Bộ Khoa học Công nghệ Chơng trình KC- 04 Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật Đề tài cấp nhà nớc Đề tài: KC 04 - 32 Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bƯnh sèt Dengue/ sèt xt hut Dengue vµ bƯnh Viêm đờng hô hấp cấp (SARS) Việt Nam GS.TS Trơng uyên Ninh Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng 6701 24/12/2007 Hà Nội, 9- 2007 Bản quyền thuộc VVSDTTW- Bộ Y Tế Những chữ viết tắt báo cáo ☯ ARN Axit ribonucleic ADN Axit deoxyribonucleic CID Center of Infection Diseases Trung tâm bệnh nhiễm trùng CDC Center of Diseases Control Trung tâm kiểm soát bệnh tật ELISA Enzym linked Immunosorbent Assay Thư nghiƯm miƠn dÞch men GAC- ELISA IgG Capture ELISA Kỹ thuật miễn dịch enzym phát hiÖn IgG HI Hemagglutination Inhibition test HT HuyÕt FBS IFAT Fetal Bovin Serum (Immunofluorescent indirect Antibody Technique) Kü thuËt miễn dịch huỳnh quang gián tiếp IFDT (Immunofluorescent direct Antibody Technique) Kü tht miƠn dÞch hnh quang trùc tiÕp IFA (Immunofluorescent Indirect Antibody Technique) Kü tht miƠn dÞch hnh quang gi¸n tiÕp MAC - IgM Capture ELISA ELISA Kü thuËt miễn dịch enzym phát IgM ML Maximum Likelihood Phơng pháp chắn tối đa MP Maximum Pasimony Phơng pháp chi li tối đa NJ Neighbor Joining Phơng pháp kế cận liền kề NNKHC Primer PRNT Ngăn ngng kết hồng cầu (HI) Đọan mồi ADN Plaque Assay and Plaque Reduction Neutralization tests Kü thuËt trung hoµ vµ Kü thuËt Trung hoà giảm đám hoại tử PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi Polymeraza RT- PCR Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Phản ứng dao chép ngợc khuếch đại chuỗi SARS Severe Acute Respiratory Syndrome Hội chứng viêm đờng hô hấp cấp tÝnh SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona virus Virus Corona g©y bƯnh SARS SD SXHD TCYTTG VVSDTTW VCNSH WHO Sèt Dengue Sèt xuÊt huyÕt Dengue Tæ chøc Y tÕ Thế giới Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương Viện C«ng nghƯ Sinh häc World Health Organization (Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi) WB Western Blot Mơc lơc Sè TT Nội dung Trang Đặt vấn đề Chơng I Tổng quan tài liệu A Nghiên cứu virus Dengue gây nên bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ë ViÖt Nam 1.1 BƯnh sèt Dengue vµ sèt xt hut Dengue 1.1.1 Biểu lâm sàng 1.1.2 Tác nhân truyền bệnh 1.1.3 Tình hình dịch bệnh giới 1.1.4 Tình hình dịch bệnh Việt Nam 11 1.2 Virus Dengue 11 1.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc 13 1.2.2 Genome virus 13 1.2.3 Chu trình nhân lên chế gây bệnh virus Dengue 15 1.2.4 Đặc điểm kháng nguyên 17 1.2.4.1 Phát kháng thể 18 1.2.4.2 Phân lập virus 20 B nghiên cứu virus corona gây bệnh viêm đờng hô hấp cấp SARS Việt Nam 1.1 Tình hình nghiên cứu giới 26 1.2 Các nghiên cứu Việt nam 42 Chơng II Đối tợng phơng pháp nghiên cứu A Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue 2.1 Đối tợng vật liệu 2.1.1 Đối tợng 2.1.2 Vật liệu 2.1.3 Hoá chất 49 2.2 Trang thiết bị 54 2.3 Phơng pháp 55 44 Các phơng pháp sản xuất kháng nguyên Kháng huyết 2.3.1 Sản xuất kháng nguyên 55 2.3.2 Phơng pháp sản xuất kháng huyết 58 2.3.3 Phơng pháp ELISA phát IgM 59 2.3.4 Kỹ thuật trung hoà (Neutralization Test - NT) 59 2.3.5 Phơng pháp miễn dịch hấp phụ liên kết men 60 phát KT IgG (GAC- ELISA) 2.4 Các phơng pháp phân lập xác định type virus 60 2.4.1 CÊy trun trªn n·o cht ỉ (1-3 ngày tuổi) 60 2.4.2 Phơng pháp phân lập virus tế bào muỗi 61 Aedes albopictus dòng C6/36 2.4.3 Kü tht miƠn dÞch hnh quang trùc tiÕp 64 (Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA) 2.4.4 Kü tht miƠn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp 65 (Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay – IFA) 2.4.5 Kỹ thuật Trung hoà giảm đám hoại tử 66 ( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT ) 2.4.6 Ph−¬ng pháp tổng hợp dây chuyền chuỗi nhờ polymerase 68 (RT-PCR - Polymerase Chain Reaction) C Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bệnh Viêm đờng hô hấp cấp SARS 2.1 Đối tợng nghiên cứu 73 2.2 Vật liệu 74 2.2.1 Mẫu bƯnh phÈm 74 2.2.2 TÕ bµo 74 2.2.3 Sinh phÈm khác 74 2.2.4 Môi trờng hoá chất 75 2.2.5 Trang thiết bị dụng cụ 76 2.3 Phơng pháp 78 2.3.1 Phân lập virus SARS-CoV 78 2.3.2 Tạo plasmid tái tổ hợp 78 2.3.3 Biểu lộ tinh kháng nguyên 79 2.3.4 Phơng pháp hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme tóm bắt 80 kháng thể IgM (MAC- ELISA) 2.3.5 Phơng pháp Western Blot 81 Chơng III Kết Bàn luận A Kết sản xuất bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bƯnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue 3.1 Nu«i cÊy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus 82 Dengue type III (D3) virus Dengue type IV (D4) tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 3.1.1 Nhân virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus 82 Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) vào tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 để tách chiết ARN 3.1.2 Quan sát nhân lên virus Dengue tế bào muỗi Aedes 100 albopictus dòng C6/ 36 dới kính hiển vi điện tử 3.2 Nghiên cứu qui trình công nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh chế kháng 106 nguyên Dengue tái tổ hợp type 3.2.1 Kháng nguyên Dengue thô 106 3.2.2 Kháng nguyên tái tổ hợp 108 3.2.3 Quy trình tách chiết tinh chế kháng nguyên tái tổ hợp virus dengue từ chủng E coli cho bốn typ virus dengue Tách dòng xác định trình tự đọan gen PreM E cđa type virus 109 3.3 117 Dengue 3.3.1 T¸ch RNA tổng số tế bào muỗi C6/36 117 3.3.2 Khuếch đại đoạn gene PreM E phơng pháp RT-PCR 118 3.3.3 Biểu kháng nguyên màng vỏ cña virus Dengue type 1, 2, 3, 148 hƯ nÊm men Pichia pastoris 3.3.4 BiĨu hiƯn gen m· hoá kháng nguyên preM-E (gen preM-env) Pichia pastoris 163 3.3.5 Kiểm tra phản ứng kháng nguyên DxME tái tổ hợp với kháng thể kháng virus Dengue tự nhiên Western Blot Thiết kế cặp mồi xây dựng kế họach tách dòng gen mà hóa kháng 167 3.4 168 nguyên vỏ virus Dengue type I, II, III, IV 3.5 Chế tạo cộng hợp (Gold monoclonal antibodies) gắn kháng nguyên vào 173 giá thể (màng thấm Nitrocellulo membrane) 3.6 Nghiên cứu dung dịch đệm buffer tối u 179 dùng phản ứng 3.7 Hoàn thiện Bộ sinh phÈm 183 3.8 3.8.1 Thư nghiƯm Bé sinh phÈm phßng thÝ nghiƯm Th−êng qui sư dơng Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bƯnh sèt Dengue/ 198 200 sèt xt huyết Dengue 3.8.2 So sánh kết thử nghiệm phßng thÝ nghiƯm 204 3.9 øng dơng Bé sinh phÈm thực địa 210 3.9.1 Kết kiêm tra phòng thí nghiệm Sốt xuất huyêt Arbovirus, Viện 210 Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng 3.9.2 Giá thành chất lợng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt 211 Dengue/ sốt xuất huyết Dengue 3.9.3 Một số hình ảnh tiến hành thí nghiệm điểm nghiên cứu 213 B KÕt qu¶ s¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÈn đoán nhanh bệnh viêm đờng hô hấp cấp (SARS) 3.1 Kháng nguyên tái tổ hợp protein N - SARS-CoV 217 3.2 Xác định thông số cho sinh phẩm MAC-ELISA chẩn 218 đoán nhiễm virus SARS-CoV 3.2.1 Xác định thời gian