i GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ==    == ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HUỲNH THỊ THÚY KIỀU TẠO MÔ HÌNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ THỦ TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT CỦA CÁC DỊCH CHIẾT TỪ NẤM HOÀNG CHI GANODERMA COLOSSUM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2007-2011 GVHD: ThS. NGUYỄN THỊ HẢI THANH Nha Trang, tháng 07 năm 2011 ii GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm chỉ dẫn, góp ý và giảng dạy nhiệt tình để tôi có được những kiến thức quý báu vững bước vào chặng đường phía trước. Tôi xin dành lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện CNSH&MT, Trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu, các phương pháp nghiên cứu khoa học để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Viện chăn nuôi suối Dầu, các thầy cô ở tổ nghiên cứu - Viện CNSH&MT đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn đến em Quỳnh Châu, Thị Ngọc và chị Minh Nhật đã quan tâm, nhiệt tình và giúp đỡ để bài luận văn được hoàn thành. Cuối cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè, các bạn lớp 49 Công nghệ sinh học đã động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Huỳnh Thị Thúy Kiều Lớp 49 CNSH – Viện CNSH&MT Trường Đại Học Nha Trang Nha Trang, tháng 07 năm 2011 iii GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Bệnh đái tháo đƣờng (ĐTĐ) 3 1.1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam 3 1.1.2. Phân loại và cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ 4 1.2. Đái tháo đƣờng với y học cổ truyền (YHCT) 6 1.2.1. Quan niệm của y học cổ truyền về ĐTĐ 6 1.2.2. Các thuốc đông y điều trị ĐTĐ 6 1.3. Phƣơng pháp gây mô hình ĐTĐ trên động vật thực nghiệm 7 1.3.1. Một số mô hình gây ĐTĐ mô phỏng ĐTĐ type 1 trên động vật thực nghiệm 7 1.3.2. Streptozocin và ứng dụng trong mô hình ĐTĐ type1 8 1.4. Nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum) 9 1.4.1. Đặc điểm chung 9 1.4.2. Phân bố sinh thái 10 1.4.3. Thành phần hóa học [3] 10 1.4.4. Tác dụng dược lý[7] 13 1.4.5. Tình hình nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của nấm Hoàng chi trên Thế giới và ở Việt Nam 16 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 18 2.1.1. Động vật nghiên cứu 18 2.1.2. Dược liệu nghiên cứu 18 2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 19 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1. Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng theo kiểu mô phỏng ĐTĐ typ 1 23 2.3.2. Phương pháp định lượng glucose huyết 24 2.3.3. Các phương pháp định tính, định lượng các chất có hoạt tính sinh học trong nấm Hoàng chi25 2.3.4. Các phương pháp ngâm chiết 28 2.3.5. Phương pháp nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của dịch chiết trên chuột gây ĐTĐ 28 2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu 29 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Kết quả gây ĐTĐ mô phỏng ĐTĐ typ 1 trên chuột nhắt trắng 31 3.1.1. Nồng độ glucose huyết 31 3.1.2. Khả năng dung nạp glucose 33 iv GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều 3.1.3. Khả năng dung nạp glucose sau khi uống các phân đoạn dịch chiết 34 3.2. Khảo sát một số thành phần hóa học cơ bản của quả thể nấm Hoàng chi