VCNTP B.KH&CN B.KH&CN VCNTP B.KH & CN VCNTP BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT Đề tài NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM TRONG CHẾ BIẾN MỘT SỐ NÔNG SẢN THỰC PHẨM Mà SỐ: KC 04-07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước: PGS.TS Ngô Tiến Hiển Đề tài nhỏnh NGHIên cứu phân lập, tuyển chọn, sinh tổng hợp enzym colagenaza vµ øng dơng thùc phÈm Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nước: TS T« Kim Anh Hà Nội, 10 – 2004 Bản quyền: Đơn xin chép toàn phần tài liệu phải gửi đến Viện trưởng Viện Công nghiệp Thực phẩm, trừ trường hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT Đề tài cấp Nhà nước NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM TRONG CHẾ BIẾN MỘT SỐ NÔNG SẢN THỰC PHẨM Mà SỐ: KC 04-07 Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước: PGS.TS Ngơ Tiến Hiển Đề tài nhánh cấp Nhà nước NGHIªn cứu phân lập, tuyển chọn, sinh tổng hợp enzym colagenaza vµ øng dơng thùc phÈm Chủ nhiệm đề tài nhánh cấp nhà nước: TS T« Kim Anh Hà Nội, 10 – 2004 Bản thảo viết xong tháng – 2004 T ài li ệu n ày đ ợc chu ẩn b ị tr ên c s k ết qu ả th ực hi ện đ ề t ài c ấp Nh n ớc, M ó s : KC 04-07 DANH sách ngời thực TS Tô Kim Anh Đại học Bách khoa Hà Nội TS Quảng Lệ Hà Đại học Bách khoa Hà Nội Nguyễn thị Thanh Tâm Đại học Bách khoa Hà Nội KS Nguyễn Thanh Hà Đại học Bách khoa Hà Nội KS Trần Khánh Lộc Đại học Bách khoa Hà Nội KS Mai Kiều Linh Đại học Bách khoa Hà Nội Tóm tắt nội dung đề tài Mục đích ®Ị tµi Mơc ®Ých cđa ®Ị tµi lµ tun chän nguån colagenaza an toµn tõ vi sinh vËt , thu nhận tìm hiểu đặc tính enzym; Tìm hiểu khả sử dụng enzym thực tế sản xuất Phơng pháp nghiên cứu Phơng pháp vi sinh vật: - Phơng pháp vòng thuỷ phân phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải colagen - Các kỹ thuật nuôi đánh giá canh trờng vi khuẩn Phơng pháp hoá sinh: - Xác định hàm lợng protein phơng pháp Lowry; - Xác định hoạt độ enzym - Xác định hàm lợng nhóm -NH2 tự phơng pháp Ninhydrin Rosen - Điện di gel polyacrylamit theo phơng pháp Laemmli; Sắc ký lọc gel sephadex -G75 theo phơng pháp cđa Andrew - C¸c kü tht tinh chÕ enxzym b»ng cách sử dụng phối hợp biện pháp siêu lọc sắc ký trao dổi ion sắc ký lọc gel KIểm tra sản phaame SDSPAGE kiểm tra khả gây dị ứng sản phẩm phân giải (panr ứng EaLISA) Phơng pháp khác: Các phơng pháp công nghệ sản xuất bittet, xúc xích thịt bò cấp thấp, sản xất nớc mắm Kết đạt đợc Đà phân lập lựa chọn đợc chủng vi khuẩn không sinh độc tố Bacilus susbtilis FS2 đợc phân lập từ chợp cá chủng hoạt động su tập Hoàn thiện quy trình thu nhận chế phẩm enzym với môi trờng nhân giống, môi trờng tổng hỵp enzym, thêi gian tèi