bài giảng công nghệ protein enzyme chương 4 các phương pháp tinh sạch protein enzym

46 598 1
bài giảng công nghệ protein enzyme chương 4 các phương pháp tinh sạch protein enzym

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

1 1 C C á á c phương ph c phương ph á á p tinh p tinh s s ạ ạ ch protein ch protein - - enzym enzym Trong d Trong d ị ị ch chi ch chi ế ế t thô thu đư t thô thu đư ợ ợ c ngo c ngo à à i protein i protein enzyme còn c enzyme còn c ó ó c c á á c protein t c protein t ạ ạ p, c p, c á á c ch c ch ấ ấ t cao t cao phân t phân t ử ử kh kh á á c như polysaccharid c như polysaccharid , acid nucleic , acid nucleic v v à à c c á á c ch c ch ấ ấ t phân t t phân t ử ử nh nh ỏ ỏ như đư như đư ờ ờ ng monose, ng monose, c c á á c ch c ch ấ ấ t lipid, mu t lipid, mu ố ố i kho i kho á á ng v.v ng v.v Đ Đ ể ể lo lo ạ ạ i b i b ỏ ỏ ch ch ú ú ng ph ng ph ả ả i s i s ử ử d d ụ ụ ng ph ng ph ố ố i h i h ợ ợ p nhi p nhi ề ề u u bi bi ệ ệ n ph n ph á á p kh p kh á á c nhau. c nhau. Lo Lo ạ ạ i c i c á á c t c t ạ ạ p ch p ch ấ ấ t t 2 2 Đ Đ ể ể lo lo ạ ạ i b i b ỏ ỏ mu mu ố ố i kho i kho á á ng v ng v à à c c á á c lo c lo ạ ạ i i đư đư ờ ờ ng l ng l à à c c á á c t c t ạ ạ p ch p ch ấ ấ t c t c ó ó phân t phân t ử ử lư lư ợ ợ ng ng th th ấ ấ p ngư p ngư ờ ờ i ta thư i ta thư ờ ờ ng d ng d ù ù ng phương ph ng phương ph á á p p th th ẩ ẩ m t m t í í ch (d ch (d ialysis) ialysis) đ đ ố ố i nư i nư ớ ớ c hay đ c hay đ ố ố i i c c á á c dung d c dung d ị ị ch đ ch đ ệ ệ m loãng ho m loãng ho ặ ặ c b c b ằ ằ ng ng c c á á ch l ch l ọ ọ c qua gel sephadex. c qua gel sephadex. Lo Lo ạ ạ i c i c á á c t c t ạ ạ p ch p ch ấ ấ t t 3 3 Đ Đ ể ể lo lo ạ ạ i b i b ỏ ỏ c c á á c protein t c protein t ạ ạ p v p v à à c c á á c t c t ạ ạ p ch p ch ấ ấ t c t c ó ó phân t phân t ử ử lư lư ợ ợ ng cao kh ng cao kh á á c, c, ngư ngư ờ ờ i ta hay d i ta hay d ù ù ng k ng k ế ế t t h h ợ ợ p nhi p nhi ề ề u bi u bi ệ ệ n ph n ph á á p kh p kh á á c nhau: c nhau: phương ph phương ph á á p p bi bi ế ế n t n t í í nh ch nh ch ọ ọ n l n l ọ ọ c nh c nh ờ ờ t t á á c d c d ụ ụ ng c ng c ủ ủ a nhi a nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ ho ho ặ ặ c pH c c pH c ủ ủ a môi trư a môi trư ờ ờ ng, p ng, p hương ph hương ph á á p k p k ế ế t t t t ủ ủ a a phân đo phân đo ạ ạ n b n b ằ ằ ng mu ng mu ố ố i trung t i trung t í í nh ho nh ho ặ ặ c c c c á á c dung c dung môi h môi h ữ ữ u cơ u cơ , c , c á á c phương ph c phương ph á á p s p s ắ ắ c ký trao đ c ký trao đ ổ ổ i i ion, ion, đi đi ệ ệ n di, n di, phương ph phương ph á á p l p l ọ ọ c gel. c gel. Lo Lo ạ ạ i c i c á á c t c t ạ ạ p ch p ch ấ ấ t t 4 4 M M ộ ộ t trong nh t trong nh ữ ữ ng k ng k ỹ ỹ thu thu ậ ậ t không th t không th ể ể thi thi ế ế u đư u đư ợ ợ c trong vi c trong vi ệ ệ c c t t á á ch chi ch chi ế ế t v t v à à tinh ch tinh ch ế ế protein l protein l à à ly tâm. ly tâm. M M á á y ly tâm đư y ly tâm đư ợ ợ c s c s ử ử d d ụ ụ ng đ ng đ ể ể t t á á ch c ch c á á c ph c ph ầ ầ n kh n kh á á c nhau kh c nhau kh ỏ ỏ i i