Viện Dinh Dỡng Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP ***************** Báo cáo kết nghiên cứu Chuẩn hóa phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D (D2 D3) thực phẩm phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Chủ nhiệm đề tài : Ks Đoàn Thị Hờng 6544 20/9/2007 Hà nội, 2007 Viện Dinh Dỡng Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP ***************** Báo cáo kết nghiên cứu Chuẩn hóa phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D (D2 D3) thực phẩm phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Chủ nhiệm đề tài: Ks Đoàn Thị Hờng Các cán tham gia: C n Nguyễn Thu Hằng Cơ quan chủ trì: Trung tâm kiểm nghiệm VSATTP Cơ quan chủ quản: Viện dinh dỡng Kinh phí: 20 triệu đồng (Nguồn NNS) Hà nôi, 2007 Mơc lơc TT Néi dung Trang Danh mơc c¸c chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Phần 1: Mở đầu Phần 2: Tổng quan Phần 3: Mục tiêu, đối tợng phơng pháp nghiên cứu Mục tiêu Đối tợng Nội dung phơng pháp nghiên cứu Kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng hiệu cao áp Các phơng pháp định lợng HPLC 11 Quy trình phân tích thử nghiệm 13 Phần 4: Kết nghiên cứu 17 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký 17 Xác định LOD 28 Xác định LOQ 28 Xác định khoảng tuyến tính 29 Xác định độ lệch chuẩn hệ số biến thiên 32 Xác định độ thu hồi 35 Một số sắc đồ chạy sắc ký mẫu phân tích 37 Phần 5: Nhận xét bàn luận kết 39 Phần 6: Quy trình phân tích xác định hàm lợng vitamin D thực phẩm phơng pháp HPLC Phần 7: Tài liệu tham khảo 41 10 11 Phần phụ lục: Các sắc đồ dung dịch chuẩn vitamin D2 D3 xây dựng khoảng tuyến tính 45 chữ viết tắt TT Các chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao DAD Detector mảng diôt UV-VIS Quang phổ tử ngoại - khả kiến RDA Nhu cầu ăn khuyến cáo TCVN Tiêu chuẩn Việt nam AOAC Hiệp hội phân tích hoá học LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lợng SD §é lƯch chn 10 Cv HƯ sè biÕn thiªn 11 MeOH Methanol 12 THF Tetra hydrofuran 13 ACN Acetonitril 14 SPE Cét chiÕt pha r¾n 15 TBHQ Tert butyl hydroquinol Danh mục bảng TT Bảng Nội dung bảng Thời gian lu vitamin D2 D3 ®iỊu kiƯn ch¹y cét Waters RP- 18, detector DAD, b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98: 2, tèc độ dòng 1ml/phút Bảng Thời gian lu vitamin D2 chạy cột Inertsil ODS cột Waters RP18, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN : MeOH =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút Bảng Nhận xét sắc đồ hai chất chuẩn cột Inertsil ODS detector DAD b−íc sãng 265nm, Pha ®éng ACN : H2O =75:25, tốc độ dòng 1ml/phút Bảng Nhận xét kết chạy sắc ký hai chuẩn cột Inertsil ODS pha ®éng ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD bớc sóng 265nm, tốc độ dòng 1ml/phút Bảng Thời gian lu hai chất chuẩn tơng ứng với pha động khác tốc độ 1ml/ phút, cét Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm B¶ng Thêi gian lu hai chất ứng với tốc độ dòng khác hệ pha động MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm, cét Inertsil ODS B¶ng Tổng kết điều kiện chạy HPLC phân tích vitamin D Bảng Tơng quan diện tích pic nồng độ chuẩn vitamin D2 Bảng Tơng quan diện tích nồng độ chuẩn vitamin D3 Bảng 