viện hoá học viện khoa học và công nghệ việt nam 18 Đờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: "nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th" GS. TSKH. Trần Văn Sung 6500 10/9/2007 Hà Nội, 4 - 2006 Bản quyền 2006 thuộc VHH - VAST Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trởng VHH - VAST trừ trờng hợp sử dụng cho mục đích nghiên cứu . viện hoá học viện khoa học và công nghệ việt nam 18 Đờng Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: "nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th" GS. TSKH. Trần Văn Sung Hà Nội, 4 - 2006 Bản thảo viết xong 1/ 2006. Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nớc, mã số KC 10. 25 Danh sách cán bộ tham giathực hiện đề tài Họ và tên Cơ quan công tác Chủ nhiệm đề tài 1. GS.TSKH. Trần Văn Sung Viện Hoá học, Viện KH và CNVN Cán bộ tham gia nghiên cứu 1. PGS. TS. Nguyễn Hữu Định Khoa Hoá Trờng ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội 2. ThS. Nguyễn Việt Thắng nt 3. ThS. Trần Văn Lộc Viện Hoá học, Viện KH và CNVN 4. ThS. Trần Văn Chiến nt 5. ThS. Trần Đức Quân nt 6. CN. Phạm Thị Ninh nt 7. TS. Trịnh Thị Thuỷ nt 8. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh nt 9. TS. Nguyễn Thanh Đạm Bệnh Viện K Hà Nội 10. ThS. Nguyễn Tuyết Mai nt 11. DS. Lê Tiến Dũng XN Dợc phẩm TW I 12. TS. Phùng Thị Vinh Viện Kiểm nghiệm Mục lục Tr 1. Bài tóm tắt 1 2. Phần chính báo cáo 3 2.1. Phần tổng quan 3 2.1.1. Cyclophosphamide 3 2.1.1.1. Cơ chế tác dụng của cyclophosphamide 3 2.1.1.2. Tổng hợp cyclophosphamide 5 2.1.1.3. Tiêu chuẩn của cyclophosphamide đợc mô tả trong các Dợc điển 9 2.1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sử dụng cyclophosphamide tại Việt Nam 11 2.1.1.5. Các dạng sản phẩm chính của cyclophosphamide và nhu cầu về thuốc cyclophosphamide 13 2.1.2. Trích dẫn nội dung thuyết minh của Đề tài 14 2.2. Các kết quả nghiên cứu của Đề tài 19 2.2.1. Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide 19 Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide 28 2.2.2. Nghiên cứu khẳng định cấu trúc hoá học của sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp đợc 29 2.2.3. Kiểm nghiệm sản phẩm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh, BP 2001 32 2.2.4. Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của sản phẩm cyclophosphamide 33 2.2.5. Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm 36 2.2.6. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng thuốc cyclophosphamide pha tiêm 39 2.2.6.1. Đề cơng nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 39 2.2.6.2. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 42 2.2.7. Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide 48 2.2.7.1. Nghiên cứu độ bền của nguyên liệu cyclophosphamide 48 2.2.7.2. Nghiên cứu độ bền của cyclophosphamide ở trong dung dịch nớc 49 2.2.8. Các kết quả khác 50 3. Kết luận và kiến nghị 51 Báo cáo quyết toán tài chính Lời cảm ơn Tài liệu tham khảo 55 1 1. Bài tóm tắt 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một lợng lớn thuốc cyclophosphamide để điều trị ung th và một số bệnh khác có nguyên nhân tự miễn. Theo dự tính, hàng năm số tiền để nhập khẩu cyclophosphamide riêng cho nhu cầu chữa bệnh ung th là khoảng 26 tỉ đồng. Đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th" có mã số KC 10.25 đặt ra các mục đích sau đây: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide có tính khả thi, và tính kinh tế cao. Nghiên cứu độc tính cấp và bán cấp của cyclophosphamide; Kiểm nghiệm cyclophosphamide theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh BP 2001. Nghiên cứu bào chế thuốc cyclophosphamide pha tiêm trên dây chuyền GMP. Thuốc bào chế xong phải đạt tiêu chuẩn thuốc tiêm của Dợc điển Anh BP 2001. Nghiên cứu đánh giá lâm sàng giai đoạn I thuốc cyclophosphamide tổng hợp đợc trên bệnh nhân ung th. 1.2. Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu: 1.2.1. Nguyên liệu: Các hoá chất đợc sử dụng có độ tinh khiết P. A. của hãng Merck, CHLB Đức. 1.2.2. Phơng pháp nghiên cứu: Các phơng pháp dùng để phân tích cấu trúc của cyclophosphamide tổng hợp đợc là hiện đại và phù hợp nh phổ MS, LC/MS, IR và NMR ( 1 H -, 13 C - NMR) đợc thực hiện tại Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các phơng pháp tổng hợp đợc dựa theo patent của Đức, Liên minh Châu Âu, Mỹ có kết hợp với các tài liệu tham khảo khác, đợc thực hiện tại trờng ĐHKHTN - ĐHQG Hà Nội và Viện Hoá học, Viện KH và CNVN. 2 Các phơng pháp nghiên cứu về y dợc đợc sử dụng là những phơng pháp quy chuẩn của Bộ Y tế, đợc thực hiện tại các cơ quan khoa học do Bộ Y tế chỉ định nh Viện Kiểm nghiệm, xí nghiệp Dợc phẩm TW I và bệnh viện K Hà Nội. 1.3. Các kết quả đã đạt đợc: Đã tiến hành nghiên cứu và đề ra đợc quy trình khả thi có hiệu quả kinh tế và ứng dụng quy trình này để tổng hợp 4250 gam cyclophosphamide. Đã đa ra đợc bộ phổ chuẩn của cyclophosphamide tổng hợp đợc gồm: IR, MS, LC/ MS, 1 H -, 13 C - NMR. Sản phẩm cyclophosphamide tổng hợp ra đã đợc nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán cấp, đợc phân tích, kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn Dợc điển Anh BP 2001. Tất cả các tiêu chí đều đạt. Cyclophosphamide đã đợc bào chế thành thuốc bột pha tiêm trên dây chuyền GMP của xí nghiệp Dợc phẩm TW I. Thuốc và nớc cất pha tiêm đạt tiêu chuẩn BP 2001. Thuốc cyclophosphamide đã đợc nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I đối với bệnh nhân ung th tình nguyện tại bệnh viện K Hà Nội. Kết quả: Với liều 750 mg/ m 2 da cơ thể các bệnh nhân đều có đáp ứng một phần. Liều 750 mg/ m 2 da cơ thể là liều sử dụng an toàn. 1.4. Kết luận và kiến nghị Đề tài đã hoàn thành tốt các mục tiêu đã đề ra và theo đúng tiến độ. Thanh quyết toán tài chính theo đúng dự toán và quy định của nhà nớc. Đề nghị Bộ Khoa học và Công nghệ xem xét phê duyệt giai đoạn tiếp theo của Đề tài để nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II và III nhằm đánh giá hiệu quả chống ung th của thuốc và đa ra sản xuất, đáp ứng nhu cầu trong nớc, thay thế thuốc nhập khẩu. 3 2. Phần chính báo cáo 2.1. Phần tổng quan 2.1.1. Cyclophosphamide Cyclophosphamide có tên khoa học là (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino] tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoặc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,O- trimethylendiamidophosphat (I); công thức tổng là C 7 H 15 Cl 2 N 2 O 2 P. H 2 O, khối lợng phân tử là 279,1. Công thức cấu tạo là: HN P O O N H 2 C H 2 C Cl Cl . H 2 O I Tinh thể cyclophosphamide có màu trắng hoặc gần trắng, tan trong nớc, rất dễ tan trong cồn, tan vừa phải trong ete. 2.1.1.1. Cơ chế tác dụng của cyclophosphamide Cyclophosphamide đợc sử dụng nhiều trong lâm sàng với một phổ tác dụng rộng và hiệu quả đối với các bệnh ung th ở ngời. Ngoài lý do về tác dụng điều trị, cyclophosphamide còn có cơ chế tác dụng rất độc đáo và tính chọn lọc trong điều trị. Hiện nay cyclophosphamide là loại thuốc chống ung th đợc sử dụng nhiều nhất trong điều trị hoá chất liều cao với tổng liều lợng dùng là 500 -700mg/m 2 da ngời trong 1 đến 4 ngày. Là một loại hoạt chất dễ mất nitơ, cyclophosphamide đóng vai trò ankyl hoá ADN làm cho ADN không tháo rời đợc, do vậy không tạo thành ARN do đó dẫn tới việc tái sản xuất tế bào bị kìm hãm, trớc hết là đối với 4 các hệ tế bào phát triển nhanh nh các tuyến tiết, da, tuỷ xơng và đặc biệt là các u ác tính [1,2]. Các hợp chất có tính ankyl hoá sẽ tấn công vào quá trình trao đổi chất của a xít nucleic và kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt những tế bào bị bệnh. Tuy nhiên, chúng cũng tấn công cả tế bào lành và ở liều hiệu dụng chúng cũng có độc tính đáng kể. Theo tác giả Charlotte le Roux và cộng sự thì cơ chế alkyl hoá của cyclophosphamide đợc lý giải nh sau [6]: NH P O O N CH 2 CH 2 Cl Cl -H + +H + H 2 N P O O N CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Cl Cl - Cl - H 2 N P O O N CH 2 CH 2 Cl H 2 N P HO O N CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Cl Cl H 2 N P O O N CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 Nu Nu H 2 N P O O N CH 2 CH 2 Nu + Nu - + Nu - H 2 N P O O N CH 2 CH 2 Cl CH 2 CH 2 Nu - Cl - Cyclophosphamide (I) (A) (B) Trong cơ thể cyclophosphamide giải phóng ra chất phosphoramidat (A) một tác nhân alkyl hoá có hoạt tính sinh học. Hoạt tính sinh học của chất ( A ) đợc giải thích qua dãy phản ứng bao gồm: đóng vòng nội phân tử; mở vòng nucleophil. Quá trình này lặp lại hai lần dẫn đến sản phẩm cuối cùng đợc alkyl hoá hai lần ( B ). Tuy nhiên, cơ chế chính xác của quá trình alkyl hoá của chất ( A ) vẫn là vấn đề còn ít đợc biết. Các bớc theo trình tự trên bao gồm các chất azinidin trung gian đã đợc minh chứng bằng các thí nghiệm đơtêrô hoá. Nhng liệu chất ( A ) sẽ tham gia phản ứng alkyl hoá nguyên vẹn hay liên kết P-N sẽ bị cắt trớc khi alkyl hoá thì hiện vẫn còn tranh cãi [6]. Theo nguyên lý về ''dạng vận chuyển" (transport) và '' dạng hoạt tính '' (active form) của một biệt dợc đối với các chất có tác dụng ankyl hoá thì một hoạt chất cần đợc đa vào cơ thể ở ''dạng vận chuyển'' tức là ở dạng cha có hoạt tính. Dạng này sẽ chuyển thành ''dạng hoạt tính'' trong cơ thể và nếu có thể thì ngay tại vị trí 5 cần điều trị có nghĩa là làm tăng độ chọn lọc của thuốc. Ví dụ: Đối với các chất dễ bị loại nitơ thì hợp chất chứa nhóm oxit nitơ (NO) là một '' dạng vận chuyển'' thực thụ. Nguyên lý này đã đợc áp dụng với loại thuốc chữa ung th tiền liệt tuyến là stilbeoestroldiphosphate. Nh đã biết thì trong cơ thể ngời bệnh, tại bộ phận bị ung th có tồn tại một enzym dạng phosphamidasa và phosphatasa có thể thuỷ phân đợc liên kết phosphamide và este của axit phosphoric. Với ý tởng là: độ chọn lọc của thuốc sẽ tăng đáng kể, nếu ''dạng hoạt tính'' đợc tạo thành trực tiếp tại vị trí cần điều trị, ngời ta đã tổng hợp ra chất phosphamide este II để nghiên cứu động dợc học của cyclophosphamide. NP NH O O R 2 R 1 H 2 C H 2 CCl Cl II 2.1.1.2. Tổng hợp cyclophosphamide Cyclophosphamide đã đợc Arnold, Bourseaux và Hirsch [3,4] tìm ra lần đầu tiên năm 1956 trong phòng nghiên cứu của nhà máy Asta với ký hiệu là B518. Việc tổng hợp ra chất này là kết quả của sự mong muốn áp dụng nguyên lý ''dạng vận chuyển" và '' dạng hoạt tính ''. Cyclophosphamide đợc sử dụng trong điều trị ung th từ năm 1958 hoặc 1970 [1]. Ngoài ra, cyclophosphamide còn đợc sử dụng nh một chất ức chế miễn dịch để điều trị các bệnh tự miễn nh nhợc cơ, thấp khớp, lupút ban đỏ và đặc biệt để chống thải ghép trong các ca ghép tạng [19, 24, 25]. Arnold, Bourseaux và Brock [7] đã nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính kháng ung th của hợp chất này. Kết quả thu đợc ở chất cyclophosphamide là rất khả quan về mặt dợc lý và lâm sàng [4]. Cơ chế biến đổi của cyclophosphamide trong cơ thể đã đợc C.L. Roux và cộng sự tiếp tục nghiên cứu [6]. [...]... tài: Xây dựng đợc quy trình công nghệ tổng hợp và tinh chế thuốc cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn Dợc điển Anh (BP- 2001) Nội dung nghiên cứu: + Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế cyclophosphamide + Kiểm tra độ tinh khiết của các hoá chất, dung môi sử dụng + Tinh chế các hoá chất, dung môi sử dụng + Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế sản phẩm trung gian I + Nghiên cứu quy trình tổng hợp. .. tổng Quy trình tổng hợp giai đoạn I hợp giai đoạn I (chất VIII) 1/ 2004 6/ 2004 3 Nghiên cứu quy trình tổng Quy trình tổng hợp giai đoạn II hợp giai đoạn II (chất IX) 6/ 2004 12/ 2004 4 Nghiên cứu quy trình tổng hợp cyclophosphamide cyclophosphamide thô 6/ 2004 12/ 2004 5 Nghiên cứu quy trình tinh chế cyclophosphamide 4250g cyclophosphamide 1/ 2004 12/ 2004 6 1/ 1/ 2004 15/ 1/ 2004 Kiểm tra độ tinh khiết,... Dichloromethane là loại dung môi thích hợp nhất 22 Bảng 3.1: Kết quả nghiên cứu lựa chọn tác nhân thích hợp để tổng hợp cyclophosphamide TT Loại tác nhân Hiệu suất (%) Ghi chú Thích hợp nhất cho phản ứng 1 Triethylamine 78 2 Pyridine 70 3 N,N-dimethylaniline 72 Quy trình II: a/ Tổng hợp bis - (2 - chloroethyl) amine hydrochloride Đợc tổng hợp tơng tự nh ở quy trình I b/ Tổng hợp cyclophosphamide CH2CH2Cl... thích hợp nhất để tổng hợp bis - ( chloroethyl) amine hydrochloride Bảng 2.1: Kết quả nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp để tổng hợp sản phẩm trung gian I TT Loại dung môi dùng cho phản ứng Hiệu suất (%) 1 Dichloromethane 89 2 Chloroform 87 3 1,2-dichloroethane 80 4 Diethyl ether 80 5 Tetrahydrofurane 82 Kết luận: Dichloromethane là loại dung môi thích hợp nhất để tổng hợp sản phẩm trung gian I + Nghiên. .. đã chọn Quy trình I là quy trình có độ ổn định cao, ít sản phẩm phụ, dễ tinh chế, thời gian phản ứng ngắn và cho hiệu suất thu hồi cao để tổng hợp cyclophosphamide Quy trình này có thể áp dụng để tổng hợp cyclophosphamide ở lợng lớn Đã chọn đợc quy trình tinh chế sản phẩm đơn giản để thu đợc cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn nguyên liệu để bào chế thuốc pha tiêm 28 Giá thành của sản phẩm cyclophosphamide. .. việc tổng hợp cyclophosphamide dựa theo bản quy n sáng chế của các nhà khoa học Đức [22 - 24] là tơng đối thuận lợi và có tính khả thi cao Các cán bộ khoa học của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và của trờng Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp cyclophosphamide ở quy mô phòng thí nghiệm theo một số quy trình tổng hợp sau: Các quy trình. .. Kết luận: Thời gian thích hợp cho quá trình tổng hợp cyclophosphamide chỉ nên kéo dài không quá 5 giờ: 2 giờ ở -5 o C và 3 giờ ở nhiệt độ phòng Quy trình III: Phần tổng hợp bis - (2 - chloroethyl) amine hydrochloride đợc thực hiện tơng tự quy trình I b/ Tổng hợp sản phẩm trung gian I O 2 Et3N POCl3 + HO CH2CH2CH2 NH2 CH2Cl2 O P Cl NH + 2 Et3N HCl (Sản phẩm trung gian I) Dung dịch gồm 76g (1 mol) 3-amino-1-propanol... lợng lớn cyclophosphamide Quy trình tinh chế sản phẩm cyclophosphamide: Để thu đợc cyclophosphamide dợc dụng thì vẫn cần phải tinh chế lại sản phẩm cyclophosphamide mà Đề tài đã tổng hợp đợc Qua quá trình nghiên cứu thử nghiệm Đề tài đã chọn đợc giải pháp tối u để tinh chế cyclophosphamide: Loại bỏ tạp chất Kết tinh lại cyclophosphamide trong hỗn hợp dung môi ethanol/ nớc với tỷ lệ 3 : 5 (v/v) Làm khô... 2.1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sử dụng cyclophosphamide tại Việt Nam Khoa Hoá học trờng Đại học Tổng hợp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu các phơng pháp điều chế và cơ chế tác dụng của các hợp chất cơ phốt pho nhằm phục vụ nông nghiệp và y tế [13-15] Cyclophosphamide đã qua bớc nghiên cứu cơ bản trong đề tài ' 'Tổng hợp một số hợp chất cơ kim có hoạt tính sinh lý mạnh'' cấp Bộ Đại học, Trung học 11 chuyên... phù hợp với điều kiện nóng, ẩm và thiếu trang thiết bị chuyên dụng của Việt Nam 27 Đề tài đã tiến hành thử nghiệm lặp lại nhiều lần từng quy trình tổng hợp cyclophosphamide đã nêu ở trên Các kết quả thu đợc là cơ sở cho việc phân tích, so sánh và đánh giá độ ổn định và tính lặp lại của từng quy trình, từ đó đúc kết kinh nghiệm và xây dựng Quy trình công nghệ tối u có thể áp dụng cho sản xuất để tổng hợp . " ;Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th" có mã số KC 10.25 đặt ra các mục đích sau đây: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide. tài: Xây dựng đợc quy trình công nghệ tổng hợp và tinh chế thuốc cyclophosphamide đạt tiêu chuẩn Dợc điển Anh (BP- 2001). Nội dung nghiên cứu: + Nghiên cứu quy trình tổng hợp và tinh chế cyclophosphamide. Nội Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: " ;nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung th" GS. TSKH. Trần Văn Sung