thÝch thu nhËn enzym víi chất genlatin-polypepton-gkucose (0,3%-0,75%-1%), NaCl 1%, 35-37 oC, pH7,4 enzym thu nhận oqr pha cân (28h) Đề xuất 01 quy trình công nghệ thu nhận chế phẩm enzym tinh khiết Hoàn thiện 02 quy trình thu nhận en zym kỹ thuật Các quy trình cho phÐp thu håi enzym víi hiƯu xt 50-59% §· xác định đợc đặc tính co;agenaza B subtilis FS2; Điều kiện tối u cho phản øng enzym : 50oC, pH 9; enzym bỊn ë nhiƯt độ cao (mất 15% 35 % hoạt độ 60oC vµ 65oC), bỊn vïng pH 5-10; KLPT cđa enzym: 125kDa, bao gồm hai dới-đơn vị có KLPT mối phần 60 kDa; chất đặc hiệu: colagen gelatin Chế phẩm enzym đợc làm ổn định với chất bổ sung ổn định khác nhau, dới dạng chế phẩm kỹ thuật cho mục đích sử dơng kh¸c nhau: Tinh bét biÕn tÝnh, Ca+2, Chitosan Chế phẩm đợc thử nghiệm ổn định hoạt tính thời gian bảo quản Khảo sát tính an toàn chế phẩm cho thấy chế phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn Đà nghiên cứu thăm dò khả sử dụng colagenaza từ B Subtilis FS2 để làm giảm tính gây dị ứng số protein thực phẩm làm sở tạo sản phẩm không dị ứng Sử dụng colagenaza làm tăng chất lợng thịt chứa nhiều colagen, nâng cao giá trị gia tăng cho sản phẩm Colagenaza đợc chứng minh tính đặc hiệu làm mềm thịt Nghiện cứu thăm dò khả sử dụng colagenaza sản xuất nớc mắm cho thấy enzym thuỷ phân da cá sau ngày nuôi cấy FS2 Hàm lợng axit amin chợp cá tăng 25% bổ sung enzym chợp Kết cho phép nâng cao hiệu xuất thu hồi rót ng¾n thêi gian läc n−íc m¾m 10 Thư nghiƯm s¶n xt mét sè s¶n phÈm: ChÕ phÈm enzym kỹ thuật, gia vị chứa colagenaza, xúc xích bittet từ thịt bò chứa nhiwuf colagen Mục lục mở đầu Nội dung báo cáo Chơng Tổng quan tình hình nghiên cứu Colagenaza 10 1.1 Khái niệm colagenaza 10 1.2 Tình hình nghiên cứu colagenaza giới 10 1.2.1 Tìm kiếm nguồn colagenaza 10 1.2.2 Khả tổng hợp colagenaza 12 2.3 Một số tính chất colagenaza đà đợc phát 12 Nghiên cứu colagenaza Việt Nam 14 1.4.Khả sử dụng colagenaza 14 1.4.1 Sư dơng colagenaza nghiªn cøu colagen 14 1.4.2 Sư dơng colagenaza c«n g nghiƯp thùc phÈm 14 1.4.3 Sư dơng colagenaza y tÕ- d−ỵc- mü phÈm 17 Chơng II Lựa chọn đối tợng vấn đề nghiên cứu 19 2.1 Đối tợng nghiên cứu 19 2.2 Vấn đề nghiên cứu 20 Chơng III Phơng pháp nghiên cøu 21 3.1 VËt liƯu, thiÕt bÞ 21 3.1.1 VËt liệu Hoá chất 21 3.1.2 Thiết bị 22 3.2 Phơng pháp nghiên cứu 22 3.2.1 Các phơng pháp vi sinh vật 22 3.2.2 Các phơng pháp hoá sinh 23 3.2.3 Nghiên cứu ứng dụng 24 Chơng IV Kết nghiên cứu 27 4.1 Phân lập tuyển chọn định tên vi khuẩn có khả sinh tổng hợp colagenaza 27 4.1.1.Phân lập hệ vi khuẩn tổng hợp colagenaza 4.1.2 Định tên Vi khuẩn 4.2.Nghiên cứu quy trình sinh tổng hợp colagenaza từ B subtilis FS-2 4.2.1 