Đang tải... (xem toàn văn)
THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER tài liệu, giáo án, bài giảng , luận văn, luận án, đồ án, bài tập...
TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG ĐỀ TÀI: THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang Thực hiện: 1. Trương Thu Hồng Nhung 072523S 2. Văn Thị Quế Phương 072529S 3. Nguyễn Thị Thiết 072588S 4. Nguyễn Thị Thanh Trúc 072628S 5. Nguyễn Thị Yến 072667S TP. HỒ CHÍ MINH – 6/2009 Trang 1 MỤC LỤC I. TỔNG QUAN…………………………………………2 I.1. Nguyên liệu………………………………………2 I.2. Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus niger……… 2 I.3. Giới thiệu về enzyme pectinase………………….3 Khái niệm……………………………………… 3 Phân loại………………………………………….3 Đặc điểm………………………………………….3 Cơ chế tác động………………………………… 4 II. THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER ……………………………… 6 II.1. Nguồn thu nhận enzyme pectinase……………….6 II.2. Sơ đồ quy trình……………………………… 11 II.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme pectinase từ nấm mốc Aspergillus niger…………………….14 III. ỨNG DỤNG………………………………………….15 III.1. Làm trong các loại nước ép trái cây…………….17 III.2. Ứng dụng trong sản xuất rượu vang…………….18 III.3. Ứng dụng trong sản xuất cà phê……………… 20 III.4. Một số ứng dụng khác ……………………… 20 Trang 2 I. TỔNG QUAN I.1. Nguyên liệu: Nguyên liệu chính là nấm mốc Aspergillus niger. Môi trường sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme pectinase thường là cám gạo, hay cám mì bã củ cải, khoai tây, cà rốt,vỏ bưởi hoặc thóc mầm… Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối amonium, phosphric… I.2. Giới thiệu vê nấm mốc Aspergillus niger Đại thể của Aspergillus niger Vi thể của Aspergillus niger Aspergillus niger thuộc giống Aspergillus, giống này rất đặc biệt do chúng có hệ bào tử đính (conidiophore). Bào tử đính phát triển từ thành tế bào rất dày ở bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot cell). Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là túi (vesicle). Xung quanh túi là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tư hay thể bình ( sterigmata). Từ bộ cuống đính bào tử ngoài cùng, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính (conidia). Giống nấm này phát triển rất nhiều trong các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trang 3 Nhóm Aspergillus niger gồm khoảng 10 loài. Chúng có màu đen khi quan sát bằng mắt thường do chúng tạo bào tử đính màu đen, nhưng lại có màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại thấp. Đôi khi chúng sinh ra các giọt lỏng màu vàng sáng trên bề mặt khuẩn lạc. chúng có hai bộ cuống đính bào tử và tạo bào tử đính màu nâu, hơi đen và có gai. Túi và sợi cuống thường có màu nâu bóng. Nhóm này không tạo mycotoxin, nhưng một số loài của nhóm này có khả năng gây bệnh. I.3. Giới thiệu về enzyme pectinase Khái niệm : Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân huỷ các polyme pectin. Dưới tác dụng của enzyme pectinase, pectin bị phân huỷ tạo thành các sản phẩm như: acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol… Phân loại: - Dựa vào tính đặc hiệu, cơ chế tác dụng kiểu phản ứng, pH tối ưu của enzyme. Năm 1966, Koller và Neukom phân loại chia pectinase thành hai nhóm chính: hydrolase và transeliminase. Cả hai nhóm này đều có đặc điểm chung là gỉam độ nhớt của dung dịch pectin và làm giảm khối lượng phân tử của các sản phẩm tạo thành. - Dựa vào cơ chế tác dụng của chúng gồm các loại như sau: pectinesterase (PE ), Polymethylgalacturonic ( PMG), polygalacturonase (PG ), Pectate lyase ( PEL). Ngoài ra còn có: pectin-transelimiase (còn gọi là poly - α - 1,4 galacturonite- methylesteglucanoliase) là enzyme tác dụng trên pectin và trên pectinic acid. Polygalacturonate- transelimiase ( còn gọi là poly - α - 1,4 D- galacturonite- glucanoliase) là enzyme tác động trên pectic acid và pectinic acid. Pectin lyase (PNL) xúc tác sự phân cách các đơn vị galacturonate đã bị ester hoá. Tất cả các PNL đều là endo – enzyme. Đặc điểm: Enzyme thuỷ phân pectinase là sản phẩm trong quá trình sống của nấm mốc Aspergillus niger và một số nấm mốc khác. Người ta cấy các chủng nấm mốc này vào trong các môi trường khác nhau, sau đó Trang 4 đem sấy khô, nghiền thành các sản phẩm khô. Từ qúa trình sống của chủng nấm mốc này, người ta không những chỉ thu nhận được enzyme thuỷ phân pectin mà còn thu được nhiều enzyme khác như: cellulase, protease… Các chế phẩm đều có một phức hệ enzyme pectinase như nhau, chỉ khác ở mức độ hoạt động và tỉ lệ của các enzyme. Căn cứ vào đặc điểm này mà ta có thể mà có hướng sử dụng các chế phẩm khác nhau, chẳng hạn chế phẩm có hoạt độ PE và endo – PMG cao thì dùng để xử lý các nguyên liệu giàu pectin. Cơ chế tác động: Pectinesterase ( PE ): Enzyme này xúc tác sự thuỷ phân liên kết ester phức tạp của pectin và protopectin, sản phẩm tạo thành là rượu methylic và acid pectinic hay acid polygalalacturonic. Người ta nhận thấy rằng PE chỉ phân cách liên kết ester giữa các nhóm metoxyl và _COOH tự do. PE tách gốc methyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhóm carboxyl rất linh động, dễ kết hợp với các ion kim loại như Ca 2+ để tạo thành các muối không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng. PE của nấm mốc sẽ thuỷ phân trước tiên là nhóm methylester nằm giữa hai nhóm carboxyl tự do. Và enzyme sẽ thuỷ phân lần lượt các liên kết ester dọc theo phân tử pectin. Và PE của nấm cũng sẽ thuỷ phân pectin và các ester của acid polygalacturonic sâu sắc hơn PE của thực vật. hoạt độ của PE phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hoá của pectin và tỉ lệ thuận với mức độ ester hoá. Chẳng hạn đối với tác dụng của PE từ nấm mốc Asp. Niger cần thiết có pectin ester hoá ở mức độ cao từ 70 % trở lên. pH tối ưu của PE từ nấm mốc là 4.5 -5.5, còn của chế phẩm đã loại bỏ enzymepolygalacturonase sẽ có pH tối ưu từ 2.0 – 6.5. Trái lại, pH tối ưu của PE từ nguồn thực vật thượng đẳng là từ 6.0 – 8.0. Trang 5 Nhiệt độ tối ưu của PE từ nấm mốc là 40 – 45 0 C. Từ 55- 62 0 C thì vô hoạt, trong khi đó nhiệt độ tối ưu của PE từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 60 0 C Các ion kim loại đặc biệt là Na + và Ca 2+ và các muối clorua của chúng sẽ hoạt hoá PE từ nấm mốc Asp.niger. Trái lại , các cation hoá trị 3 và 4 ( thuỷ phân nitrat, FeCl 2 , Al 2 (SO 4 ) 3 ) sẽ kìm hãm tác dụng của PE. Ảnh hưởng của các ion kim loại khi kích hoạt enzyme PE có thể có liên quan đến tương tác của nó với cơ chất. Polygalacturonic acid là một chất ức chế cạnh tranh trong phản ứng thuỷ phân nhờ sự xúc tác của PE. Sự liên kết của các ion kim loại và các nhóm carboxylate trong trường hợp này có khuynh trung hoà ảnh hưởng ức chế của cơ chất pectin lên enzyme. Tuy nhiên lượng dư các ion này trên thực tế gây ra sự bất hoạt của PE vì các ion kim loại bị bao vây bởi các nhóm carboxylate nằm kế cận với các liên kết ester cần thiết cho phản ứng thuỷ phân xảy ra. Polymethylgalacturonase ( PMG): Là enzyme tác động trên acid polygalactyronic đã được metoxyl hoá ( tức là pectin). Enzyme này