dung d dung d ị ị ch. N ch. N gư gư ờ ờ i ta g i ta g ọ ọ i pha l i pha l ỏ ỏ ng l ng l à à ch ch ấ ấ t l t l ỏ ỏ ng bên trên k ng bên trên k ế ế t t t t ủ ủ a, pha r a, pha r ắ ắ n m n m à à thư thư ờ ờ ng l ng l ắ ắ ng k ng k ế ế t xu t xu ố ố ng đ ng đ á á y y ố ố ng ly tâm ng ly tâm đư đư ợ ợ c g c g ọ ọ i l i l à à k k ế ế t t t t ủ ủ a. Th a. Th ự ự c ch c ch ấ ấ t, s t, s ự ự ly tâm tăng t ly tâm tăng t ố ố c đ c đ ộ ộ k k ế ế t t t t ủ ủ a c a c ủ ủ a nh a nh ữ ữ ng ti ng ti ể ể u ph u ph ầ ầ n r n r ắ ắ n nh n nh ờ ờ l l ự ự c ly tâm. S c ly tâm. S ự ự sai kh sai kh á á c v c v ề ề t t ỷ ỷ tr tr ọ ọ ng c ng c ủ ủ a nguyên li a nguyên li ệ ệ u lơ l u lơ l ữ ữ ng so v ng so v ớ ớ i ch i ch ấ ấ t l t l ỏ ỏ ng c ng c à à ng l ng l ớ ớ n n th th ì ì t t ố ố c đ c đ ộ ộ k k ế ế t t t t ủ ủ a s a s ẽ ẽ c c à à ng cao. M ng cao. M ặ ặ c d c d ầ ầ u ngư u ngư ờ ờ i ta coi s i ta coi s ố ố vòng quay trong m vòng quay trong m ộ ộ t ph t ph ú ú t l t l à à đơn v đơn v ị ị thông thư thông thư ờ ờ ng c ng c ủ ủ a l a l ự ự c ly c ly tâm, n tâm, n hưng quy ư hưng quy ư ớ ớ c c ấ ấ y không th y không th ỏ ỏ a mãn. a mãn. C C á á c k c k ỹ ỹ thu thu ậ ậ t thông thư t thông thư ờ ờ ng ng trong tinh s trong tinh s ạ ạ ch protein ch protein Ly tâm Ly tâm 5 5 C C ó ó nh nh ữ ữ ng nguyên t ng nguyên t ắ ắ c đ c đ ể ể l l à à m vi m vi ệ ệ c an c an to to à à n hơn v n hơn v ớ ớ i m i m á á y ly tâm đ y ly tâm đ ố ố i v i v ớ ớ i i ngư ngư ờ ờ i thao t i thao t á á c c c c ũ ũ ng như đ ng như đ ố ố i v i v ớ ớ i i nguyên li nguyên li ệ ệ u đư u đư ợ ợ c x c x ử ử lý m lý m à à l l ú ú c th c th í í nghi nghi ệ ệ m c m c ầ ầ n ch n ch ú ú ý tuân th ý tuân th ủ ủ . . Đ Đ ó ó l l à à nguyên t nguyên t ắ ắ c cân b c cân b ằ ằ ng đ ng đ ố ố i x i x ứ ứ ng khi ly ng khi ly tâm v tâm v à à thăng b thăng b ằ ằ ng m ng m á á y ly tâm y ly tâm khi khi đ đ ặ ặ t m t m á á y l y l à à m vi m vi ệ ệ c. c. Ly tâm Ly tâm 6 6 Do t Do t í í nh ch nh ch ấ ấ t không b t không b ề ề n v n v ớ ớ i nhi i nhi ệ ệ t c t c ủ ủ a ph a ph ầ ầ n l n l ớ ớ n n c c á á c protein enzyme, khi t c protein enzyme, khi t á á ch chi ch chi ế ế t tinh ch t tinh ch ế ế ch ch ú ú ng, c ng, c ầ ầ n s n s ử ử d d ụ ụ ng ng m m á á y ly tâm l y ly tâm l ạ ạ nh nh . T . T rong rong trư trư ờ ờ ng h ng h ợ ợ p p đi đi ề ề u ki u ki ệ ệ n th n th í í nghi nghi ệ ệ m c m c ó ó h h ạ ạ n ch n ch ế ế , c , c ó ó th th ể ể s s ử ử d d ụ ụ ng m ng m ộ ộ t s t s ố ố phương c phương c á á ch nh ch nh ằ ằ m đ m đ ả ả m m b b ả ả o duy tr o duy tr ì ì m m ẫ ẫ u u ở ở nhi nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ th th ấ ấ p. p. C C ầ ầ n l n l à à m l m l ạ ạ nh nh t t ố ố t m t m ẫ ẫ u v u v à à ố ố ng ly tâm trư ng ly tâm trư ớ ớ c khi ly tâm c khi ly tâm . N . N ế ế u u trong m trong m á á y c y c ó ó c c á á c c ổ ổ đ đ ệ ệ m thay th m thay th ế ế c c ó ó th th ể ể l l à à m m l l ạ ạ nh ch nh ch ú ú ng trong t ng trong t ủ ủ l l ạ ạ nh trư nh trư ớ ớ c khi ly tâm. C c khi ly tâm. C ầ ầ n n ph ph ả ả i ti i ti ế ế n h n h à à