10 Xác định hàm lợng vitamin D2 mẫu sữa bột XO Bảng 11 Xác định hàm lợng vitamin D3 sữa Sunny grow baby Bảng 12 Xác định hàm lợng vitamin D sữa chua nestlé có đờng Bảng 13 Xác định hàm lợng vitamin D3 sữa Kappi hộp 100ml Bảng 14 Xác định hàm lợng vitamin D3 sữa bột giầu lợng Bảng 15 Xác định hàm lợng vitamin D sữa đặc có đờng Bảng 16 Kết hàm lợng vitamin D số mẫu khác Bảng 17 Độ thu hồi vitamin D3 Bảng 18 §é thu håi cđa vitamin D2 B¶ng 19 KÕt qu¶ phân tích mẫu sữa bột mẫu DDP4 vật liệu chuẩn Bảng 20 Tổng hợp thông số thẩm định Danh mục hình TT Nội dung hình Phần tổng quan Hình Công thức hoá học, công thức cấu tạo vitamin D2 D3 Hình Sơ đồ chuyển hoá vitamin D thể Phần mục tiêu, đối tợng phơng pháp Hình Mô tả trình chạy sắc ký Hình Sơ đồ mô tả hệ thống HPLC Hình Đồ thị phụ thuộc diện tích chiều cao pic với nồng độ Phần kết nghiên cứu * Khảo sát điều kiện chạy Hình Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cét Waters, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98:2, tốc độ 1ml/ phút Hình Dạng phổ hấp thụ vitamin D2 Hình Sắc đồ chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,08ppm, cét Waters, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98:2, tèc độ 1ml/ phút Hình Dạng phổ hấp thụ vitamin D3 Hình 10 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng ®é 0,04ppm, cét Waters, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é dßng 1ml/ phút Hình 11 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,04ppm, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phút Hình 12 Sắc đồ chuẩn vitamin D3, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút Hình 13 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tốc độ 1ml/ phút Hình 14 Sắc đồ chuẩn vitamin D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tốc độ 1ml/ phút Hình 15 Sắc đồ chuÈn vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc độ 1ml/ phút Hình 16 Sắc đồ hỗn hợp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50:50, tèc ®é 1ml/ phút Hình 17 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10, tèc ®é 1ml/ phút Hình 18 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tèc ®é dòng 1,2 ml/ phút Hình 19 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tốc độ dòng 1,5 ml/ phút Hình 20 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 D2, cột Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tốc độ dòng ml/ phút Hình 21 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tèc ®é dßng 1,2 ml/ phút Hình 22 Sắc đồ chuẩn hỗn hợp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tèc độ dòng 1,5 ml/ phút Hình 23 Sắc đồ vitamin D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tèc ®é dòng 1,5 ml/ phút Hình 24 Sắc đồ vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tèc ®é dßng 1,5 ml/ phút * Xác định khoảng tuyến tính Hình 25 §−êng chuÈn vitamin D2 H×nh 26 §−êng chuÈn vitamin D3 * Sắc đồ chạy mẫu Hình 27 Sắc đồ xác định hàm lợng vitamin D sữa tuơi Kapi Hình 28 Sắc đồ chạy mẫu sữa tơi xác định hàm lợng vitamin D2 Hình 29 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 Hình 30 Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 Phần phụ lục: Các sắc đồ dung dịch chuẩn