ảnh hởng chÊt lªn sù sinh tr−ëng cđa vi khn 4.2.2 Nghiªn cứu tổng hợp cảm ứng colagenaza B subtilis FS-2 4.2.3 ảnh hởng NaCl 4.3 Động thái tạo thành colagenaza 27 28 28 28 29 32 34 4.4 Nghiªn cứu quy trình thu hồi tinh chế enzim 4.4.1 Quy tr×nh thu nhËn chÕ phÈm enzym tinh khiÕt 4.4.2 Quy tr×nh thu nhËn chÕ phÈm enzym kü thuËt 4.5 Nghiên cứu tính chất colagenaza 4.5.1 Khối lợng phân tử 4.5.2 ảnh hởng nhiệt độ lên hoạt tính tính ổn nhiệt enzym 4.5.3 ảnh hởng pH lên hoạt độ tính ổn định pH enzym 4.5.4 Tính đặc hiệu chất 4.6 Nghiên cứu øng dông 35 35 39 42 42 42 44 45 47 4.6.1 Kiểm định tính an toàn chế phẩm enzim 47 4.6.2 Nghiên cứu ổn định enzim 47 4.6.3 Thử nghiệm khả phân giải colagen làm mền thịt 49 4.6.4 Thử nghiệm khả phân giải colagen da cá enzym FS 52 4.6.5 Khả sử dụng colagenaza phân giải số protein dị ứng 53 4.6.6 Thử nghiệm sản xuất số sản phẩm thử nghiệm 54 Chơng V Đánh giá kết 56 5.1 Độ tin cậy kết 56 5.2 Tính ổn địng công nghệ 56 5.3 kết đào tạo 56 5.4 Đánh giá toàn diện 56 Kết luận kiến nghị 57 Tài liệu tham khảo 60 Phần phụ lục 65 Mở đầu Trong hệ thống protein động vật, colagen Hàm lợng colagen thể động vật lớn, chiếm 30% thành phần protein khung mạng thể chất bền, khó phân giải nhấn số protein Colagenaza enzym có khả phân giải colagen chất trạng thái nguyên thuỷ Việc tìm kiếm sản xuất Colagenaza trở nên vô hấp dẫn, đặc biệt năm gần mà ngành công nghiệp có vị trí quan trọng Cho tíi nay, nhiỊu vi sinh vËt , chđ u vi khuẩn đợc phát có khả tổng hợp Colagenaza Các nhà nghiên cứu đà phân lập đợc từ đất, nớc biển số nguồn khát số vi khuẩn có khả tổng hợp Colagenaza Tuy nhiên, đa số vi sinh vật sinh Colagenaza đà đợc phát lại vi sinh vật gây bệnh sinh độc tố (Clostrdium, Vibrio hay Pseudomoná) Điều làm cho việc sử dụng Colagenaza bị hạn chế chế phẩm enzym thiết phải hoàn toàn tinh khiết, vấn đề trở ngại chủ yếu cho đời chủa chế phẩm enzym Việc tìm kiếm nguồn Colagenaza an toàn khai thác sử dụng chúng có ý nghĩa mặt khao học ứng dụng Trong trình nghiên cứu thăm dò, đà phân tách từ thực phẩm lên men truyền thống thu nhập Việt Nam nớc lân cận tập hợp vi khuẩn có khả tổng hợp Colagenaza Vấn đề nghiên cứu đợc đặt khuôn khổ đề tài KC 04-07là: "Nghiên cứu phân lập tuyển chọn sinh tổng hợp enzym Colagenaza ứng dụng thực phẩm" nội dung Báo cáo Trong số chất ổn định trên, TBBT chi khả ổn định tốt nồng ®é 35% 38 ¶nh 10 ChÕ phÈm colagenaza 4.6.3 Thư nghiệm khả phân giải colagen làm mềm thịt Trong thí nghiệm này, kiểm tra tính đặc hiệu thuỷ phân colagenase sử dụng colagenase làm mềm thịt nhằm cải thiện đặc điểm bất lợi nh thịt nhũn tác dụng sử dụng enzym làm mềm thịt trớc Để đạt đợc mục đích thí nghiệm, cho