 tại huyện Hòa Vang – Thành phố Đà Nẵng. b. Phạm vi nghiên cứu Cây rau má được trồng và thu hái tại Đà Nẵng Nguyên liệu rau má tươi và khô -4-