xây dựng khoảng tuyến tính Hình 31 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,0022ppm Hình 32 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,02ppm Hình 33 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,041ppm Hình 34 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,082ppm Hình 35 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,165ppm Hình 36 Sắc đồ chuẩn vitamin D2 nồng độ 0,33ppm Hình 37 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,0068ppm Hình 38 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,068ppm Hình 39 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,137ppm Hình 40 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,274ppm Hình 41 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,392ppm Hình 42 Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,5ppm Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Phần 1: Mở đầu Để tồn tại, phát triển cải thiện nòi giống, thể cần đợc cung cấp đủ chất dinh dỡng, nguồn cung cấp chất có nhiều thực phẩm ăn vào hàng ngày Các chất dinh dỡng nhóm cung cấp lợng cho thể nh glucid, lipid, protein, nhãm cung cÊp muèi kho¸ng, nhãm cung cÊp loại vitamin nớc Theo quan điểm chuyên gia dinh dỡng giới mà sống tồn hai thái cực khác nhau, bên vực thẳm thiếu ăn bên vực thẳm thừa ăn Sự thiếu ăn đà dẫn đến tình trạng suy dinh dỡng thiếu lợng protein, nhiên với phát triển khoa học tiến tiến giới đời sống ngời dân hầu hết nớc đà đợc cải thiện, không ngừng nâng cao Việt nam với hỗ trợ chơng trình phòng chống suy dinh dỡng, chơng trình VAC cách mạng xanh ngành nông nghiệp đà góp phần to lớn việc tăng cờng an ninh thực phẩm quốc gia, vấn đề đói ăn không điều xúc Hàng năm tỷ lệ suy dinh dỡng đà giảm cách đáng kể Tuy nhiên vấn đề dinh dỡng nảy sinh bệnh mÃn tính liên quan đến dinh dỡng mối quan tâm nhiều ngời Khái niệm thực phẩm chức (thực phẩm chữa bệnh) đà trở nên quen thuộc dần với ngời dân Hiện để giải vấn đề giới nh nớc đà xuất nhiều loại thực phẩm chữa bệnh, thực phÈm bỉ sung vi chÊt dinh d−ìng phơc vơ cho bệnh nhân liên quan Có thể coi thực phẩm chức năng, vai trò thực phẩm bệnh mÃn tÝnh lµ h−íng tiÕp cËn rÊt míi ngµnh dinh dỡng, thức ăn thuốc, thuốc thức ăn [16] Nhật đà có khoảng 192 sản phẩm đợc gọi thực phẩm chức nhằm góp phần vào trì, cải thiện chế độ ăn sức Trang 1/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Bảng 15: Độ thu hồi vitamin D3 TT Tên mẫu Khối lợng mẫu (g) Vitamin D3 0,5ppm nạp vào mẫu (ml) Kết phân tích (mcg/100g) Độ thu hồi (%) Sữa bột 1,0627 KPH S÷a bét 1,0616 0,2 7,5 S÷a chua NestlÐ 10,6565 KPH S÷a chua NestlÐ 10,9003 0,3 1,2 87 S÷a chua NestlÐ 10,3714 0,4 2,3 90 75 Bảng 16: Độ thu hồi vitamin D2 TT Tên mẫu Khối lợng mẫu (g) vitamin D2 Kết phân 0,55ppm nạp tích vào mẫu (ml) (mcg/100g) Độ thu håi (%) S÷a bét 2,9418 KPH S÷a bét 2,7154 0,5 7,5 S÷a chua NestlÐ 10,6565 KPH S÷a chua NestlÐ 10,3441 0,2 0,85 77 Sữa chua Nestlé 10,3440 0,4 1,66 81 75 Bảng 19: Kết phân tích mẫu sữa bột mẫu DDP4 vật liệu chuẩn (5mcg/100g) TT Khối lợng mẫu (g) Kết phân tích (mcg/100g) Độ thu hồi (%) 10,2298 80 10,0523 80 Trang 36/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Một số sắc đồ chạy mẫu phân tích