sử dụng tối u sinh phẩm 219 3.2.2 Xác định độ đặc hiệu Bộ sinh phẩm 220 3.2.3 Xác định độ nhạy sinh phẩm 220 3.3 Thành phần sinh phẩm 221 3.4 Ph¸t hiƯn kh¸ng thĨ IgM hut bƯnh nhân SARS nhân 221 viên y tế có tiếp xúc trực tiếp với bệnh nhân SARS Bàn luận Một phơng pháp chẩn đoán sớm phòng thí nghiệm có hiệu 226 Trong giai đoạn đầu dịch SARS, số phơng pháp ELISA đợc 234 giới thiƯu Bé sinh phÈm MAC- ELISA ph¸t hiƯn sím nhiễm virus SARS 236 Toàn bệnh nhân đợc xác định nhiễm virus SARS-CoV lâm 239 sàng đà đợc khẳng định lại phát đợc kháng thể IgM kháng đặc hiệu virus SARS CoV thông qua phơng pháp MAC-ELISA Sự xuất KT kháng đặc hiệu virus SARS-CoV số 239 ngời biểu lâm sàng Kết luận 241 Tài liệu tham khảo 244 Đặt vấn đề Trong vòng 15 năm gần đây, nhiều dịch bệnh nguy hiểm qui mô khu vực nh toàn cầu đà xảy lần gây ảnh hởng lớn đến kinh tế giới Tất bệnh dịch nguy hiểm (nh dịch hạnh ấn Độ vào năm 1994, dịch cúm gia cầm Hồng Kông 1997, dịch viêm nÃo Nipah Malaysia, dịch SARS hay hội chứng hô hấp cấp tính Trung Quốc từ năm 2002 đến 2003, cúm gia cầm vùng Đông Nam từ năm 2003 đến2007) có mầm bệnh từ động vật phát sinh Châu lây lan làm ảnh hởng đến kinh tế giới Với tiến trình toàn cầu hoá nay, thiết nghĩ tơng lai xảy nhiều dịch bệnh tầm mức tơng tự Hơn nữa, yếu tố xà hội, văn hoá nhân Châu có lẽ nơi tiếp tục xuất dịch bệnh bắt nguồn từ động vật Việc phát ổ dịch chơng trình chiến lợc dự phòng sớm châu giúp chủ động phát ngăn chặn kịp thời bệnh dịch đà biết đến nh bệnh dịch phát sinh Trong bệnh dịch gần đây, lên có dịch SD/ SXHD Viêm đờng hô hấp cấp SARS Sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue (SD/ SXHD) lµ mét bƯnh nhiƠm trïng cÊp tÝnh virus Dengue g©y Bệnh vacxin thuốc điều trị Biểu lâm sàng SD/ SXHD đa dạng từ sốt cao đột ngột kéo dài 2-7 ngày kèm theo triệu chứng đau đầu, đau cơ, đau xơng, đau khớp, đau bụng buồn nôn, phát ban Sau ®ã cã thĨ cã biĨu hiƯn xt hut d−íi da, xuất huyết nội tạng (chảy máu cam, chảy máu lợi, nôn máu, máu ) Ngoài có thêm dấu hiệu khác nh gan to, sốc, huyết áp hạ dẫn tíi tư vong (Barnes W J S vµ Rosen L., 1974) Bệnh SD/ SXHD bệnh muỗi (Aedes aegypti, Aedes albopictus) [33] truyền bệnh thờng dễ dàng phát triển thành dịch Virus Dengue đợc Sabin phân lập Calcuta, ấn độ, New-Guinea Hawaii (Sabin A cs, 1952) Sau đợc xác định virus Dengue type 1-Hawaii virus Dengue type 2-New-Guinea Các type virus Dengue virus Dengue đợc Hammon W.M cs phân lập Philippines vào năm 1956 (Hammon W.M cs 1960) Tiếp nhiều chủng virus Dengue đà đợc phân lập từ nhiều vùng khác giới nhng đợc xác định thuộc type huyết nêu (Anonymous, 1986) Tới năm 1997 bệnh SD/ SXHD đà lan rộng phạm vi toàn giới Theo Gubler, D.J (1997) có tới 2,5 tỷ ngời sống khu vùc cã l−u hµnh SD/ SXHD vµ hµng năm có khoảng 100 triệu ngời mắc bệnh Để phòng chống bệnh cách hiệu việc chủ động giám sát huyết học, dịch tễ học, côn trùng học virus Dengue gây nên bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue cần thiết Các phơng pháp chủ yếu chẩn đoán huyết học virus Dengue bao gồm: Phản ứng Ngăn ngng kết hồng cầu (HI), phản ứng kết hợp bổ thể (CF), phản ứng trung hòa giảm đám hoại tử (PRNT), phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn enzym phát kháng thể IgM (MAC-ELISA) phản ứng miễn dịch hấp phụ gắn enzym ph¸t hiƯn kh¸ng thĨ IgG (GAC-ELISA), kü tht RT- PCR Ngoài bệnh SD/ SXHD, Hội chứng viêm đờng hô hấp cấp tính nặng (SARS) bệnh dịch xuất phạm vi toàn cầu SARS đà xuất 23 Quốc gia: Trung Quốc, Hồng Kông, Singapore, Canada, Hoa