Đang tải... (xem toàn văn)
Rất Rất Hay!
1 CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis cDNA DNA bổ xung (complementary DNA) DNA Deoxyribo Nucleic Acid dNTP Deoxynucleotid triphotphat EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test IPTG Isopropyl β – D - thiogalactoside PBS Phosphat Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfat SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide TEA Tris – axit acetic – EDTA T.evansi Trypanosoma evansi VAT Variant Antigen Tupe VSG Variant Surface Glucoprotein v/p Vòng/phút 2 DANH MỤC CÁC BẢNG 3 DANH MỤC CÁC HÌNH 4 ĐẶT VẤN ĐỀ 1. Tính cấp thiết của của đề tài Bệnh tiên mao trùng hay còn gọi là bệnh ngã nước trâu bò do Trypanosoma evansi (T.evasi) gây ra. Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982), Phan Địch Lân và cs (2004)[9], Phan Văn Chinh (2006)[3], bệnh tiên mao trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước, với tỷ lệ mắc khá cao: trên trâu là 13 – 30%, trên bò là 7 – 14%, trong đó tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20%. Hậu quả là bệnh gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi do ảnh hưởng đến sản lượng thịt và sức kéo. Trong các hệ thống chẩn đoán bệnh tiên mao trùng hiện nay ở nước ta như: phương pháp chẩn đoán truyền thống, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học, phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử thì phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn. Tuy nhiên hiện tại chúng ta vẫn phải sử dụng Kít nhập ngoại nên giá thành cao, chưa có khả năng cho phép sử dụng rộng rãi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. Ở Việt Nam, vấn đề sản xuất Kít huyết thanh học chẩn đoán bệnh tiên mao trùng còn khá mới mẻ. Hầu hết chỉ tập chung vào xác định hiệu quả chẩn đoán của một số phương pháp phát hiện tiên mao trùng và phương pháp huyết thanh học. Để sản xuất Kít chẩn đoán cần phải có một lượng lớn kháng nguyên RoTAT 1.2, nguồn kháng nguyên này có thể được sản xuất bởi 2 phương pháp: tự nhiên và tái tổ hợp. 5 Kháng nguyên tự nhiên được tách từ ký sinh trùng sau khi tăng sinh trên động vật thí nghiệm. Ưu điểm của phương pháp này là có thể đồng thời tạo ra một lượng lớn kháng nguyên, tuy nhiên kháng nguyên này không tinh khiết, thành phần đa dạng, vì vậy có khả năng gây phản ứng dương tính giả với các kháng thể khác. Trong khi kháng nguyên tái tổ hợp có thể khắc phục được những hạn chế đó. Theo nghiên cứu của Urakawa và cs năm (2001)[32], kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 được sản xuất dựa trên chức năng biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên vào tế bào côn trùng dòng Sf 9. Dòng tế bào tái tổ hợp có khả năng tổng hợp và tiết kháng nguyên vào dịch nuôi cấy tế bào. Khi ứng dụng kháng nguyên RoTAT 1.2 vào sản xuất Kít chẩn đoán, kháng nguyên tái tổ hợp có độ nhạy tương tự như với kháng nguyên RoTAT 1.2 tự nhiên, nhưng có độ đặc hiệu cao hơn tương ứng là 99% và 89,3%. Kết quả này chỉ ra khả năng kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 phát hiện được kháng thể đặc hiệu của Trypanosoma evansi. Như vậy, để chủ động nguồn kháng nguyên tinh khiết để sản xuất Kít chẩn đoán nhanh và chính xác từ đó có biện pháp điều trị kịp thời và hiệu quả bệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam thì vấn đề nghiên cứu chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp sản xuất kít phát hiện kí sinh trùng Trypanosoma evanci gây bệnh trên gia súc và đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả là vấn đề cấp thiết. Với mục tiêu sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trong nước chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc”. 2. Mục tiêu của đề tài 2.1. Mục tiêu chung 6 Sản xuất được Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng tại Việt Nam có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Sản xuất được kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi - Tạo được bộ Kit CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về biểu hiện các gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evanci và ứng dụng để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài chế tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc tại Việt Nam, nhằm phục vụ cho việc chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho gia súc, góp phần nâng cao năng suất chăn nuôi. 7 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tiên mao trùng và bệnh tiên mao trùng ở gia súc Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt Nam. Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong cả nước. Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra. Trâu, bò, ngựa mắc bệnh dễ chết hoặc thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năng sinh sản và sức sản xuất. 1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng 1.1.1.1. Vị trí của tiên mao trùng Trypanosoma trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [5], vị trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau: Ngành Sarcomastigophora Phân ngành Mastigophora Lớp Zoomastigophorasida Bộ Kinetoplastorida Phân bộ Trypanosomatorida Họ Trypanosomatidae Donein, 1901 Giống Trypanosoma Gruby, 1843 Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (M) theileria Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901 Loài Trypanosoma (H) leisi Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909 Loài Trypanosoma (S) cruzi 8 Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918 Loài Trypanosoma (D) vivax Loài Trvpanosoma (D) uniform Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (N) congolense Loài Trypanosoma (N) siminae Loài Trypanosoma (N) vanhogi Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906 Loài Trypanosoma (T) brucei Loài Trypanosoma (T) gambience Loài Trypanosoma (T) rhodesiense Loài Trypanosoma (T) equiperdum Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964 Loài Trypanosoma (P) suis Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843 Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885) Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T. brucei, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. gambiense, T. siminae, T. vivax. 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng Tiên mao trùng T. evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 μm (trung bình là 25 μm), chiều rộng 1,5 - 2μm. Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân nhọn. Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T. evansi cũng giống như cấu trúc của các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae. Cấu trúc từ ngoài vào trong được chia thành 3 phần chính: 9 - Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare, 1972 [27]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [7]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]). - Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới golgi. - Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa DNA, hình bầu dục hoặc hình trứng. Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân, về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa DNA (KADN). Từ kinetoplast có một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [27]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4]). 1.1.1.3. Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi * Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi trong quá trình sống ký sinh. Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết thanh thỏ tối miễn dịch với T. evansi, Kageruka (1982) đã phát hiện tới 30 thành phần kháng nguyên khác nhau. Có ba loại kháng nguyên không biến đổi ở màng nguyên sinh chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein): ISG 65, ISG 75 và ISG 100. Do cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưa nước, các loại này không kết hợp với kháng thể của vật chủ (Nolan, 1997). 10 * Kháng nguyên biến đổi Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG (Variant Surface Glycoprotein), những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi. Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins (1969) đã phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt. Cross (1975) đã mô tả lớp áo bề mặt của tiên mao trùng có thành phần là glycoprotein bao phủ toàn bộ bề mặt tế bào bằngmột lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên mao trùng có 107 phân tử). Lớp áo bề mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo ra kháng thể đặc hiệu với từng type kháng nguyên biến đổi VAT (Variable Antigen Type). Chỉ có kháng nguyên biến đổi mới có khả năng kích thích vật chủ tạo miền dịch chủ động. Người ta ước lượng rằng, một con tiên mao trùng có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG, nghĩa là 5 - 10% số gen của tiên mao trùng cung cấp cho kháng nguyên bề mặt này. Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ. Tuy nhiên, Van Meirvenne (1975) cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trước khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ). Theo Hajduc và Vickernlan (1981), hiện tượng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch. Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng. Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất. * Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt (VSG), làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy [...]... vào phản ứng chuỗi Polymerase để xác định sự có mặt gen AND của tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh Mullis và cs (1986) đã thiết lập qui trình phản ứng để ứng dụng chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Sau đó, Desquesnes (1996, 2002), Masake (1997) đã ứng dụng phản ứng PCR để chẩn đoán bệnh T evansi ở bò; Almeida (1998) đã ứng dụng chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở dê Phương pháp PCR có độ nhậy và độ đặc... bệnh tiên mao trùng ở nước ta * Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng - Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA) Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát hiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh Phản ứng dựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiên mao trùng Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [12] đã bước đầu ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh tiên. .. tiên mao trùng 1.1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng Các biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa không phải lúc nào cũng phát hiện được Rất nhiều gia súc mang bệnh nhưng khó phát hiện các triệu chứng đặc trưng, nhất là đối với những gia súc mắc bệnh tiên mao trùng mãn tính Đối với gia súc mắc bệnh ở thể cấp tính, các biểu hiện bệnh đặc trưng là sốt cao, bỏ ăn, có triệu chứng thần... lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng như nhau Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày Biểu đồ sóng tiên mao trùng cho thấy, xen kẽ giữa những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt sóng yếu Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng Mỗi đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện. .. khi kháng nguyên bề mặt T evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường, và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các hạt latex là loại kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên. .. gắn kháng thể đơn dòng với kháng nguyên lưu động trong máu động vật nhiễm 26 tiên mao trùng (Nantulya, 1994) Phản ứng này hiện đang được thử nghiệm và đánh giá ở thực địa 1.1.5 Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong những năm gần đầy Nguyên lý: dựa vào... thay đổi kháng nguyên bề mặt của T evansi: đa số các VAT của các kho kháng nguyên khác nhau là khác nhau, chỉ có 8 VAT/26 VAI có hiệu giá kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo với các VAT của các kho kháng nguyên khác Các VAT trội xuất hiện sớm trong 4 tuần lễ đầu nhiễm bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên cứu ứng dụng chế kháng nguyên chẩn đoán Từ đó, tác giả đã tinh chế kháng nguyên. .. theo phương pháp tách tiên mao trùng để dùng trong phản 25 ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao + Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại nhất được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng Globulin (kháng kháng thể) có mang... nguyên bề mặt (epitop surface) Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng lại có nhiều điểm thụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết định của kháng nguyên Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại Kết quả là các hạt latex 23 cùng với kháng nguyên. .. hoàn toàn hoặc từng phần gen; hoặc việc thay thế diễn ra dựa vào sự chuyển đổi gen chứ không phải dựa vào tái tổ hợp gen Trường hợp này được diễn giải như sau: một gen hoạt hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gen khác Do có sự thay thế một phần của gen nên đã tạo ra loại gen phức hợp và đặc trưng 1.1.2 Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng 1.1.2.1 Phân bố của bệnh Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, . Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi và ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở gia súc . 2. Mục tiêu của đề tài 2.1 mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evanci và ứng dụng để sản xuất Kít chẩn đoán bệnh tiên mao trùng. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài chế tạo ra kháng nguyên tái tổ hợp để sản xuất. thời và hiệu quả bệnh tiên mao trùng cho gia súc ở Việt Nam thì vấn đề nghiên cứu chế tạo kháng nguyên tái tổ hợp sản xuất kít phát hiện kí sinh trùng Trypanosoma evanci gây bệnh trên gia súc và