Ganoderma colossum 37 3.2.1. Thành phần chất xơ cellulose 38 3.2.2. Thành phần polysacharide tổng số 40 3.2.3. Thành phần triterpenoid tổng số 43 3.2.4. Định tính alkaloid tổng số 45 3.3. Kết quả các quá trình ngâm chiết 47 3.3.1. Chiết bằng nước nóng 47 3.3.2. Chiết phân đoạn 48 3.3.3. Chiết polysacharide thô 51 3.4. Tác dụng hạ đƣờng huyết của các phân đoạn dịch chiết từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum trên mô hình chuột gây ĐTĐ 53 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 56 4.1. Kết luận 56 4.2. Đề xuất ý kiến 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Tài liệu tiếng Việt 57 Tài liệu tiếng Anh 58 v GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT CNT Chuột nhắt trắng ĐTĐ Đái tháo đường STZ Streptozocin β Tế bào beta-đảo tụy Langerhans YHCT Y học cổ truyền WHO World Health Organization vi GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Streptozocin của hãng Santa Cruz 9 Hình 2.1: Chuột nhắt trắng chủng Swiss 18 Hình 2.2: Nấm Hoàng chi (Ganoderma colossum) 18 Hình 2.3: Máy đo đường huyết 19 Hình 2.4: Bộ kít thử 19 Hình 2.5: Máy nghiền mẫu 20 Hình 2.6: Bình hút chân không 20 Hình 2.7: Máy cô quay chân không 20 Hình 2.8: Bình chiết phân đoạn 20 Hình 2.9: Máy đo quang phổ nhiều bước sóng 21 Hình 2.10: Cân phân tích 21 Hình 2.11:Tủ sấy 21 Hình 2.12: Bể ổn nhiệt 22 Hình 2.13: Máy ly tâm 22 Hình 2.14: Sơ đồ nghiên cứu 23 Hình 2.15: Phương pháp lấy máu đo glucose huyết 25 Hình 3.1: Nồng độ glucose huyết ở các lô chuột sau khi tiêm các mức liều STZ 32 Hình 3.2: Gây mô hình ĐTĐ typ 1 bằng STZ 33 Hình 3.3: Khả năng dung nạp glucose huyết của các lô chuột 34 Hình 3.4: Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột sau khi uống dịch chiết 3h 36 Hình 3.5: Quy trình định lượng thành phần chất xơ cellulose 38 Hình 3.6: Hàm lượng (%) chất xơ cellulose của nấm Hoàng chi 39 Hình 3.7: Quy trình định lượng polysacharide tổng số 40 Hình 3.8: Khảo sát khả năng loại protein liên kết polysaccharide của thuốc thử Sevage 41 Hình 3.9: Phản ứng Molish 42 Hình 3.10 Quy trình tách chiết hợp chất triterpenoid tổng số 43 Hình 3.11: Phản ứng Liebermann – Burchard 44 Hình 3.12: Quy trình định tính alkaloid tổng số 45 Hình 3.13: Phản ứng Mayer 45 Hình 3.14: Sơ đồ quy trình thu dịch chiết Hoàng chi bằng dung môi nước nóng 47 Hình 3.15: Dịch chiết nấm Hoàng chi 48 Hình 3.16: Quy trình thu dịch chiết nấm Hoàng chi bằng dung môi cồn 80 0 49 Hình 3.17: Quy trình thu dịch chiết phân đoạn 50 Hình 3.18: Quy trình thu polysacharide thô 51 Hình 3.19: Hiệu suất điều chế các dịch chiết từ nấm Hoàng chi 52 54 Hình 3.21: Cho chuột uống thuốc 55 vii GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ năm 1999 của một số quốc gia [11] 4 31 Bảng 3.2: Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột sau 3h uống gucose 34 Bảng 3.3: Khả năng dung nạp glucose của các lô chuột sau khi uống dịch chiết 3h 35 Bảng 3.4: Hàm lượng (%) thành phần chất xơ cellulose có trong nấm Hoàng chi 38 Bảng 3.5: Khảo sát khả năng loại protein liên kết polysaccharide của thuốc thử Sevage 41 52 53 1 GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều MỞ ĐẦU Đái tháo đường (ĐTĐ) là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị, ngày càng trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Theo