Kỳ, Việt Nam, Malaysia, Thái Land Tính đến tháng 04 năm 2004 toàn giới đà có tổng số mắc/ tổng số chết là: 3169/ 144 ngời (Theo Tổ chức Y tế Thế giớiWHO) [39] Tác nhân gây bệnh SARS biến thể họ Corona (Coronaviridae); Một nhóm virus gây bệnh cho ngời động vật [41] Trên ngời, Corona thờng gây viêm đờng hô hấp trên, chủ yếu ngời trởng thành Ngoµi ThiÕt kÕ mét Adaptor cho mét đầu có vị trí cắt enzyme hạn chế BamHI, đầu thứ hai có vị trí cắt XhoI Ngoài ra, Adaptor có thêm số vị trí cắt enzyme hạn chế quan trọng nh EcoRI, SacI, SalI, HindIII Vector pETTRX-Fus đợc xử lý phối hợp với enzyme BamHI XhoI để loại bỏ vùng cắt gắn đa vị (MCS) Sau gắn, vector đợc biến nạp vào E coli chủng DH5 để chọn lọc vector tạo đợc Thioredoxin tái tổ hợp có gắn đuôi Histidine (His-tag) Vector đợc kiểm tra lại trình tự hai mồi xuôi ngợc sau biến nạp vào tế bào E coli chủng BL21 DE3 Star để biểu thu nhận thioredoxin tái tổ hợp chứa 143 aa với khối lợng phân tử khoảng 15,6 kDa (Hình 3.34) Hình 3.34 Thioredoxin tái tổ hợp biểu E coli M: Chỉ thị phân tử protein 1: Mẫu không cảm ứng IPTG 2: MÉu sau c¶m øng b»ng IPTG 0,5mM 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Các phân đoạn sau tinh cột sắc ký lực Nikel Resin Kháng thể kháng Thioredoxin sản xuất thỏ đợc kiểm tra khả phản ứng với Thioredoxin với kháng nguyên virus Dengue nh virus viêm gan B cã lai ghÐp víi Thioredoxin nh− c¸c kh¸ng nguyên DE3-TRX, HBcAg-TRX Thành phần Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue đà sẵn sàng hộp nhựa 30 m gn vng ã Khỏng thể đơn dịng đặc hiệu nhóm Flavivirus gắn vàng • Kháng nguyên Dengue 1-4 tái tổ hợp Màng hấp phụ kháng thể miễn dịch Add 10µL of phát serum • Thang blood or IgM • Thang phát IgG • Thang đối chứng Vỏ nhựa bao bọc •Bản hấp phụ trg tâm Phân giải thành phần huyết Add drops of running buffer Bản hấp phụ máuce Wicking Material Tấm điều khiển trình xét nghiệm Màng Thang phát hiệnIgG Phức hợp kháng thể Thang đối chng Thang phỏt hin IgM Hình 36.J Thành phần hoàn chỉnh xét nghiệm Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue 3.8 Thư nghiƯm Bé sinh phÈm phßng thÝ nghiệm Hình ảnh thành phẩm xét nghiệm nhanh kháng thể IgM IgG kháng virus Dengue Bộ sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bƯnh Sèt Dengue/ Sèt xt hut Dengue 31 32 3.8.1 Th−êng qui sư dơng Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bƯnh sèt Dengue/ sèt xt hut Dengue 3.8.1 Kü tht sư dơng Bé sinh phÈm chẩn đoán nhanh (Quick test) để phát IgM IgG kháng virus Dengue Nguyên tắc Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh phát kháng thể IgM IgG kháng virus Dengue máu toàn phần huyết ngời nghi mắc SD/ SXHD giai đoạn sơ nhiễm tái nhiễm Kết xét nghiệm xác bệnh nhân có biểu triệu chứng lâm sang mắc bệnh SD/ SXHD tơng đối rõ ràng Kết kỹ thuật đợc khẳng định sau phân lập làm tiếp kỹ thuật phát Axit Nucleic 3.8.2 So sánh kết thử nghiệm phòng thÝ nghiƯm Víi PanBio Ltd.; Cortez Diagnostics, Calabasas, Calif.; Glysby, Arcore, Italy; vµ AmeriTek, Scattle, Wash 3.9 øng dơng Bé sinh phẩm thực địa 3.9.1 Kết kiểm tra phòng thí nghiệm Sốt xuất huyết Arbovirus, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng 3.9.2 Giá thành chất lợng Bộ sinh phẩm chẩn đóan nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue (tạm tính) 3.9.3 Một số hình ảnh tiến hành thí nghiệm điểm nghiên cøu B KÕt qu¶ s¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÈn đoán nhanh bệnh viêm đờng hô hấp cấp (SARS) 3.1 Kháng nguyên tái tổ hợp protein N - SARS-CoV