R etention Time Area Name 20 10 40 20 mAU mAU 40 13.383 815694 Vitamin D2 PD A-265n m Vitami n D K ap i 37, 9303g d at 15 20 25 30 Minutes Hình 27: Sắc đồ xác định hàm lợng vitamin D sữa tuơi Kappi Name Retention Time Area Height 75 50 25 0 13.495 70504 2666 Vitamin D2 12.263 1741804 74681 75 mAU 100 PDA-265nm Vitamin D 50 mAU 100 25 10 15 20 25 30 Minutes Hình28 : Sắc đồ chạy mẫu sữa xác định hàm lợng vitamin D2 N am e R eten tion T im e A rea H eight 50 25 0 10 Vitamin D3 13.362 1078034 48379 75 12.323 36256 12.503 42 2038 75 mAU 100 P D A-2 n m V i ta m i n D - 50 25 15 20 25 Min u t e s Hình 29 : Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 Trang 37/46 30 mAU 100 Báo cáo đề tài nghiên cứu Name Retention Time Area Height 25 0.073 609 171 50 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Vitamin D3 13.372 583397 22766 11.630 104480 5663 75 12.520 20077 1237 75 mAU 100 PDA-265nm Vitamin D 12.5 50 25 15.0 17.5 20.0 22.5 Minutes Hình 30 : Sắc đồ chạy mẫu sữa bột xác định vitamin D3 Trang 38/46 25.0 mAU 100 Hà nội 2007 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Phần 5: Nhận xét bàn luận kết Bảng 20: Tổng hợp thông số thẩm định TT Các thông số Kết vitamin D2 Kết vitamin D3 Xác định giới hạn phát 2,2 ppb (LOD) 3,4ppb Xác định giới hạn định ppb lợng (LOQ) 11ppb Xác định khoảng tuyến 0,0022-0,55 ppm 0,0034 - 0,5ppm tÝnh HÖ sè biÕn thiên (Cv %) 5,4 - 6,4 sữa 6,1- 7,3 Xác định độ thu hồi (R 75 - 81 %) 75 - 90 Qua thí nghiệm nghiên cứu có nhận xét nh sau: Phơng pháp phân tích hàm lợng vitamin D có giới hạn phát D2 2,2ppb D3 3,4ppb, giới hạn định lợng vitamin D2 =7ppb vitamin D3 11ppb Kết đáp ứng yêu cầu phân tích hàm lợng vitamin D thực phẩm Qua khảo sát khoảng tuyến tính viatmin D2 D3 cho ta Phơng trình hồi quy tuyến tính mà hệ số tơng quan r > 0,99 điều chứng tỏ khoảng nồng độ đà khảo sát có giá trị diện tích pic phụ thuộc chặt chẽ với nồng độ Hệ số biến thiên khảo sát đợc nh bảng kết cho thấy phù hợp với kỹ thuật phân tÝch ë møc ph¸t hiƯn thÊp ppb HƯ sè thu hồi đạt 75 - 90% mức nồng độ từ 0,01-0,03 ppm điều phù hợp với thực tế hàm lợng vitamin D thấp Trang 39/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Nh phơng pháp xác định vitamin D có độ nhạy tốt, độ xác (độ lặp lại độ thu hồi) đạt yêu cầu áp dụng đợc phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Tuy nhiên nhận thấy việc làm dịch chiết trớc chạy sắc ký cha thực thoả mÃn, nhiều tạp thể sắc đồ Song điều kiện kinh phí hạn chế cha thể tiến hành nghiên cứu khắc phục điều đề tài Trang 40/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Phần Quy trình phân tích xác định hàm lợng vitamin D2 D3 thực phẩm phơng pháp HPLC Nguyên lý phơng pháp Mẫu đợc xà phòng hoá dung dịch kali hydroxid môi trờng ethanol nhiệt độ phòng qua đêm nhiệt độ 75oC Sau chất không xà phòng hoá (trong có vitamin D2 D3) đợc chiết ete dầu hoả Vitamin D2 D3 đợc xác định cách làm dịch chiết bơm vào cột sắc ký phát detector DAD bớc sóng 265nm Phạm vi áp dụng Quy trình áp dụng cho loại thực phẩm nh sữa bột, sữa chua, bột dinh dỡng, bánh quy, nớc Chuẩn bị dung môi hoá chất - Dung môi methanol Merck loại dùng cho HPLC - Dung môi tetra hydrofuran THF Merck - Dung môi ethanol loại PA - Dung môi ete dầu hoả loại PA (30-60) - Dung dịch muối natri clorid 5% loại PA - Chuẩn cholecalciferol cña Merck - ChuÈn ergocalciferol cña Merck - Dung môi ethanol tuyệt đối Merck - Chất chống ô xi hoá Tert butyl hydroquinon (TBHQ) loại PA Trang 41/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Thiết bị dụng cụ - Hệ thống HPLC với detector DAD - Cét Inertsil ODS -3, 5µm, 250 x 4,0 mm - Cân phân tích XT 220 Thuỵ sĩ độ xác 10- 5g - Máy quang phổ UV-VIS Nhật - Máy cất quay chân không loại Eyela Nhật - Bộ phận hút chân không cho cột làm SPE - Máy siêu âm ultrasonic LC 30 Nhật - Bình định mức 100, 50, 25 ml - Pipet bÇu 5, 2, ml - Cèc cã má 500, 250, 100 ml - èng ®ong 100, 25 ml - Bình cầu cất quay chân không Các bớc thực 5.1 Pha dung dịch chuẩn - Dung dịch chuẩn gốc vitamin D2 100 ppm: Cân cân phân tích 0,0100g vitamin D2 cho vào bình định mức 100ml pha loÃng đến vạch dung môi ethanol cđa Merck - Dung dÞch chn trung gian vitamin D2 1ppm: Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100ml pha loÃng ethanol đến vạch - Dung dịch chuẩn gốc vitamin D3 100 ppm: Cân cân phân tích 0,0100g vitamin D2 cho vào bình định mức 100ml pha loÃng đến vạch dung môi ethanol Merck Trang 42/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 - Dung dịch chuẩn trung gian vitamin D3 1ppm: Lấy 1ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 100 ml pha loÃng ethanol đến vạch - Xác định lại nồng độ dung dịch chuẩn trung gian Sử dụng máy quang phổ UV-VIS đo độ hấp thụ (Abs) dung dịch chuẩn trung gian vitamin D2, D3 ë b−íc sãng 265 nm Tính nồng độ thực dung dịch chuẩn (C) với hƯ sè ε = 18466 víi vitamin D3 vµ ε = 18843 với vitamin D2 - Sau xác định nồng độ xác pha loÃng dung dịch chuẩn trung gian thành dung dịch chuẩn làm việc với nồng độ khác để xây dựng đờng chuẩn Chuẩn bị mẫu phân tích - Mẫu đợc đồng kỹ trớc xử lý: Đối với mẫu rắn phải xay nghiền kỹ trộn Mẫu dạng bột, lỏng, sệt phải đợc trộn khuấy kỹ - Cân khoảng 0,5- 50 g mẫu độ xác 0,1g cho vào lọ nhựa (Tuỳ thuộc vào đối tợng mẫu) - Mẫu đợc xà phòng hoá cách cho thªm 40 ml ethanol, 25 ml KOH 80 % , khoảng 0,1 g BHT khuấy trộn để 75 0C nhiệt độ phòng qua đêm - Chiết chất không xà phòng hoá ete dầu hoả, hai lần lần 25 ml Tập hợp lớp ete vào phễu chiết khác - Rửa lớp ete dung dịch NaCl % đến dung dịch trung tính - Lớp ete cho vào bình cất quay chng cất đến khoảng 5ml - Làm qua cột SPE - Si loại 6ml: Các bớc làm sạch: Trang 43/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 + Cột đợc ổn định ml dung m«i ethyl acetat: n-hexan =7:73 + Sau nạp dung dịch chiết mẫu vào cột + Rửa giải 20 ml dung dịch ethyl acetat : n-hexan = 7:73 + Dung dịch rửa giải đợc cất quay đến cạn + Hoà cặn lại 1ml pha động lấy dung dịch bơm vào cột HPLC Điều kiện chạy sắc ký - Cột tách chiết pha ngợc Inertsil ODS - Pha động (MeOH : THF : H2O) = ( 92:3: 5) - Detector DAD bớc sóng 265nm - Tốc độ dòng 1,5 ml/ phút - Nhiệt độ phòng Tính kết - Bơm chuẩn làm việc vào cột HPLC xác định diện tích hay chiều cao pic chất chuẩn, xây dựng đờng chuẩn tơng quan diện tích chiều cao pic với nồng độ dÃy chuẩn - Căn vào đờng chuẩn để tính hàm lợng vitamin D mẫu theo công thức sau X (àg/g) = V x Cm/ m Trong ®ã: V: ThĨ tÝch dịch chiết cuối để chạy sắc ký HPLC (ml) Cm: Nồng độ dung dịch chiết mẫu tính theo đờng chuẩn (àg/ml) m: Khối lợng mẫu phân tích (g) Trang 44/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 Phần 7: Tài liệu tham khảo G.Brubacher, w Muller-Mulot and D.A.T Southgate (1985) Methods for the determination of vitamins in food, Elsevier applied science publishers, London and New york Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nh Thuận (1978) Kiểm Nghiệm Lơng Thực Thực Phẩm, Nhà xuất Khoa Häc vµ Kü ThuËt-Hµ Néi Ceirwyn s.James(1995) Analytical chemistry of foods, Blackie academic and professional, printed in Great Britain by the Alden press, Oxford Ronald S Kirk and Ronald sawyer (1991) Pearson, s composition and analysis of foods, Longman scientific and technical Official methods of analysis of AOAC international, Sixteenth edition, 3rd revision, (1997) Jette Jakobsen, Ina Clausen, Torben Leth, Lars Ovesen (23/10/2003) Journal of food composition and analysis 17 (2004) 777-787 Jette jakobsen, Ina Clausen, Torben Leth, lars Ovesen (17/3/2003) Journal of food composition and analysis 16 (2003) 575-585 Lan Phơng (2001) dịch T150-161 Bách khoa th vitamin, muối khoáng yếu tố vi lợng, nhà xuất y học Food chemistry vol 57 No1.pp.95-99, 1996, new analytical aspects of vitamin D in food 10 LeoM.L.Nollet năm [1992], Food analysis by HPLC, p276-329 Trang 45/46 Báo cáo đề tài nghiên cứu Hà nội 2007 11 M.M Delgado Zamarreno, A.Sanchez Peres, M Sanchez Rodriguez (1996) determination of fat- solution vitamin in yogurt by HPLC with electrochemical detection, Talanta 43(1996), 1555-1563 12 Pirjo h.Mattila, Vieno I Piironen (1996) New analytical aspects of vitamin D in food Food chemistry, pp 95-99 , Elesvier Science Ltd 13 H.Qian, M.Sheng (1998), Simultaneous determination of fat- soluble vitamin A, D, E and pro-vitamin D2 in animal feeds by one-step extraction and high per formance liquid chromatography analysis, Journal of chromatograyphy A825 (1998) 127-133 14 NguyÔn Văn Thục, Trần Đức Hậu (2004), hoá dợc tập 2, Đại học Dợc Hà nội, môn dợc lý 15 Mai Tất Tố (2004), Dợc lý học tập Đại học Dợc Hà nội 16 Hà Huy Khôi (2006), Những đờng biên dinh dỡng, nhà xuất y học Hà nội 17 Trờng đại học Y Hà nội (2004), Dinh d−ìng vµ vƯ sinh an toµn thùc phÈm, nhà xuất y học Hà nội 18 Bùi Minh Đức, Phan Thị Kim (2002), Dinh dỡng bảo vệ bà mẹ thai nhi phòng bệnh mÃn tĩnh, nhà xuất y học Hà nội 19 Department of Food and Nutrition,the University of Georgia, Athens, USA, Journal of Chromatography A, 825(1998) 127-133 Hà nội, ngày Viện trởng VDD Giám đốc TTKNVSATTP Trang 46/46 tháng năm 2007 Chủ nhiệm đề tài Báo cáo đề tài nghiên cứu- Hà nội 2007 Phụ lục Các sắc đồ dung dịch chuẩn vitamin D2 D3 xây 394 11.553 2473 11.760 Vitamin557 13.010 12.578 D2 53434 301113.600 207 13.157 211 13.755 812 14.150 601 14.677 413 14.817 136 15.155 97 14.968 10315.068 dùng kho¶ng tuyÕn tÝnh 20 0 10 40 mAU mAU 40 20 20 30 Minutes 2771 11.757 Vitamin D2 285317 12.550 233 13.223 121 13.115 39 13.338 4009 13.680 484 14.050 439 14.208 Hình 31: Sắc đồ chuẩn vitamin D2 víi nång ®é 0,002ppm 20 0 10 40 mAU mAU 40 20 20 30 M inutes 137 11.097 8393 11.647 Vitamin D2 561898 12.452 5580 13.495 Hình 32: Sắc đồ chuẩn vitamin D2 với nồng ®é 0,02ppm 20 0 10 40 20 mAU mAU 40 20 30 Minutes Hình 33: Sắc đồ chuẩn vitamin D2 với nồng độ 0,041ppm Trang 1/4 Báo cáo đề tài nghiên cứu- Hà nội 2007 50 0 10 50 mAU 100 5667 11.695 Vitamin D2 1137168 12.532 11488 13.622 mAU 100 20 30 Minutes H×nh 34: Sắc đồ chuẩn vitamin D2 với nồng độ 0,082ppm 50 0 10 50 mAU 100 14267 11.628 Vitamin D2 2217493 12.452 21996 13.543 2375 14.163 3806 14.735 mAU 100 20 30 Minutes Hình 35: Sắc đồ cđa chn vitamin D2 víi nång ®é 0,165ppm 100 100 0 10 mAU 31132 12.440 4353966 72998 36963 75808 200 11.643 Vitamin D2 13.530 14.147 14.740 mAU 200 20 30 Minutes Hình 36: Sắc đồ chuẩn vitamin D2 víi nång ®é 0,33ppm Trang 2/4 mAU 20 10 0 10 10 20 10 20 10 20 Trang 3/4 19.457 19.642 20.070 20.267 20.407 20.550 20.702 20.817 20.953 -1 30 -1 mAU 10 10 30 10 -1 30 -1 M in u te s Hình 39: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nång ®é 0,137ppm mAU 15.668 2836 15.908 144 170 363 41 265 88 349 609 528 390 11.790 5942 12.427 542 Vitamin D3 13.117 33081 14.153 7927 14.570 1156 14.710 1231 14.990 310 15.150 706 15.338 183 15.620 320 15.803 340 16.222 2200 16.500 1982 16.737 643 16.845 336 16.918 397 17.012 316 17.990 268 30 mAU 20 11.878 19510 10 Vitamin D3 13.133 215320 14.110 4480 mAU 20 (Vitamin 13.407 420801 D3) 14.413 9215 11.517 1539 11.643 402 11.730 507 mAU Báo cáo đề tài nghiên cứuHà néi 2007 30 20 30 -1 M inu te s Hình 37: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng ®é 0,0068ppm 30 20 30 -1 M in u te s Hình 38: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nång ®é 0,068ppm 30 20 mAU 100 50 0 10 50 10 15 10 Trang 4/4 mAU 20 20 20 25 mAU 20 50 Minutes 30 Hình 42: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng ®é 0,5ppm mAU Vitamin D3 13.030 833163 14.010 22840 14.342 1212 14.580 10300 15.583 20410 Vitamin D3 12.998 1183937 13.990 48684 14.503 27531 15.525 38275 16.198 224 16.535 185 16.857 149 17.088 64 17.163 56 20 1791 95 236 2006 131 2725 554 272 207 1337 342 25 11.300 2054 mAU 40 17.732 18.128 18.723 18.947 19.310 20.023 20.185 20.297 20.377 20.558 20.783 11.280 2564 11.367 3157 11.622 701 11.698 753 11.802 700 11.847 1140 Vitamin D3 13.008 1376056 13.990 50096 14.520 24088 15.532 45560 16.118 445 mAU B¸o cáo đề tài nghiên cứuHà nội 2007 40 Minutes 30 Hình 40: Sắc đồ chuẩn vitamin D3 nồng độ 0,274ppm 50 25 M inutes 30 Hình 41: Sắc ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,392ppm 100 ...Viện Dinh D? ??ng Trung tâm kiểm nghiệm vsATTP ***************** Báo cáo kết nghiên cứu Chuẩn hóa phơng pháp xác định hàm lợng vitamin D (D2 D3 ) thực phẩm phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Chủ... (trong có vitamin D2 D3 ) đợc chiết ete d? ??u hoả Vitamin D2 D3 đợc xác định cách làm d? ??ch chiết bơm vào cột sắc ký phát detector DAD bớc sóng 265nm Phạm vi áp d? ??ng Quy trình áp d? ??ng cho loại thực. .. nói thực nội dung sau đây: - Khảo sát điều kiện chạy dung d? ??ch chuẩn vitamin D2 vitamin D3 - Xác định giới hạn phát (LOD) - Xác định giới hạn định lợng (LOQ) - Xác định khoảng tuyến tính - Xác định