nh ly tâm v nh ly tâm v ớ ớ i th i th ờ ờ i gian t i gian t ố ố i thi i thi ể ể u đ u đ ể ể tr tr á á nh n nh n ó ó ng m ng m á á y. C y. C ó ó th th ể ể đ đ ặ ặ t tr t tr ự ự c ti c ti ế ế p m p m á á y ly y ly tâm b tâm b é é v v à à o t o t ủ ủ l l ạ ạ nh, nh, đưa dây d đưa dây d ẫ ẫ n ra ngo n ra ngo à à i qua i qua l l ớ ớ p đ p đ ệ ệ m c m c ủ ủ a c a c á á nh c nh c ử ử a t a t ủ ủ l l ạ ạ nh nh Ly tâm Ly tâm 7 7 Th Th ẩ ẩ m t m t í í ch l ch l à à s s ự ự khu khu ế ế ch t ch t á á n vi phân qua m n vi phân qua m à à ng v ng v ố ố n n không th không th ấ ấ m đ m đ ố ố i v i v ớ ớ i nh i nh ữ ữ ng ch ng ch ấ ấ t keo hòa tan (protein, t keo hòa tan (protein, m m ộ ộ t s t s ố ố c c á á c polysaccharid) c polysaccharid) nhưng th nhưng th ấ ấ m đ m đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c c d d ạ ạ ng d ng d ị ị ch c ch c á á c tinh th c tinh th ể ể .C .C á á c tinh th c tinh th ể ể (c (c á á c mu c mu ố ố i, c i, c á á c h c h ợ ợ p p ch ch ấ ấ t h t h ữ ữ u cơ c u cơ c ó ó tr tr ọ ọ ng lư ng lư ợ ợ ng phân t ng phân t ử ử th th ấ ấ p ) c p ) c ó ó th th ể ể khu khu ế ế ch t ch t á á n qua m n qua m à à ng theo đ ng theo đ ị ị nh lu nh lu ậ ậ t Fick. t Fick. Nư Nư ớ ớ c s c s ẽ ẽ khu khu ế ế ch t ch t á á n t n t ừ ừ dung d dung d ị ị ch c ch c ó ó n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ th th ấ ấ p hơn p hơn (t (t hư hư ờ ờ ng l ng l à à dung d dung d ị ị ch r ch r ử ử a) v a) v à à o dung d o dung d ị ị ch keo, ch keo, trong khi trong khi đ đ ó ó c c á á c ion (cation v c ion (cation v à à anion) v anion) v à à c c á á c ch c ch ấ ấ t phân t t phân t ử ử nh nh ỏ ỏ s s ẽ ẽ chuy chuy ể ể n v n v à à o dung d o dung d ị ị ch c ch c ó ó n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ th th ấ ấ p hơn p hơn (t (t hư hư ờ ờ ng ng chuy chuy ể ể n v n v à à o dung d o dung d ị ị ch r ch r ử ử a). a). Th Th ẩ ẩ m t m t í í ch ch 8 8 Trong qu Trong qu á á tr tr ì ì nh t nh t á á ch chi ch chi ế ế t v t v à à tinh s tinh s ạ ạ ch protein, ch protein, đ đ ể ể lo lo ạ ạ i i mu mu ố ố i ammonium sulphate ra kh i ammonium sulphate ra kh ỏ ỏ i dung d i dung d ị ị ch protein th ch protein th ì ì cho dung d cho dung d ị ị ch protein v ch protein v à à o c o c á á i t i t ú ú i đ i đ ặ ặ c hi c hi ệ ệ u l u l à à m b m b ằ ằ ng ng nguyên li nguyên li ệ ệ u b u b á á n th n th ấ ấ m. m. Thông thư Thông thư ờ ờ ng ngư ng ngư ờ ờ i ta hay i ta hay d d ù ù ng t ng t ú ú i colodion ho i colodion ho ặ ặ c cellophane (lo c cellophane (lo ạ ạ i sau hay đư i sau hay đư ợ ợ c c d d ù ù ng hơn ng hơn ). Sa ). Sa u đ u đ ó ó đ đ ặ ặ t c t c ả ả t t ú ú i v i v à à o b o b ì ì nh ch nh ch ứ ứ a lư a lư ợ ợ ng l ng l ớ ớ n n nư nư ớ ớ c ho c ho ặ ặ c lư c lư ợ ợ ng l ng l ớ ớ n dung d n dung d ị ị ch đ ch đ ệ ệ m đư m đư ợ ợ c pha loãng (v c pha loãng (v í í d d ụ ụ đ đ ệ ệ m phosphate c m phosphate c ó ó pH = 7, n pH = 7, n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ 0,01M). V 0,01M). V ì ì m m à à ng ng cellophane l cellophane l à à m m à à ng b ng b á á n th