Protein tái tổ hợp N- SARS-CoV chứa đựng amino acid từ vị trí 122 đến 422 nucleoprotein virus SARS-CoV đà đợc khuyếch đại phản ứng RT-PCR, tạo dòng (cloning) vào khu vực giới hạn ezym BamHI biểu plasmid pQE30 Protein tái tổ hợp đợc bộc lộ thành công E.coli tinh sử dụng cột lọc Talon điều kiện tự 33 nhiên Phân tích protêin tái tổ hợp tinh SDS-PAGE cho thấy band đơn có trọng lợng phân tử 32 kD trùng khớp với trọng lợng phân tử protein N121( 122-422) virus SARS-CoV đà đợc biết Protein N121 đợc tiếp tục khẳng định thực phản ứng Weston blot ( A) (B) (A): Protein tái tổ hợp N N121 sau đợc chuyển nhiễm E.coli đà đợc tinh khiết đợc phân tích gel SDS PAGE (10%) vµ nhuém b»ng Coonassie Blue (B): Protein N vµ N∆121 sau tinh đợc phân tích phản ứng Western Blot sư dơng gel SDS –PAGE (10%) sau ®ã chuyển sang màng cellulose 3.2 Xác định thông số cho sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán nhiễm virus SARS-CoV [34] 3.2.1 Xác định thời gian sử dụng tối u sinh phẩm 3.2.2 Xác định độ đặc hiệu Bộ sinh phẩm 34 3.2.3 Xác định độ nhạy sinh phẩm 3.3 Thành phần sinh phẩm Thành phần Đóng gói Số lợng Dung dịch đệm phốt phát (PBS)x10 Dung dịch 50ml Sữa tách bơ Bột 5g Huyết chứng dơng Đông khô 100àl Huyết chứng âm Đông khô 100àl Kháng nguyên SARS-CoV tái tổ hợp ( Dung dịch 10ml Dung dich 10ml 0,2àg/100àl) Kháng thể đa dòng kháng SARS-CoV( 1/4000) Cộng hợp HRPO (1/5000) Dung dịch 10ml Dung dịch 10ml Cơ chất ABTS phiến Phiến nhựa 96 giếng gắn kháng thể kháng IgM ng−êi 3.4 Ph¸t hiƯn kh¸ng thĨ IgM hut bệnh nhân SARS nhân viên y tế có tiếp xóc trùc tiÕp víi bƯnh nh©n SARS Tỉng sè 148 mÉu hut thu thËp tõ 36 bƯnh nh©n SARS 112 nhân viên y tế có tiền sử tiếp xóc trùc tiÕp víi bƯnh nh©n SARS tai bƯnh viƯn Viêt Pháp, Y học lâm sàng bệnh nhiêt đới bệnh viên Đa khoa tỉnh Ninh Bình đợc xét nghiệm tìm kháng thể IgM kháng đặc hiệu virus SARS –CoV b»ng bé sinh phÈm MAC-ELISA KÕt qu¶ cho thÊy Bảng 2.4 Kết huyết học bệnh nhân Đối tợng Số mẫu Số dơng Tỷ lệ (%) tính Bệnh nhân SARS 36 36 100 Nhân viên y tế ( kh«ng biĨu hiƯn 112 3,5 148 40 27,02 triệu chứng lâm sàng) Tổng số 35 3.5 Kết nghiên cứu nguyên SARS 3.1 Số lợng mẫu sử dụng nghiên cứu: - Các bệnh nhân SARS: Trong tổng số 63 bệnh nhân đợc xác định lâm sàng nhiễm virus SARS-CoV đà thu thập đợc số mẫu nh sau Bảng 2.5 Các loại mẫu bệnh phẩm lấy từ bệnh nhân SARS Bệnh phẩm đờng hô hấp Dịch họng Huyết Dịch súc Dịch tỵ họng hÇu 15 14 Sè mÉu LÇn LÇn 236 43 34 Tỉng 279 B¶ng 2.6 Sè mÉu bƯnh phẩm thu đợc theo nhóm đối tợng tiếp xúc Nhóm đối tợng tiếp xúc với bệnh nhân SARS Nhân viên BV Nhân viên BV Nhân viên BV Cộng đồng Việt Pháp YHLSCBND ĐK Ninh Bình TP Hà nội 61 102 53 212 Số mẫu Tổng 428 3.6 Xác định loại bệnh phẩm phù hợp cho chẩn đoán sớm nhiễm vi rut SARS-CoV: Bảng 2.7 Tỉ lệ dơng tính với RT-PCR loại mẫu bệnh phẩm hô hấp Loại mẫu Số lợng RT-PCR (+) Tỷ lệ(%) Dịch họng 14 0 Dịch súc họng 15 60,0 Dịch tỵ hầu 40 Tæng sè 34 11 32,35 36 3.6 Lựa chọn phơng pháp chẩn đoán sớm nhiễm virus SARS: Bảng 2.8 So sánh độ nhạy phơng pháp RT-LAMP RT-PCR Số Loại mẫu lợng RT-PCR RT-LAMP (CDC primer) (+) (%) (+) (%) DÞch häng 14 0 0 DÞch sóc häng 15 10 67 60 DÞch tỵ hầu 60 40 Huyết 284 15 5,2 2,5 Tæng sè 318 28 8,8 18 5,7 3.7 Sự đáp ứng miễn dịch thể nhiễm virus SARS-CoV Thông qua hệ thống miễn dịch dịch thể, thể ngời kháng lại virus SARS CoV thông qua sản sinh kháng thể IgA, IgM, IgG đặc hiệu kháng virus SARS Bảng 3.4: Tỉ lệ đáp ứng miễn dịch dịch thể với virus SARS-CoV Huyết Phơng pháp Số mẫu (+) Huyết Tû Sè