colagenase lần lợt thuỷ phân colagen protein tinh khiết Sau kiểm tra lại khả thuỷ phân enzym cho thuỷ phân thịt chứa nhiều colagen Kết thuỷ phân collagen (SPC) collagenase FS-2 đợc biểu diễn 12.5% SDS-PAGE (hình 17A): Chuỗi - colagen đợc mũi tên Collagenase FS-2 thuỷ phân collagen (đờng 3) sau 6h nhanh colagenase kiểm chứng khác (đờng đờng 4) Kết chứng minh khả thuỷ phân colagen colagenase FS2 Hình 17 Tính thuỷ phân đặc hiệu colagenase A, Sản phẩm thuỷ phân colagen collagenase CN2 (đờng 2), FS2 (đờng 3) M2-4 (đờng 4) SDS-PAGE 12.5% (Nagano et al., 2001) B, Myofibrillar (đờng 1) myofibrillar thuỷ phân với collagenase FS-2 30min (đờng 2), 60 (đờng 3) SDS-PAGE 15% Tính thuỷ phân đặc hiệu colagenase đợc chứng minh colagenase không thuỷ phân myofibrillra sau 30 60 ủ với colagenase (hình 17B) Đờng chạy (myofibrin) cho thấy vị trí băng protein ứng với actin muosin 45 kDa 205 kDa Sản phẩm thuỷ phân myofibrin với colagenase (đờng 4) cho thấy actin myosin không bị thuỷ phân Nh sử dụng colagenase làm mềm thịt loại trừ nhợc điểm thờng gặp phải sử dụng enzym làm mềm khác tính không đặc hiệu chúng Thí nghiệm phân giải bò colagenase từ FS-2 (bảng 5) chi thấy sau 30 - 120 phút ủ với enzym, hàm lợng nhóm - NH2 mẫu thử nghiệm tăng so với mẫu đối chứng 200 - 1200% Điều khẳng định khả 39 sử dụng colagenase từ FS-2 cho thuỷ phân colagen, làm sở cho việc làm tăng cao chất lợng thịt chứa nhiều colagen làm mềm thịt Bảng Biến đổi hàm lợng - NH2 thuỷ phân gân bò collagenase FS - -NH2 (mg/g) MÉu 30 60 90 KiÓm chøng 0.02 0.02 0.02 MÉu 0.04 0.08 0.24 α-NH2 mÉu (%) 200 400 1200 Kết phân tích mẫu thịt bò cấp thấp (thịt vai) đợc xử lý với enzym cho thÊy sau thêi gian xư lý 30 - 120 phót, hàm lợng nhóm - NH2 mẫu thử nghiệm tăng so với mẫu đối chứng từ 167 - 1687% (bảng 6) Nh vậy, việc thuỷ phân mở đờng colagen colagenase đợc hỗ trợ protease khác có mặt chế phẩm, làm giá trị thịt tăng cao so với mẫu không xử lý Tuy nhiên,do điều kiện phân tích cấu trúc nên cha có thông tin vỊ biÕn ®ỉi cÊu tróc cđa mÉu xư lý dới dạng tác dụng enzym Bảng Hàm lợng - NH2 (mg/g) giải phóng tác dụng colagenase FS - Thời gian xử Gâm bò Thịt bò Xóc xÝch tõ thÞt cỉ MÉu KC MÉu TN MÉu KC MÉu TN MÉu KC MÉu TN lý (phót) 30 0,04 0,08 0,10 (100%) 60 0,02 (200%) (100%) (125%) 0,02 0,08(400 0.08 0,38 7,31 8,61 (475%) (100%) (117%) %) 120 0.02 0.24 0.08 (1200%) 135 (1678%) 40 4.6.4 Thử nghiệm khả phân giải colagen da cá enzym FS2 Kết cho thấy khả phân giải da cá vi khuẩn B.subtilis FS-2 chợp cá không cao So với mẫu đối chứng hàm lợng axit amin tăng không đáng kể ( hình 18A) da cá không bị thay đổi nhiều Bề mặt da lớp bên Hiện tợng có hể đợc giải thích nồng độ muối