dự báo của các chuyên gia y tế từ những năm 90 của thế kỉ 20 “Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa”. Theo WHO, năm 2025 sẽ có 300 - 330 triệu người mắc bệnh, chiếm tỷ lệ khoảng 5.4% dân số toàn cầu, trong đó ĐTĐ type 2 chiếm 85-95%. Với tốc độ phát triển nhanh chóng như hiện nay, bệnh ĐTĐ sẽ trở thành “đại dịch” trên toàn thế giới và là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các nước phát triển. Việt Nam nằm trong số các quốc gia có số người mắc bệnh ĐTĐ tăng nhanh nhất thế giới (PGS.TS Tạ Văn Bình). Số liệu điều tra quốc gia năm 2002-2003 tỷ lệ mắc bệnh trong cả nước là 2.7%. Hiệp hội ĐTĐ quốc tế và WHO phân loại tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ ở Việt Nam nằm trong khu vực các nước có tỷ lệ gia tăng ĐTĐ trong cộng đồng khoảng 2%-4.99%. Với nhu cầu điều trị và dự phòng ĐTĐ, hàng loạt các thuốc tổng hợp đã được các tập đoàn, các công ty dược phẩm nghiên cứu và phát triển như sulfonylurea, các biguanid, thiazolidindion dành cho ĐTĐ type 2 và insulin dành cho ĐTĐ type 1. Tuy nhiên các thuốc có nguồn gốc tổng hợp không phải là giải pháp tối ưu đối với các nước đang phát triển như Việt Nam, do giá thành điều trị cao, đồng thời thuốc có phản ứng phụ và tác dụng không mong muốn. Thuốc có nguồn gốc thảo dược đang là hướng ưu tiên phát triển với ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng, giá thành rẻ, ít tác dụng phụ, dễ được cộng đồng chấp nhận, đặc biệt là các nước kém phát triển và đang phát triển. Một trong số dược thảo đang được quan tâm nhất hiện nay là nấm Linh chi hay còn gọi là Lục bảo Linh chi. Trong Lục bảo Linh chi phải kể đến nấm Hoàng chi với những tính năng thần dược có tác dụng đặc biệt với các triệu chứng suy giảm miễn dịch, căng thẳng thần kinh, suy sụp tinh thần. Điều đáng chú ý là nấm Hoàng chi có tác dụng đặc biệt trong việc loại trừ chất cholesterol trong các thành mạch lọc sạch máu thúc đẩy quá trình lưu thông máu; khôi phục tế bào đảo tụy; cải thiện cơ bản thiểu năng insulin là nguyên nhân chính gây ra bệnh tiểu đường. Nghiên cứu của Lin JM 2 GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều (1995) cho thấy nấm Hoàng chi có tác dụng phục hồi chức năng gan trong bệnh tiểu đường và làm chậm quá trình phát bệnh ở những bệnh nhân mắc bệnh này. Xây dựng các mô hình bệnh lý để thử thuốc có ý nghĩa quan trọng nhằm đáp ứng những tiêu chuẩn về phát triển các sản phẩm thuốc mới của bộ Y tế Việt Nam và WHO. Đã có một số mô hình ĐTĐ được áp dụng ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn cần có sự bổ sung nhằm mục đích hoàn thiện và phong phú các phương pháp đánh giá tác dụng hạ đường huyết của thảo dược. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài “Tạo mô hình đái tháo đường trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum” với các nội dung chính: - Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng bằng Streptozocin - Định tính, định lượng thành phần các chất có trong nấm Hoàng chi: polysaccharide, triterpenoid, alkaloid, cellulose - Thu dịch chiết nấm Hoàng chi - Thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chiết từ nấm Hoàng chi trên chuột nhắt trắng 3 GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh SVTH: Huỳnh Thị Thúy Kiều Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh đái tháo đƣờng (ĐTĐ) Theo WHO, ĐTĐ là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng glucose máu do hậu quả của việc thiếu hoặc mất hoàn toàn insulin hoặc do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin. Các chuyên gia thuộc Uỷ ban chuẩn đoán và phân loại bệnh đái tháo đường Hoa Kỳ đưa ra định nghĩa về bệnh đái tháo đường như sau: Đái tháo đường là một nhóm các bệnh chuyển hóa có đặc điểm là tăng glucose trong máu, hậu quả của sự thiếu hụt bài tiết insulin, khiếm khuyết trong hoạt động của insulin hoặc cả hai. Tăng glucose máu mạn tính thường kết hợp với sự hủy hoại, sự tăng rối loạn chức năng và sự suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim và mạch máu [11,26]. 1.1.1. Tình hình bệnh ĐTĐ trên thế giới và Việt Nam * Trên thế giới: ĐTĐ là bệnh không lây nhiễm có tốc độ phát triển nhanh chóng nhất trên thế giới chủ yếu là các nước đang phát triển. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế thế giới: năm 1995 cả thế giới có 135 triệu người mắc bệnh ĐTĐ chiếm 4% dân số thế giới, đến năm 2010 có 221 triệu người và dự báo đến năm 2025 là 330 triệu người mắc căn bệnh này, chiếm 5.4%. Cũng theo thống kê của WHO, cứ 30 giây lại có một người mắc bệnh ĐTĐ bị cắt cụt chi; mỗi ngày có 5.000 người mất khả năng nhìn do biến chứng về mắt của bệnh ĐTĐ; mỗi năm có khoảng 3.2 triệu người chết vì các bệnh liên quan tới ĐTĐ. Như vậy, ĐTĐ đang là gánh nặng thực sự cho sự phát triển kinh tế, xã hội và sức khỏe của con người toàn thế giới trong thế kỷ 21. Chính vì vậy, WHO đã nhận định rằng: “Thế kỷ XXI là thế kỷ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa mà điển hình là bệnh ĐTĐ. Những gì mà đại dịch HIV/AIDS đã hoành hành 20 năm cuối thế kỷ XX, thì đó sẽ là ĐTĐ trong 20 năm đầu thế kỷ XXI”. [...]... đã sử dụng dịch chi t nấm Hoàng chi để chữa bệnh ĐTĐ type 2 trên chuột nhắt trắng được gây béo phì có khối lượng 58.2±3.4g Chuột bị ĐTĐ type 2 được uống dịch chi t nấm Hoàng chi liều 300mg/kg trong 4 tuần đã giảm 56.76% lượng đường huyết trong máu và cũng giảm được 15% trọng lượng so với lúc bị ĐTĐ Năm 2010, Qian Yang và cộng sự đã sử dụng dịch chi t polysacharide thô được chi t từ nấm Hoàng chi để... chi (Linh chi xanh); Bạch chi (Linh chi trắng) ; Hoàng chi (Linh chi vàng); Tử chi (Linh chi tím) Trong đó, Hoàng chi có tên khoa học là Ganoderma colossum loài đặc biệt quý hiếm, vừa mới phát hiện và đã được nuôi trồng thành công tại Thừa Thiên Huế Trong thư tịch cổ nấm Hoàng chi còn được gọi với tên khác như tiên thảo, nấm trường thọ Về hình thái và cấu trúc nấm Hoàng chi cũng giống các nấm Linh chi. .. Khảo sát thành phần hóa học của quả thể nấm Xử lý mẫu nấm Chi t nước nóng Chi t nước nóng Chi t polysaccharide thô Chi t phân đoạn n-hexan; chloroform; etylacetat Chi t polysaccharide thô DC nhexan DC chlo roform DC etyl acetat DC nước cuối Thử khả năng hạ đường huyết trên chuột ĐTĐ Hình 2.14: Sơ đồ nghiên cứu 2.3.1 Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng theo kiểu mô phỏng ĐTĐ typ 1 Tối ưu hóa liều STZ... nấm Hoàng chi ở Việt Nam Đến năm 2010, nhóm nghiên cứu trường Đại học khoa học, Đại học Huế đã tiến hành xác định một số hợp chất và tác dụng bảo vệ dịch chi t nấm Hoàng chi trên tế bào nấm men khi bị chi u tia cực tím Tuy nhiện, sản phẩm chữa bệnh ĐTĐ từ nấm Hoàng chi được cho là có khả năng điều trị bệnh ĐTĐ nhưng cho đến nay vẫn chưa có một công bố chính thức nào về tác dụng hạ đường huyết của nấm. .. thìa canh… Trong các loại thảo dược chữa bệnh ĐTĐ thì nấm Hoàng chi là một loại thảo dược đã được nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết từ rất lâu và đã đem lại hiệu quả như mong muốn Hikino và cộng sự (1985) lần đầu tiên báo cáo là 2 loại glycan, ganoderan A và B, có trong dịch chi t nước của quả thể nấm Hoàng chi, có tác dụng hạ glucose đáng kể trên chuột gây ĐTĐ bằng alloxan Zhang và Lin (2004) ghi... và cộng sự, 2003) Thêm vào đó, polysaccharide của nấm Hoàng chi ngăn chặn/trì hoãn các biến chứng ở thận cũng như làm chậm việc tăng nồng độ của glucose huyết và làm giảm mức triglyceride trong máu chuột gây tiểu đường bằng streptozocin (Zhang và cộng sự, 2003) Ngoài ra dịch chi t nước từ quả thể nấm Hoàng chi còn làm chậm sự tăng glucose huyết trên chuột béo phì gây đái tháo đường, làm giảm mức độ... ƣơng Các nhà nghiên cứu Viện Y học Bắc Kinh đã tiến hành nghiên cứu trên đối tượng chuột nhắt và đưa ra kết quả dịch chi t cồn ethanol, khi tiêm phúc mạch chuột nhắt trắng với liều 5g/kg thể trọng thì sau 1-2 ngày xuất hiện tác dụng trấn tĩnh thần kinh, làm giảm rõ rệt các hoạt động Tác dụng trấn tĩnh có thể duy trì sau 2 giờ Nấm Hoàng chi còn có tác dụng giảm cơn co giật do nicotin gây ra Tác dụng. .. hưởng hạ đường huyết của các polysaccharide từ nấm Hoàng chi là do đẩy mạnh dòng ion Ca2+ vào trong tế bào β ở đảo tụy và vì vậy giải phóng insulin Xử lý polysaccharide của nấm Hoàng chi trong điều kiện invitro có tác dụng bảo vệ các tế bào đảo tụy gây độc bởi alloxan thông qua việc ức chế sự hoạt hóa của NF-kappa B và làm chậm sự tạo thành các gốc tự do, yếu tố gây ra sự phá hủy đảo tụy (Zhang và cộng... lại hiệu quả cao Tác dụng chống ung thƣ Polysaccharide là hoạt chất chủ yếu có tác dụng tăng cường miễn dịch và kháng u (OkaiS và cs-1983) Phân tử lượng của hợp chất này lớn hơn 104 Tác dụng kháng u phụ thuộc vào cấu tạo của các polysaccharid, chủ yếu phụ thuộc vào sự sắp xếp của các chuỗi phân tử và số lượng nhóm OH trên các chuỗi, thường là các chất có khả năng tan trong nước nóng, có các chuỗi phân... uống các phân đoạn dịch chi t Sau khi cho chuột nhịn đói 12h, chuột được cho uống các phân đoạn dịch chi t từ nấm Hoàng chi Tiếp đó, sau 3h cho uống dung dịch glucose 30% liều 3g/kg Định lượng glucose huyết sau khi uống dung dịch glucose ở các thời điểm 0h, 3h 2.3.2 Phương pháp định lượng glucose huyết a) Nguyên tắc Nguyên tắc hoạt động của phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương . các chất có trong nấm Hoàng chi: polysaccharide, triterpenoid, alkaloid, cellulose - Thu dịch chi t nấm Hoàng chi - Thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chi t từ nấm Hoàng chi trên chuột. trên chuột nhắt trắng và thử tác dụng hạ đường huyết của các dịch chi t từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum với các nội dung chính: - Tạo mô hình ĐTĐ trên chuột nhắt trắng bằng Streptozocin . thiện và phong phú các phương pháp đánh giá tác dụng hạ đường huyết của thảo dược. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài Tạo mô hình đái tháo đường trên chuột nhắt trắng và thử