mÉu (+) lÖ(%) ELISA 63 20 31,7 Tû lƯ(%) 24 55,8 43 PRNT 43 40 93,0 Bµn ln Một phơng pháp chẩn đoán sớm phòng thí nghiệm có hiệu phơng pháp phải đáp ứng đợc yêu cầu : nhanh , nhạy xác Đối với nguyên mới, nguy hiểm yêu cầu cấp thiết, việc lựa chọn phơng pháp chẩn đoán phù hợp với khả phòng thí nghiệm quan trọng Các phơng pháp phát kháng nguyên kể 37 ®Õn nh− : RT-PCR, ph©n lËp virus , IFA yêu cầu phải đợc đảm bảo an toàn sinh học tuyệt đối nghiêm ngặt nguyên nguy hiểm nh virus SARS CoV , hiệu nhận định bệnh phẩm thu thập sớm ngày đầu phát bệnh Việc nghiên cứu phát triĨn bé sinh phÈm MAC-ELISA ph¸t hiƯn sím nhiƠm virus SARS - phơng pháp phát nhiễm virus sau ngày nhiễm bệnh (kháng thể Ig M xuất sớm tồn vòng tháng) bù đắp cho hạn chế phơng pháp phát kháng nguyên mẫu bệnh nhân thu thập giai đoạn sau ngày nhiễm Trong giai đoạn đầu dịch SARS, số phơng pháp ELISA đợc giới thiệu, nhiên kháng nguyên sử dụng phơng pháp kháng nguyên virus SARS CoV bất hoạt thu hoạch từ dịch nuôi cấy tế bào Để sản xuất kháng nguyên này, lợng virus SARS lớn phải đợc khuyếch đaị thông qua nuôi cấy tế bào, yêu cầu đảm bảo an toàn sinh học phải đợcthực nghiêm ngặt (phòng thí nghiệm an toàn sinh học mức độ 3) đồng thời hiệu giá KN bị giảm đáng kể thông qua trình bất hoạt, độ đặc hiệu kháng nguyên không cao ảnh hởng môi trờng nuôi cấy Vì yêu cầu kháng nguyên tái tổ hợp cấu tạo từ protein N điều cần thiết Bộ sinh phẩm MAC- ELISA phát sớm nhiễm virus SARS đợc phát triển sở thành công tổng hợp kháng nguyên SARS-CoV tái tổ hợp Xác định nồng độ tối u thành phần sinh phẩm nh thời hạn sử dụng sinh phẩm tháng Độ nhạy độ đặc hiệu sinh phẩm đạt 100% Hớng dẫn sử dụng Bộ sinh phẩm MAC-ELISA chẩn đoán sớm nhiễm virút SARS-CoV Pha loÃng mẫu huyết (chứng dơng, chứng âm, mẫu bệnh phẩm) theo tØ lƯ 1/100 dung dÞch pha lo·ng hut a/ Phủ ELSIA 100 àl/ giếng kháng thể dê kháng IgM ngời (KPL- Mỹ) vói nồng độ 1/250 dung dịch đệm PBS pH 7,4 phiến nhựa 96 giếng đáy Để qua đêm 0C 38 b/ Cho 100àl huyết bệnh nhân đà pha loÃng, huyết chứng dơng huyết chứng âm vào giếng phiến nhựa Phiến nhựa đợc ủ 37 0C/ 60 phút c/ Cho 100àl kháng nguyên SARS tái tổ hợp có nồng độ 0,2àg vào giếng phiến nhựa, ủ 37 0C/ 60 phút d/ Cho 100 àl kháng thể đa dòng kháng SARS-CoV (KT dê kháng SARS-CoV pha loÃng 1:4000- ) vào giÕng cña phiÕn nhùa, ñ 37 0C/ 60’ e/ Cho 100 àl cộng hợp gắn enzyme horseradish peroxidase (HRPO) (KT chuột khángdê gắn enzyme HRPO- Biosource- CA-Mỹ) pha loÃng 1/4000 ủ 370C/ 60 phút g/ Cho 100 àl chất ®−ỵc pha lo·ng theo tØ lƯ 1/1: ABTS (2,2’-azino-di(3-ethlybenzthiazoline-6-sulfonate- Kirkegaar & Perry Laboratory) hydrogen peroxide vào giếng ủ 37 0C/ 30 phút, tối f/ Đọc kết máy đọc ELISA bớc sóng 410 nm 490 nm Thành phần sinh phẩm Thành phần Đóng gói Số lợng Dung dịch 50ml Bột 5g Huyết chứng dơng Đông khô 100àl Huyết chứng âm Đông khô 100àl Kháng nguyên SARS-CoV tái tổ hợp (0,2 àg/ Dung dịch 10ml 100àl) Dung dich 10ml Kháng thể đa dòng kháng SARS-CoV (1/4000) Dung dịch 10ml Cộng hợp HRPO (1/5000) Dung dịch 10ml Dung dịch đệm phốt phát (PBS)x10 Sữa tách bơ Cơ chất ABTS phiến Phiến nhựa 96 giếng gắn kháng thể kháng IgM ngời Toàn bệnh nhân đợc xác định nhiễm virus SARS-CoV lâm sàn đà đợc khẳng định lại phát đợc kháng thể IgM kháng đặc hiệu 39 virus SARS CoV thông qua phơng pháp MAC-ELISA Kết cho thấy đáp ứng miễn dịch thể ngời với virus SARS gièng nh− nhiƠm c¸c virus kh¸c, IgM sÏ lớp kháng thể dịch xuất dễ dàng phát sử dụng phơng pháp phù hợp Sự xuất KT kháng đặc hiệu virus SARS-CoV số ngời biểu lâm sàng (2 ngời) đà cho thấy có khả nhiễm virus SARS- CoV thể ẩn, nguy hiểm Kết luận Để có đợc Kit chẩn đoán nhanh, phát sớm, xác virus Dengue virus SARS với giá thành hạ, dới đạo Bộ Khoa học Công nghệ, hỗ trợ tài Bộ Tài chính, lÃnh đạo Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ơng Viện Công nghệ Sinh học , với nỗ lực tËp thĨ c¸n bé khoa häc tham gia thùc hiƯn đề tài KC.04-32, đà hoàn thành tiêu đăng ký ban đầu với Bộ Khoa học Công nghệ Ban chủ nhiệm chơng trình KC.04 đà thu đợc kết sau: Nuôi cấy virus Dengue tế bào muỗi Aedes albopictus dòng C6/36 Nghiên cứu qui trình công nghệ biểu hiện, tách chiết, tinh chế kháng nguyên Dengue tái tổ hợp type Đà sản xuất đợc kháng nguyên tái tổ hợp virus Dengue type D1, D2, D3, D4 dạng chimeric (lai ghép hai protein), protein phản ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus Dengue, protein thứ hai phản ứng với kháng thể chung làm tăng tính đặc hiệu tiện ích sử dụng Tách dòng xác định trình tự gen mà hóa kháng nguyên vỏ (kháng nguyên E) virus Dengue type I, II, III, IV Đà tạo dòng, xác định trình tự, đăng ký Ngân hàng gen quốc tế lu giữ nh tài sản quí trình tự gen mà hoá kháng nguyên màng (M) vỏ (E) cđa virus Dengue c¸c type D1, D2, D3, D4 tõ chủng virus Dengue phân lập 40 chọn lọc Việt Nam để phục cho nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán nh nghiên cứu vắc xin phòng chống SD/SXHD tơng lai Thiết kế cặp mồi xây dựng kế hoạch tách dòng gen mà hóa kháng nguyên vỏ virus Dengue type I, II, III, IV Chế tạo cộng hợp Gắn kháng nguyên vào giá thể Chế tạo cộng hợp (Gold mônclonal antibodíe) gắn kháng nguyên vào giá thể (màng thấm Nitrocellulo membrane) Nghiên cứu dung dịch đệm bufer tối u, chạy phản ứng Hoàn thiện Bộ sinh phÈm - 100 Bé sinh phÈm chÈn dãan nhanh bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue - 100 B« sinh phẩm chẩn đoán SARS đợc phát triển sở thành công tổng hợp kháng nguyên SARS-CoV tái tổ hợp Xác định nồng độ tối u thành phần Bộ sinh phẩm nh thời hạn sử dụng Bộ sinh phẩm (6 tháng) đà hạn chế tối đa sai số kết quả, tăng độ tin cậy giúp việc sử dụng thuận tiện ®iỊu kiƯn ViƯt nam C¶ hai Bé sinh phÈm ®Ịu đạt: - Độ đặc hiệu: 78% đến 85% - Độ nhạy: 80% đến 90% (Tiêu chuẩn CDC Các nớc §«ng Nam A) Thư nghiƯm Bé sinh phÈm phòng thí nghiệm Độ nhạy Bộ sinh phẩm Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng sản xuất đạt 87,1% hÃng PANBIO 95,7% Độ ®Ỉc hiƯu cđa Bé sinh phÈm ViƯn VƯ sinh Dịch tễ Trung ơng sản xuất đạt 82,5% ®ã cđa h·ng PANBIO lµ 92,9% 10 Sư dơng Bé sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue để chẩn đóan dịch SD/ SXHD cho 212 bệnh phẩm Nam Định, Thanh Hóa, Phú Yên Kiên Giang 148 mẫu huyết bệnh nhân mắc SARS (Riêng Bô sinh phẩm ELISA chẩn đóan bệnh SARS không triển khai thực nghiêm địa phơng dịch, bệnh nguy hiểm nên đà đợc Bộ khoa học công nghệ cho phép bỏ yêu cầu (chỉ tiêu đề ban đầu cho hai Bộ sinh phẩm tiến hành thí nghiệm thc địa 200 mẫu) 41 Bộ sinh phẩm đợc ủng hộ nhiệt tình quan tâm nhà Dịch tễ học Trung tâm Y học D phòng tỉnh 11 06 báo đà đợc đăng (Chỉ tiêu 02 bài) Tạp chí Công nghệ Sinh học (Trung tâm KHTN CN cao), Tạp chí Y học (Bộ Y tế), Báo cao Khoa học (Procedings), Tạp chí nghiên cứu Y học(Đại học Y hà Nội) Virology (ELSEVIER) 12 Đào tạo (Chỉ tiêu 02 sinh viên) đợc 02 Thạc sĩ, 01 cử nhân vi sinh Đề nghị: Tiếp tục hoàn thiện Kit chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue sốt xuất hut Dengue TriĨn khai thư nghiƯm réng r·i c¸c bệnh viện để thay kit