n th ấ ấ m, c m, c ó ó k k í í ch thư ch thư ớ ớ c l c l ỗ ỗ ch ch ỉ ỉ cho c cho c á á c c ch ch ấ ấ t c t c ó ó phân t phân t ử ử đi qua v đi qua v à à o c o c á á c dung d c dung d ị ị ch đ ch đ ệ ệ m loãng theo m loãng theo đ đ ị ị nh lu nh lu ậ ậ t khu t khu ế ế ch t ch t á á n. n. Như v Như v ậ ậ y, mu y, mu ố ố i s i s ẽ ẽ khuy khuy ế ế n t n t á á n v n v à à o o nư nư ớ ớ c ho c ho ặ ặ c dung d c dung d ị ị ch đêm loãng ch đêm loãng (di chuy (di chuy ể ể n theo hư n theo hư ớ ớ ng ng gi gi ả ả m n m n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ ), ), còn nư còn nư ớ ớ c ho c ho ặ ặ c đ c đ ệ ệ m loãng s m loãng s ẽ ẽ di chuy di chuy ể ể n t n t ừ ừ dung d dung d ị ị ch r ch r ử ử a v a v à à o t o t ú ú i ch i ch ứ ứ a protein. a protein. Th Th ẩ ẩ m t m t í í ch ch 9 9 Protein l Protein l à à nh nh ữ ữ ng đ ng đ ạ ạ i phân t i phân t ử ử không th không th ể ể vư vư ợ ợ t qua t qua t t ú ú i th i th ẩ ẩ m t m t í í ch v ch v à à đư đư ợ ợ c gi c gi ử ử l l ạ ạ i trong t i trong t ú ú i. B i. B ằ ằ ng c ng c á á ch ch thay đ thay đ ổ ổ i thư i thư ờ ờ ng xuyên dung d ng xuyên dung d ị ị ch r ch r ử ử a c a c ó ó th th ể ể t t ẩ ẩ y y s s ạ ạ ch mu ch mu ố ố i ra kh i ra kh ỏ ỏ i protein , m i protein , m ặ ặ c d c d ầ ầ u trong qu u trong qu á á tr tr ì ì nh th nh th ẩ ẩ m t m t í í ch, n ch, n ó ó l l à à dung d dung d ị ị ch đư ch đư ợ ợ c pha loãng c pha loãng hơn hơn . C . C ó ó th th ể ể l l à à m gi m gi ả ả m b m b ớ ớ t ho t ho ặ ặ c lo c lo ạ ạ i tr i tr ừ ừ s s ự ự pha pha loãng như th loãng như th ế ế khi ti khi ti ế ế n h n h à à nh th nh th ẩ ẩ m t m t í í ch dư ch dư ớ ớ i i á á p p su su ấ ấ t, c t, c ó ó ngh ngh ĩ ĩ a l a l à à khi dung d khi dung d ị ị ch đư ch đư ợ ợ c x c x ử ử lý n lý n ằ ằ m m dư dư ớ ớ i m i m ộ ộ t t á á p su p su ấ ấ t th t th ủ ủ y t y t ĩ ĩ nh đ nh đ ầ ầ y đ y đ ủ ủ , , đ đ ể ể dòng th dòng th ủ ủ y y đ đ ộ ộ ng h ng h ọ ọ c c c c ủ ủ a nư a nư ớ ớ c t c t ừ ừ dung d dung d ị ị ch s ch s ẽ ẽ cân b cân b ằ ằ ng s ng s ự ự khu khu ế ế ch t ch t á á n c n c ủ ủ a c a c á á c phân t c phân t ử ử v v à à o dung d o dung d ị ị ch. ch. Phương ph Phương ph á á p n p n à à y thư y thư ờ ờ ng đòi h ng đòi h ỏ ỏ i c i c ó ó thi thi ế ế t b t b ị ị đ đ ặ ặ c c bi bi ệ ệ t. t. Th Th ẩ ẩ m t m t í í ch ch 10 10 Th Th ẩ ẩ m t m t í í ch ch [...]... polisaccharid, acid nucleic, protein) Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích Và hơn thế nữa, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme 21 Phương pháp sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của các protein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên... tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay phương pháp đo quang phổ và xác định đoạt hoạt độ của enzyme 27 Phương pháp sắc ký trao đổi ion * Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex Đó là các loại DEAE - sephadex và CM sephadex Ưu điểm của loại này là vừa tách được protein enzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme Trường hợp CM -... biến trong