có tên hệ thống là poly- α - 1,4 galacturonic – methylesterglucanohydrolase ( E.C.3.2.1.41), lại được chia thành hai nhóm nhỏ: Endo – glucosidase – polymethylgalacturonase kiểu 1 (Endo PMG I) : Là enzyme dịch hoá, pectin có mức độ metoxyl càng cao thì bị thuỷ phân bởi enzyme này càng nhanh và càng có hiệu quả cao. Trong dung dịch khi có mặt của enzyme pectinesterase thì hoạt độ của enzyme này thường bị giảm. Enzyme này phổ biến ở một số nấm mốc như: Asp.niger, Asp.awamori,Botrytis cinerea… Exo – glucosidase – polymethylesterase kiểu III ( Exo- PMG-III): Là enzyme đường hoá, enzyme này có thể cắt từng acid galacturonic ra khỏi pectinic hay pectin. Exo – PMG- III có ái lực với các gốc acid galacturonic đã được metoxyl hoá nghĩa là phân cắt liên kết α - 1,4 Trang 6 glucoside ở đầu mạch nằm giữa hai gốc acid galacturonic có nhóm _COOCH 3 . Polygalacturonase ( PG) : Là enzyme tác dụng trên acid pectinic hoặc pectic. PG lại được chia thành hai nhóm nhỏ: Endo – glocosidase – polygalacturonase kiểu II (Endo – PG II): Là enzyme dịch hoá, enzyme này có thể thuỷ phân acid pectinic hay acid pectic và chỉ tác dụng khi có mặt nhóm _COOH tự do. Hoạt độ của Endo-PG II sẽ tăng lên nhiều khi cơ chất được xử lý sơ bộ bằng pectinesterase. Đa số vi khuẩn và nấm mốc là những vi sinh vật tổng hợp được enzyme này. Exo – glucosidase – polygalacturonase kiểu IV ( Exo-PG- IV): Enzyme này thường có ái lực mạnh đối với các liên kết glucoside ở cuối mạch phân tử acid pectinic hay acid pectic nhưng bên cạnh đó không có nhóm methyl. Có lẽ để tạo được phức enzyme - cơ chất thì trong phân tử cơ chất phải có nhóm carboxyl tự do liền kề với liên kết bị đứt. Pectate lyase ( PEL): Năm 1960, P. Abershim lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân huỷ phân tử pectin không bằng con đường thuỷ phân. Enzyme tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase. Enzyme này xúc tác phá vỡ mối liên kết α - 1,4 glucoside, tiến tới làm mất hoạt tính nguyên tử hydro ở C5, tạo thành mối liên kết đôi giữa C4 và C5. Dựa trên cơ chế tác dụng của pectate lyase, người ta chia nó thành hai nhóm: Endo – pectatelyase: Tham gia thuỷ phân phân tử polygalacturonic ở chỗ khác nhau của dãy tạo nên acid galacturonic. Exo – pectatelyase: Tham gia phân huỷ thành phần mạch vòng của acid digalacturonic. Pectate lyase (PEL ) là enzyme vi sinh vật ngoại bào II. THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER Trang 7 II.1. Nguồn thu nhận enzyme pectinase Thực vật: Enzyme pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, trong một số quả khác Thường là có nhiều enzyme pectinesterase (PE ). - Đặc điểm của pectinesterase thực vật: Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm trong phần vỏ tế bào. PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu trong khoảng pH hơi kiềm. Các cation kim loại ở nồng độ thấp, như Ca 2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tăng nồng độ hoạt động của enzyme. Các PE có nguồn gốc thực vật phản ứng theo kiểu làm hình thành các khối pectin chứa các nhóm carboxylate dọc theo mạch pectin. Vi sinh vật: Nhiều vi sinh vật trong đất, trong nước có khả năng phân giải pectin. Chúng có ý nghĩa quan trọng không những đối với vòng tuần hoàn carbon trong tự nhiên mà còn đối với một số ngành sản xuất công nghiệp (ngâm đay, gai, làm bia, làm giấy…). Một số vi sinh vật có khả năng phân giải pectin mạnh mẽ: Aspergillus ficcum, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Clostridium roserum… - Đặc điểm của E. pectinase ở vi sinh vật: Tất cả các vi sinh vật để thu nhận enzyme pectinase đều là hiếu khí. Sự phân bố các kiểu enzyme pectinase ở vi sinh vật không giống nhau: có cơ thể chỉ tạo được một enzyme song đa số cơ thể khác lại tạo ra được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau, tuỳ theo loài. Trang 8 Ví dụ: Sac. Fragilis chỉ tạo ra duy nhất một loại enzyme phân giải pectin là endopolygalaturonase. Còn ở nấm mốc Aspergillus niger thường tạo được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau. Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme bản thể. Ngoài ra enzyme pectinase ở vi sinh vật còn khác nhau ở một số tính chất. Aspergillus awamori Clostridium Cơ chất pectin: • Nguồn gốc và cấu tạo: Pectin là hợp chất cao phân tử mạch thẳng có cấu tạo từ sự kết hợp của các acid galacturonic qua các liên kết 1,4- glucoside. Tuỳ thuộc vào nguồn pectin mà pectin có khối lượng phân tử từ 80.000 – 200.000 Da. Pectin không hoà tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác mà hoà tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm, carbonateNatri và trong glycerin nóng. Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm. Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau, trong đó acid pectinic acid là thành phần chủ yếu. các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan. Có thể phân huỷ để cho Trang 9 pectin tan trong nước bằng cách đun nóng pectin trong môi trường acid. Vì thế, các pectin tan thu nhận được là kết quả của sự phân huỷ phân tử pectin không tan và chúng không đồng dạng với nhau. Hợp chất pectin được đặc trưng bởi 2 chỉ số quan trọng là chỉ số methoxyl “MI” biểu hiện cho phần trăm khối lượng nhóm methoxyl –OCH 3 có trong phân tử pectin và chỉ số este hóa “DE” thể hiện mức độ este hóa của các phân tử acid galactoronic trong phân tử pectin. Dựa trên mức độ methoxy hóa và este hóa, trong thương mại chia pectin thành 2 loại: pectin có độ methoxyl hóa cao và pectin có độ methoxyl hóa thấp. Pectin methoxyl hóa cao (High Methoxyl Pectin – HMP): DE >50 % hay MI > 7%. Chất này có thể làm tăng độ nhớt cho sản phẩm. Muốn tạo đông cần phải có điều kiện pH = 3,1 – 3,4 và nồng độ đường trên 60 %. Trang 10 [...]... nghiệp Đại học_ Thu nhận enzyme pectinase từ canh trường Aspergillus niger và sử dụng trong công nghệ sản xuất nước quả - ĐH Tôn Đức Thắng – 01/2009 4 Nguyễn Thị Thu Sang – Bài giảng Công nghệ Protein và Enzyme – ĐH Tôn Đức Thắng – 2009 Tài liệu từ Internet: 1 www.ngoinhachung.net/diendan/sinh-hoc-thuc-pha-m/13109pectin.html 2 http://images.google.com.vn/images?hl=vi&q =aspergillus %2 0niger& um=1&ie=UTF-8&sa=N&tab=wi... vật mà không làm thay dổi bản chất enzyme nên thường sử dụng trong các thí nghiệm thu nhận enzyme từ canh trường nấm sợi * Trích ly: Thực hiện bằng dung môi thích hợp Đa số enzyme thu phân tan tốt trong nước, nên nước là dung môi tốt nhất để chiết rút enzyme Những tế bào nấm mốc đã trưởng thành quá trình trao dổi chất gần như ngừng hẳn, độ thẩm thấu của hệ sợi tăng, enzyme dễ tiết ra môi trường và dễ... thì môi trường sẽ khô nhanh, làm giảm thời gian sinh trưởng của nấm mốc Lúc này nấm mốc sẽ sinh bào tử mạnh, sự tạo enzyme sẽ bị đình trễ, làm giảm hoạt tính của enzyme tạo thành Trong thời gian nuôi cấy, nên giữ ẩm môi trường khoảng 50 – 60 % và thông khí ở 90 – 100 % Nhiệt độ thích hợp để nuối nấm mốc là: 30 – 32 0C Đối với Aspergillus niger nuôi phương pháp bề mặt, ngoài các yếu tố ảnh hưởng trên... vi sinh vật, từ đó ảnh hưởng đến năng suất tổng hợp một enzyme cần thiết nào đó Không những vậy, môi trường dinh dưỡng sẽ có tác động đến các enzyme trong chế Trang 15 phẩm thu được Với chế phẩm enzyme pectinase thu được khi nuôi cấy Aspergillus niger trên môi trường dinh dưỡng khác nhau sẽ khác nhau về pH tối ưu trên cơ chất Sinh tổng hợp enzyme pectinase có mối quan hệ với sự có mặt của chất cảm ứng... Tủa enzyme bằng ethanol 70% Tủa enzyme bằng (NH4)2SO4 bão hoà 70% Hiệu suất thu hồi (%) 0 7751 88 246 0 8025 91 368 *Ly tâm: Sau khi tủa protein ta lấy dịch đem ly tâm bằng máy ly tâm với tốc độ 7000 vòng/ phút II.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme pectinase từ Aspergillus niger: Ảnh hưởng bởi thành phần môi trường: Thành phần môi trường ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật, từ. .. trình: Nguyên liệu Aspergillus niger Xử lý nguyên liệu ( Độ ẩm 50-60%,thông khí 90-100%, t0 30-32 0C) Nhân giống Cấy giống Lên men ( t phòng từ 50-56 giờ ) 0 Nghiền Trích ly ( Tỉ lệ: 5 nước : 1 khối lượng canh trường ) Lọc ( Topt = 50 0C ) Thu dịch pectinase thô Tủa protein ( pHopt = 4.5 ) ( C2H5OH 70 %, (NH4)2SO4 bão hoà Ly tâm 70% ) Pectinase bán tinh khiết Trang 12 Nhân giống: giống Asp Niger sẽ được... vật sau đó là quá trình kĩ thu t như xé nhỏ, nghiền… để tăng năng suất thu nhận dịch quả • Khả năng xay nghiền, làm nhỏ nguyên liệu: làm nhỏ nguyên lliệu là khâu kĩ thu t rất quan trọng, nó quyết định đến hiệu quả tác động của enzyme và hiệu suất thu nhận dịch quả cũng như chất lượng dịch quả Tuỳ theo tính chất cơ lý và cấu tạo của từng loại quả, người ta chọn những phương pháp xử lý quả thích hợp như... phù hợp với từng loại quả rất có ý nghĩa công nghệ Những đặc điểm kĩ thu t sử dụng enzyme cho từng loại quả và cho từng loại sản phẩm phải phù hợp Trang 17 Tuy nhiên việc sử dụng enzyme cũng có những nhược điểm như xảy ra những biến đổi bất lợi về vi sinh vật và vi sinh vật Nếu xử lý trong thời gian ngắn, quá trình oxi hoá và sự nhiễm vi sinh vật không thành vấn đề lớn Nhưng nếu xử lý enzyme trong... cây: Các chế phẩm enzyme thu phân pectin được sử dụng trong sản xuất nước quả Chúng được dùng để làm trong nước quả ép hoặc điều chế nước quả từ các nguyên liệu quả nghiền Cơ chế tác dụng của pectinase là phá vỡ protopectin, chính nó là liên kết giữa các tế bào, sau đó enzyme này tiếp tục phá vỡ nguyên sinh chất tế bào và gây vỡ tế bào quả, giúp nước quả từ các tế bào chảy ra dễ dàng Từ các loại quả,... mặt của chất cảm ứng pectin Ngoài ra các nguồn C, N, P có tác động rất quan trọng đến sự tạo thành phức hệ enzyme này Khảo sát ảnh hưởng thành phần môi trường nuôi cấy đế khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase ta thu được kết quả trên môi trường 6 cám gạo / 4 vỏ bưởi thì enzyme có hiệu suất thu nhận là cao nhất, với hoạt lực chung là 0 9612 UI/ ml chế phẩm Ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy: Theo một . nấm mốc Aspergillus niger Đại thể của Aspergillus niger Vi thể của Aspergillus niger Aspergillus niger thu c giống Aspergillus, giống này rất đặc biệt do chúng có hệ bào tử đính (conidiophore) digalacturonic. Pectate lyase (PEL ) là enzyme vi sinh vật ngoại bào II. THU NHẬN ENZYME PECTINASE TỪ NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER Trang 7 II.1. Nguồn thu nhận enzyme pectinase Thực vật: Enzyme pectinase có nhiều trong. loại enzyme phân giải pectin là endopolygalaturonase. Còn ở nấm mốc Aspergillus niger thường tạo được một phức hệ enzyme pectinase khác nhau. Các enzyme pectinase ở vi sinh vật có thể là enzyme