nhập ngoại có giá thành cao Tài liệu tham kh¶o Bach Thi,Q.N., Bui Hoang,A., Truong Uyen,N., Truong Thua,T., Le Thi,M.Q., Nguyen Thi,H.H and Dinh Duy,K (2003), Cloning and expression of the gene coding for preM and Eelope protein of Dengue virus type EMBL GenBank Database, ACCESSION AJ574886 David W Vaughn, Anada Nislak 1998 Evaluation of a rapid Immunochromatographic test for diagnosis of Dengue virus infection J of clinical Microbiology, Jan 1998, p 234-238 Guzman MG, Kouri G (2004), Dengue diagosis, advances and challenges Int J Infect Dis, Vol 8, No 2, pp 69-80 Đỗ Quang Hà, Trần Văn Tiến 1984 Dịch Dengue xuất huyết t¹i ViƯt Nam tõ 1975 - 1983 T¹p chÝ Y häc ViÖt Nam sè Tr 28 - 40 42 Kuhn RJ, Zhang W, Rossman MG, Pletnev SV, Corver J, Lenches E, Jones CT, Mukhopadhyay S, Chipman PR, Strauss EG (2002), Structure of Dengue virus: Implications for flavivivirus organization, maturation, and fusion, Cell: Vol 108, No 5, pp 717-25 Lin CF, Lei HY, et al Antibodies from Dengue patient sera cross-react with endothelial cells and induce damage J Med Virol, No 69, pp 82-90 Mirosky J, F Vymola, Hoang Thuc Thuy, 1965: Dengue fever in Vietnam J of hygiene Epidemiology microbiology and immunology, 12: 356- 62 Truong Uyen Ninh, 2000 Virological Surveillance of Dengue Haemorrhagic Fever in Vietnam, 1987- 1999; Dengue Bulletin, 24: 18- 23 Trơng Uyên Ninh, Lê Quỳnh Mai va Trơng Thừa Thắng, 2002 Trình tự xếp nucleotide vùng vỏ (E protein) virus Dengue type miền Bắc Việt Nam, Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, 964- 967 10 Trơng Uyên Ninh, 2003 Các type Virus Dengue lu hành từ 1987 đến 2002 Việt Nam Tạp chí Y học thực hành, 442 + 443: 102- 104 11 Trơng Uyên Ninh, 2003 Kết sử dụng Bộ sinh phẩm MAC- ELISA để chẩn đoán bệnh Sốt Dengue/ Sốt xuất huyết Dengue Hà Nội, Nam Định, Thanh Hoá Nghệ An, 2001- 2002 Tạp chÝ Y häc thùc hµnh, 467: 3- 12 Okabe N 1994: Situation of Dengue fever and Dengue haemorrhagic fever and Japanese Encephalitis in Western Pacific region Trop Med 36(4): 122 - 130 13 Suxiang Tong, Jairam R, Lingappa, Qi chen, Ashley C, laMonte, et al Direct sequencing of SARS-coronavirus S and N genes from clinical 43 specimens shows limited variation Journal of Infectious Diseases (received 13 January 2004, accepted 15 March 2004) 14 WHO 1992., Dengue Newsletter SEA/ VBC/ 44, 17: - 45 15 Yap.H.H., Self L S., Foo A E S., Chong N L 1993: Guidelines for Dengue surveillance and mosquito control.WHO Regional office for the Western Pacific Manila Philippines P:2- 16 Yokomori K, Banner LR, Lai MMC Heterogeneity of gene expression of hemagglutinin-esterase (HE) protein of murine coronaviruses Virology 1991;183:647–657 17 Zhai J, Briese T, Dai E, Wang X, Pang X, Du Z et al Real-time polymerase chain reaction for detecting SARS coronavirus, Beijing 2003 Emerging Infectious Diseases 2004; 10: 300-3 44 ... Dựa vào điều kiện mà đa mục tiêu Chơng trình nghiên cứu là: Xây dựng đợc qui trình kỹ thuật chẩn đoán nhanh xác sốt Dengue/ sốt xuất huyết Dengue bệnh Viêm đờng hô hấp cấp (SARS) Sản xuất Bộ sinh. .. nghiệm điểm nghiên cứu 213 B Kết sản xuất Bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh bệnh viêm đờng hô hấp cấp (SARS) 3.1 Kháng nguyên tái tổ hợp protein N - SARS- CoV 217 3.2 Xác định thông số cho sinh phẩm MAC-ELISA... B nghiên cứu virus corona gây bệnh viêm đờng hô hấp cấp SARS Việt Nam 1.1 Tình hình nghiên cứu giới 26 1.2 Các nghiên cứu Việt nam 42 Chơng II Đối tợng phơng pháp nghiên cứu A Bộ sinh phẩm chẩn