tách chiết và tinh sạch protein Dịch chiết protein enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết được tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký cột Phương pháp sắc ký (chromatography) là do hai chữ "chroma" là màu sắc và "grapho" là viết, nghĩa là viết bằng màu Thuở ban đầu, người ta sử dụng phương pháp sắc ký để tách các chất màu và chỉ sau... Bằng cách dùng các kỹ thuật hấp phụ và khử hấp phụ bề mặt sẽ làm giảm mạnh thể tích của các dung dịch protein và lượng protein cần tinh sạch sẽ tăng lên từ 90-95% Chất lượng này đủ cho hầu hết các ứng dụng của protein đặc biệt 34 Sắc ký tương tác kỵ nước Các protein sẽ lần lượt được phân tách ra tùy theo tương tác của chúng với một chất mang có chứa các nhóm kỵ nước (ưa béo) Các protein chứa các nhóm... ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có protein enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch 31 Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương pháp sắc ký ái lực (affinity Chromatography)... tách các chất không màu 12 Sắc ký lọc gel Sắc ký lọc gel còn được gọi là phương pháp dùng chất rây phân tử, lọc gel (gel filtration) Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau nhau về kích thước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme. .. đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại protein enzyme Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ các ion thay thế Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động... lớn hơn thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trong NaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient 26 Phương pháp sắc ký trao đổi ion Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu Còn những protein enzyme nào có liên kết... C2H4 - N - (C2H5)2 + H2O Cellulose - O - C2H4 - N+ H- (C2H5)2 + OHĐây là chất trao đổi anion, bản thân tích điện dương 24 Phương pháp sắc ký trao đổi ion Các anionit được áp dụng để phân tích các protein acid có thừa những nhóm carboxyl tự do Sự hấp phụ protein trên những ionit như vậy được tiến hành với những dung dịch đệm có lực ion thấp (0,005 - 0,1M) ở pH 7,5 - 8,5 (các protein acid có chứa các. .. thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt Sephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này là protein enzyme) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các . v à à tinh tinh s s ạ ạ ch protein. ch protein. D D ị ị ch chi ch chi ế ế t protein enzyme đã đư t protein enzyme đã đư ợ ợ c lo c lo ạ ạ i b i b ỏ ỏ ph ph ầ ầ n n l l ớ ớ n c n c á á c protein. 1 1 C C á á c phương ph c phương ph á á p tinh p tinh s s ạ ạ ch protein ch protein - - enzym enzym Trong d Trong d ị ị ch chi ch chi ế ế t thô thu đư t thô thu đư ợ ợ c ngo c ngo à à i protein i protein. nhi ệ ệ t c t c ủ ủ a ph a ph ầ ầ n l n l ớ ớ n n c c á á c protein enzyme, khi t c protein enzyme, khi t á á ch chi ch chi ế ế t tinh ch t tinh ch ế ế ch ch ú ú ng, c ng, c ầ ầ n s n s ử ử d d ụ ụ ng

Ngày đăng: 27/05/2014, 15:16

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan