Bộ giáo dục và đào tạo đại học quốc gia hà nội báo cáo tổng kết đề tài kh&cn cấp nhà nớc Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên góp phần phòng chống và điều trị một số bệnh ung th, tim mạch và tiết niệu Chủ trì đề tài: GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt 7053 26/12/2008 hà nội - 2008 1 Báo cáo tóm tắt 1. Tên đề tài: " Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên góp phần phòng chống và điều trị một số bệnh ung th, tim mạch và tiết niệu" Mã số: KHDA 2. Chủ trì đề tài: GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt. 3. Danh sách những ngời thực hiện chính STT Họ và tên Chức vụ Cơ quan 1 GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt Chủ trì đề tài TTCNSH - ĐHQGHN 2 GS. TS. Lê Đình Lơng Chủ trì đề tài nhánh nt 3 TS. Đàm Bạch Dơng Cán bộ NC nt 4 CN. Hoàng Văn Vinh Cán bộ NC nt 5 CN. Vũ Thị Kim Ngân Cán bộ NC nt 6 Ths. Trần Thị Lan Cán bộ NC nt 7 TS. Ngô Anh Cán bộ NC ĐH. Huế 8 PGS. TS. Lê Xuân Thám Cán bộ NC TT Sinh học phóng xạ 9 Ths. Tạ Bích Thuận Cán bộ NC ĐH KHTN 10 Ths. Đoàn Văn Vệ Cán bộ NC nt 11 CN. Trịnh Tam Bảo Cán bộ NC nt 4. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 4.1. Mục tiêu - Xác định tên khoa học của nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên có khả năng dùng làm dợc liệu. - Xác định một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên dự kiến sử dụng trong liệu pháp nấm góp phần tăng cờng khả năng miễn dịch và phòng chống ung th, điều trị bênh tim mạch, tiết niệu bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. 2 4.2. Nội dung - Tiến hành thu mẫu nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên tại một số vùng sinh thái chính của Việt Nam và biên giới Trung Quốc, Lào, Campuchia. Định loại các loài nấm thu đợc bằng các đặc điểm hình thái và sinh học phân tử của một số loài quan trọng. - Phân lập thuần khiết giống gốc nấm để bảo tồn quỹ gen. Xác định khả năng thu nhận sinh khối nấm để cung cấp nguyên liệu nấm ổn định. - Tách chiết, sàng lọc, nghiên cứu một số các hợp chất tự nhiên và một số chất có hoạt tính sinh học chính ở một số chủng nấm quý hiếm. Xác định cấu trúc của một vài chất quan trọng. - Nghiên cứu khảo nghiệm tác dụng của nấm đa niên trong liệu pháp nấm góp phần tăng cờng khả năng miễn dịch và phòng chống ung th, điều trị bệnh tim mạch và tiết niệu. 5. Các kết quả đạt đợc - Nghiên cứu xác định loài nấm đa niên của Việt Nam thuộc các họ Ganodermataceae (2 chi, 13 loài); Hymenochaetaceae (3 chi, 24 loài); Coriolaceae ( 7 chi, 15 loài). Các đặc điểm hình thái và hiển vi của một số loài quan trọng đã đợc mô tả. - Xác định đợc quy trình tách chiết ADN từ nấm Linh chi đơn niên. Đã nghiên cứu sử dụng enzyme giới hạn cắt gen Mn SOD để phân loại và nhận dạng nấm linh chi đơn niên và nấm linh chi đa niên Gau. - Đã nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thể của 5 chủng nấm đa niên Toh, E1, H1, Gs và C1. Sự hình thành bảo tử vô tính cũng nh quả thể của các chủng trên đã đợc mô tả. - Các nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của các chủng E1, Toh, H1, C1, N1 đã đợc nghiên cứu bằng các phơng pháp sắc kí cho thấy chúng rất giàu các chất có hoạt tính sinh học. - Tất các các dịch chiết của 5 chủng nấm đa niên cũng nh hỗn hợp của chúng không gây độc đối với các dòng tế bào đẫ thử nghiệm. Sau khi đợc xử lí với dịch chiết nớc và cồn đã quan sát thấy sự ức chế quá trình tăng sinh của tế bào ung th phụ thuộc vào nồng độ. Việc ứng dụng dịch chiết nấm cho các bệnh nhân tự nguyện bớc đầu đã cho kết quả khả quan. 3 - Góp phần đào tạo 2 nghiên cứu sinh và 1 cử nhân khoa học tài năng theo hớng nghiên cứu của đề tài. - Đã có 02 báo cáo tại Hội nghị quốc tế, 03 báo cáo tại Hội nghị quốc gia và 07 bài báo đăng trên các Tạp chí chuyên ngành. 6. Tình hình kinh phí - Kinh phí đợc cấp: 600 triệu đồng. - Kinh phí đã sử dụng: 600 triệu đồng. Trung tâm Công nghệ Sinh học Giám đốc TS. Dơng Văn Hợp Chủ nhiệm Đề tài GS. TSKH. Trịnh Tam Kiệt Cơ quan chủ trì đề tài Đại học Quốc gia Hà Nội 4 Summary 1. The title project: Study of perennial Ganoderma, polypores mushroom, their main bioactive compounds for health protection and pufification recombinant Taq polymerase for biotechnological research. Code number: KHDA 2. Prject Coordinator: Prof. Dr. Sc. Trinh tam kiet 3. Project members: - Prof. Dr. Sc. Trinh Tam Kiet - Center of Biotechnology, VNU - Prof. Dr. Le Dinh Luong - Center of Biotechnology, VNU - Dr. Dam Bach Duong - Center of Biotechnology, VNU - BA. Hoang Van Vinh - Center of Biotechnology, VNU - BA. Nguyen Thi Kim Ngan - Center of Biotechnology, VNU - BA. Trinh Thi Tam Bao - Center of Biotechnology, VNU - BA. Nguyen Xuan Hung - Center of Biotechnology, VNU - MSC. Tran Thi Lan - Center of Biotechnology, VNU - MSC. Doan Van Ve – College of Science, VNU - MSC. Ta Bich Thuan - College of Science, VNU - Dr. Le Xuan Tham – Center of Radio biotechnology. 4. The objectives and research contents 4.1. The objectives - Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores mushroom base on morphological and molecular characteristica. - Research on main bioactive compounds for health protection (stimulation immune system and antitumor). 4.2. The research contents - Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores mushroom base on morphological and molecular characteristica and maintaining the strains on culture collection. - Research on main bioactive compounds and method to exstract the main bioactive compounds from some important specices. - Study using the abouv exstractions to stimulation immune system and antitumor traitement. 5 5. Main results - There are about 52 specices of the perennial Ganoderma, polypores mushroom had been found (Ganodermataceae – 2 genus, 13 species, Hymenochaetaceae – 3 genus, 24 species, Coriolaceae – 7 genus, 15 species). - The morphological and micropic characteristica of some importan species are discribed and maintaining the strains on culture collection. - Finding the method to extraction DNA of anual Linzi and identification Ganoderma using PCR – RFLP analysis of Mn SOD gene. - The growing and fruiting of the perenial linzhi and polypores strains Toh, E1, H1, Gs and C were studied on Agar medium and Substrat. - The main bioaactive compounds of the strains E1,Toh, H1, N1, C1 were identificative by chromatography methods: MS, HPLC, TLC. - All extracts and their mixtures do not exhibit cytotoxic effect against the tested cell lines. Upon treatement with ethanolic and aqueous extracts, a concentration-dependent inbibition of cell proliferation was abserved. The exstractions were using to treatement of the free willing patients and give the good results. - Six papers have been published and three presentations on National congress and two in Japan and Germany. - Two graduate students is being under the research direction of the project. Center of Biotechnology, VNU Director Dr. Duong Van Hop Prject Coordinator Prof. Dr. Sc. Trinh Tam Kiet Project implementing organization Vietnam National University, Hanoi 6 I. Mở đầu Số lợng các loài nấm đã đợc định danh là 80060 loài (Từ điển nấm, Kirk et al, 2001). Trong đó, số lợng loài nấm lớn (Marcro fungi) có quả thể nhìn thấy bằng mắt thờng khoảng 14 nghìn loài và có thể lên tới 22 nghìn loài (Hawkworth, 2001) trong đó, khoảng 50% các loài có thể ăn đợc bởi các mức độ khác nhau, hơn 2000 loài an toàn (cả các hợp chất trong tế bào và các hợp chất trao đổi thứ cấp đều có tính sinh kháng nguyên yếu và không gây phản ứng phụ ) và khoảng 700 loài đợc cho rằng có các đặc tính dợc liệu. Các số liệu hiện có cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có trọng lợng phân tử lớn nh: Polysaccharide, Pol accharide- Protein, và đặc biệt giàu các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp có trọng lợng phân tử nhỏ hơn.ít nhất có 651 loài và 7 dới loài thuộc 182 chi của các Nấm có đảm đa bào (Heterobasidiomycetes) và Nấm có đảm đơn bào (Holobasidiomycetes) chứa các Polysaccharide có tác dụng dợc liệu (Reshetnikov et al., 2001). Chúng hầu hết là các Glucan với nhiều loài liên kết Glycoside khác nhau nh -1->3, -1->6 và - 1->3) nhng một số thực sự là Hecteroglucan. Một số polysaccharide liên kết với các gốc protein nh phức hợp PSP (Krestin) chiết xuất từ nấm Vân chi (Ttrametes versicolor). Các chất này có tác dụng chủ yếu chống ung th, nhng nằm trong vách tế bào nấm, thờng che lấp bởi thành phần chính của nấm là kitin. Bên cạnh đó, từ nấm lớn hàng trăm các chất có hoạt tính sinh học có trọng lợng phân tử nhỏ hơn cũng đa đợc tách chiết, sàng lọc, nghiên cứu cấu trúc cũng nh hoạt tính sinh học của chúng. Trớc hết phải kể đến các Terpenoit nh ganoderic axit, lucideric axit, ganoderiol, ganodermodiol từ các loài Ganoderma cũng nh các lanostal, sterol, phenol từ hàng loạt các loài nấm lớn khác. Hoạt tính chống ung th, điều hòa hệ miễn dịch, antioxydan, chống viêm nhiễm, chống virus, vi khuẩn, nấm; làm giảm lợng choresterol, mỡ, đờng trong máu cũng đợc nghiên cứu tích cực tại nhiều nớc có nền công nghiệp phát triển [8, 10, 14, 15, 16, 17]. Những nghiên cứu về thành phần loài nấm lớn của Việt Nam đã đợc Trịnh Tam Kiệt và các tác giả khác tiến hành [1, 2, 4, 11, 18, 19] và thống kê toàn bộ vao năm 2001 [2], bao gồm khoảng 1200 loài trong tổng số 2250 loài nấm đợc định tên khoa học . Trong đó có một số loài đợc ghi nhận là có tác 7 dụng dợc liệu nhng cha chỉ ra các đặc điểm sinh học cũng nh tác dụng dợc học của chúng. Một số chủng nấm dợc liệu khác nh Linh chi, Vân chi, Nấm đầu khỉ, Nấm lỗ cũng đợc nhập nội và nuôi trồng thử nghiệm ở một số cơ sở nghiên cứu và nuôi trồng nấm của Việt Nam. Một số sản phẩm nấm nh linh chi khô nguyên cái hoặc cắt lát, bột nấm, chè linh chi cũng đợc sản xuất thử nghiệm và cung ứng cho ngời tiêu dùng. Tuy nhiên, những nghiên cứu kỹ lỡng hơn về thành phần loài, sự phân bố, trữ lợng, khả năng đa vào nuôi trồng các loài nấm dợc liệu mọc tự nhiên của Việt Nam cũng nh xác định chất lợng và tác dụng dợc lí còn cha đợc làm sáng tỏ. Trong khuôn khổ dự án hợp tác với CHLB Đức: Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học ở Việt Nam. Các chất có hoạt tính sinh học chính của gần 100 loài nấm lớn đã đợc nghiên cứu, hơn 50 chất đã đợc xác định tới cấu trúc phân tử, trong đó có khoảng 30 chất có cấu trúc mới cho khoa học đã đợc mô tả [14] . Một số chất có hoạt tính cao, kìm hãm sự hoạt động của tế bào ung th, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng các vi sinh vật gây bệnh, chống viêm có khả năng ứng dụng lớn trong dợc phẩm, mỹ phẩm [12]. Đặc biệt gần đây Cổ linh chi (thc ra chính xác hơn là nấm linh chi đa niên và nấm đa niên) đã đợc đặc biệt lu ý. Vì vậy việc nghiên cứu tích cực thành phần loài , định loại và mô tả các đặc điểm sinh học của chúng trong thiên nhiên cũng nh phân lập thuân khiết dể bảo tồn nguồn gen, bớc đầu định loại chúng bằng sinh học phân tử, nghiên cứu trong môi trờng nuôi cấy, xác định các nhóm chất chất có hoạt tính sinh học chính của một số loài nấm quan trọng, khảo nghiệm việc sử dụng quả thể của các loài này trong liệu pháp nấm đa niên. II. phơng pháp nghiên cứu - Thu thập, xử lý, phân lập và bảo quản nấm theo Trịnh Tam Kiệt (1981), Ryvarden & Gilberson (1986). - Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của các loài Ganoderma theo Lê ỡnh Lơng và cộng sự (2004-2005). - Nghiên cứu hoá các hp chất tự nhiên theo U. Graefer và cộng sự (1991). 8 III. Kết quả nghiên cứu 3.1. Thu mẫu nấm tại một số vùng sinh thái chính của Việt Nam bao gồm: Lào Cai Sapa, Lai Châu, Sơn La, Yên Bái, Tam Đảo, Ba Vì, Cúc Phơng, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Thừa Thiên Huế, Đà Nẵng, KonTum, Đắc Lắc, Đắc Nông. Tổng số mẫu thu đợc khoảng 500 mẫu. + Các mẫu vật trên đã đợc xử lý, sấy khô và bảo quản tại Bảo tàng Nấm Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội. 3.2. Nghiên cứu thành phần loài, định loại và mô tả các loài quan trọng của Việt Nam + Nghiên cứu đặc điểm hình thái quả thể, sợi, bào tử dới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử quét của khoảng 15 chủng. + Bớc đầu định loại và mô tả các loài thờng gặp. Các số liệu nghiên cứu cho thấy tập đoàn nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên chủ yếu của Việt Nam khá phong phú: * Thnh phn loi nm a niờn ó ghi nhn c ti Vit Nam (Theo Ainsworth & Bisby: Dictionary of the Fungi 1995 v Trnh Tam Kit v cỏc tỏc gi khỏc: Checklist of plant species of Vietnam, Fungi p.51 393, 2001). Ngành Basidiomycota Lp Basidiomycetes Di lp Holobasidiomycetidae B Ganodermatales H Ganodermataceae ( Donk) Donk, 1948 Chi Ganoderma Karst., 1881 Di chi Elfvingia (12 species) 1. Ganoderma annulare (Fr.) Gilbn. 2. G. applanatum (Pers.) Pat 3. G. australe (Fr.) Pat. 9 4. G. cf. brownii (Murr.) Gilbn. 5. G. gibbosum (Blume & Nees, Fr.) Pat. 6. G. lobatum (Schw.) Atk. 7. G. oroflavum (Lloyd) Humph. 8. G. philippii (Bres & Henn.) Bres. 9. G. tornatum (Pers.) Bres. 10.G. cf. triangulum Zhao & Xu 11. G. cf. ungulatum Zhao & Zhang 12. Ganoderma sp.1 13.Ganoderma sp.2 Chi Tomophagus Murr., 1905 1. Tomophagus collossus Murr. Bộ Hymenochaetales Họ Hymenochaetaceae Imazeki & Toki, 1954 Chi Phellinus Quell., 1886 (22 species) 1. Phellinus adamantinus (Berk.) Ryv. 2. Ph. bambusinus (Pat.) Pat. 3. Ph. cf. conchatus (Pers.: Fr.) Pat. 4. Ph. contignus (Pers.: Fr) Pat. 5. Ph. extensus (Lev.) Pat. 6. Ph. fastuosus (Lev.) Ryv. 7. Ph. gilvus (Schw.: Fr.) Pat. 8. Ph. hartigii (Allesch. et Schnabl.) Pat. 9. Ph. igniarius (L.: Fr.) Quel. 10. Ph. lamaensis (Murr.) Pat. 11. Ph. linteus (Berk. et Curt.) Teng 12. Ph. nilgheriensis (Mont.) Cunn. [...]... kem chống viêm da và dỡng da đã đợc sản xuất từ hàng chục kg bột tinh chất nấm Một trong những sản phẩm ban đầu đã đợc khảo nghiệm trên ngời tại Bệnh viện Da liễu, Đại học Tổng hợp Jena cho kết quả tốt Quy trình công nghệ tách chi t các hoạt chất chính của các loài nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên khác bớc đầu đã đợc khảo nghiệm Việc sử dụng Liệu pháp nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên để điều trị cho các bệnh. .. tách chi t đợc khoảng từ 2.5 4.5% trọng lợng khô của quả thể nấm Các nhóm chất tự nhiên chủ yếu đã đợc chỉ ra bằng những nghiên cứu trên sắc ký cột, sắc ký bản mỏng, sắc ký khí và nghiên cứu khối phổ cho thấy các chất chi t của nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên rất giàu các hoạt chất Ngoài các chất có trọng lợng phân tử lớn nh: Polysaccharide, Polysaccharide-peptide, Peptaibol thì các chủng nghiên cứu. .. vựng sinh dng v sinh sn Quỏ trỡnh to bo t non, quỏ trỡnh phõn hoỏ m chu nh hng tớch cc ca ỏnh sỏng v nhit trong khi s mc ca si trong iu kin cú ỏnh sỏng v nhit tng i cao thỡ li b c ch mt cỏch rừ rt 3.5 Nghiên cứu một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của một số loài quan trọng Quả thể của 5 chủng nấm Cổ linh chi và nấm Đa niên đã đợc tách chi t trong các dung môi hữu cơ Tỷ lệ các nhóm hoạt chất. .. và cả lợng đờng quá cao trong các bệnh nhân bị bệnh tim mạch và tiết niệu Dịch chi t nấm cũng có tác dụng đáng kể trong việc hạ thấp các chỉ tiêu sinh hoá chỉ điểm các khối u cho các loại khối u khi điều trị riêng rẽ hoặc kết hợp với các liệu pháp khác của y học hiện đại 29 iv Các sản phẩm khoa học đ hoàn thành 4.1 Các công trình đ công bố trên các tạp chí khoa học: Các công trình đã công bố trên các. .. nguyện bị bệnh ung th, tim mạch và tiểu đờng cũng đợc khảo nghiệm và cho kết quả rất khả quan Các bệnh nhân tự nguyện sau khi sử dụng dịch chi t nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên đều tăng cờng thể lực, tăng cân, các chỉ tiêu của tế bào máu cũng nh hệ miễn dịch đợc tăng cờng Những khối u nhỏ có thể bị tiêu giảm, các khối u lớn đợc giữ nguyên kích thớc hoặc tăng chậm và có khi hoá vôi Dịch chi t nấm còn... khoa học Quốc gia: + Nghiên cứu dới chi Elfwingia và chi Tomophagus ở Việt Nam Tạp chí Di truyền & ứng dụng Chuyên san Công nghệ Sinh học 2003 2004 + Nghiên cứu chi Phellinus ở Việt Nam Tạp chí Di truyền & ứng dụng Chuyên san Công nghệ Sinh học 2003 2004 + Nghiên cứu thành phần lòai Nấm đa niên thuộc họ Coriolaceae Tạp chí Di truyền & ứng dụng Chuyên san Công nghệ Sinh học 2003 2004 + Nghiên cứu. .. gia: - Trịnh Tam Kiệt, Trịnh Tam Bảo, Nghiên cứu thành phần loài nấm đa niên của Việt Nam Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản KHKT, 2005 - Lê Xuân Thám, Trịnh Tam Kiệt, Loài nấm Linh chi đỏ mới (Ganoderma thanglongenese), Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản KHKT, 2005 - Phạm Thùy Trang, Nguyễn Hoài Giang, Lê Đình Lơng (2005), Nghiên cứu sử... khiết tại phòng thí nghiệm Các chủng giống gốc Nấm đợc lu trữ tại Bảo tàng Giống Gốc Nấm, Trung tâm CNSH, Đại học Quốc Gia Hà Nội (30 chủng) 11 3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử Bên cạnh việc sử dụng các phơng pháp nghiên cứu hình thái giải phẫu, nghiên cứu các đặc điểm hiển vi quang học cũng nh điện tử, việc thăm dò định loại linh chi đa niên cũng bớc đầu đợc tiến hành Các kết quả ban đầu thu... học 2003 2004 + Nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thể của nấm linh chi Hải miên Tomophagus colossus Tạp chí Di truyền & ứng dụng Chuyên san Công nghệ Sinh học 2003 2004 + Nghiên cứu sự mọc và sự hình thành quả thể của nấm linh chi đa niên (cổ linh chi) Ganoderma australe Tạp chí Di truyền & ứng dụng Chuyên san Công nghệ Sinh học 2003 - 2004 +Trịnh Tam Bảo, Trịnh Tam Kiệt, H.-M Dahse and H.P... Terpenoid (Wolfiporia) 23 Cấu trúc phân tử của các hợp chất tách chi t từ H1 3.6 Nghiên cứu tác dụng của dịch chi t nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên lên tế bào nuôi cấy Invitro của ngời và khỉ * Chun b dch chit lm thớ nghiờm v nh hng i vi cỏc dũng t bo ca ngi v ng vt Chỳng tụi s dng 5 mu cú ngun gc t 5 loi nm l a niờn ca Vit Nam, kớ hiu l H1, H3, E1, N1, P1 chit sut, chỳng tụi ly 300g qu th khụ t mi . tài: " Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên góp phần phòng chống và điều trị một số bệnh ung th, tim mạch và tiết niệu& quot; Mã số: KHDA . định tên khoa học của nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên có khả năng dùng làm dợc liệu. - Xác định một số nhóm chất có hoạt tính sinh học chính của nấm Linh chi đa niên và nấm đa niên dự kiến. dục và đào tạo đại học quốc gia hà nội báo cáo tổng kết đề tài kh&cn cấp nhà nớc Nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên góp phần phòng