cao chợp cá đà ức chế khả sinh tổng hợp colagenaza chợp (hình 18 va phụ lục E) ///////////// Hình 18: Sự tăng nồng độ axit amin chợp cá bổ sung FS2 (A) enzym (B) Dung dịch enzym colagenase FS-2 có bổ sung da cá đợc giữ ngày Quan sát độ thay đổi da cá dới kính hiển vi thấy mẫu da cá cấu trúc sợi ngang, dÃn nở lớn, sắc tố dần bị mỏng đi, suốt mẫu có bổ sung colagenaza hàm lợng axit amin tăng lên đáng kể so với mẫu đối chứng Rõ ràng, colagenaza đà hoạt động tốt môi trờng có nồng độ muối cao Điều mở khả sử dụng colagenaza vào khâu lọc để giảm bớt khó khăn đồng thời rút ngắn thời gian sản xuất nớc mắm Sau bổ sung, colagenaza hoạt động tốt sau khoảng thời gian 24 - 48 Vậy sản xuất nớc mắm muốn đạt hiệu xử lý cao ta kết hợp phơng pháp: bổ sung B.subtilis FS-2 vào giai đoạn đầu công đoạn muối cá giai đoạn cuối trình bổ5 sung colagenaza ( hình 18B) 4.5.6 Khả sử dụng colagenase phân giải số protein dị ứng Nh đà trình bày phần phơng pháp, gliadin - casein đợc sử dụng thí nghiệm phân giải colagenase Subtilis FS-2 với vai trò chấ protein có khả gây dị ứng để thử nghiệm khả làm 41 giảm tính gây dị ứng enzym Các hỗn hợp phản ứng đệm photphat natri 0,1 M, pH7 víi tû lƯ enzym: c¬ chất 1: 100 đợc ủ 370C 24 máy lắc ngang Mẫu đối chứng hỗn hợp tơng tự thay dung dịch enzym dung dịch đệm Sản phẩm phản ứng đợc phân tách SDS-PAGE nồng độ 12,5% Kết phân tách hỗn hợp sản phẩm phân giải gliadin - casein b»ng colagenase cđa β Subtilis FS-2 trªn SDS - PAGE 12,55 đợc trình bày hình 19 Kết cho thÊy c¸c mÉu sau 24 giê xư lý víi enzym điện di đồ băng protein gliadin - casein Colagenase có khả biến cấu trúc protein này, phân giải chất dị ứng tái kết hợp tạo thành chất có KLPT cao mà không phân giải tơí axit amin sau 24 thí nghiệm ////// Các phản ứng phân giải gliadin - casein colagenase từ B Subtilis FS-2 đợc gửi thử nghiệm với huyết bệnh nhân dị ứng với sản phẩm sữa bột mỳ phản ứng ELISA Theo đánh giá, giá trị đo đợc hỗn hợp phản ứng miễn dịch ELISA cho giá trị nhỏ 0,05 (đo bớc sóng 490mm) sản phẩm thử nghiệm tính dị ứng Kết thử nghiệm ELISA với sản phẩm phân giải colagenase sau 24 gliadin - casein cho giá trị nhỏ 0,05 thử nghiệm với gliadin - casein mẫu đối chứng 24 nh mẫu thí nghiệm cho kết lớn 2.0 Nh vậy, sau đợc xử lý 24 với colagenase B Subtilis FS-2, sản phẩm phân giải protein dị ứng nghiên cứu tính gây dị ứng Kết thí nghiệm đà chứng minh khả sử dụng colagenase thu đợc từ B Subtilis FS-2 việc cải thiện tính chất gây dị ứng số thực phẩm gây dị ứng nghiên cứu thông qua khả phân cắt hạn chế đặc 42 hiệu thân colagenase Việc sử dụng colagenase từ B Subtilis FS-2 cho thấy kết tơng tự nh kết sư dơng colagenase tõ C.histobyticum víi tÝnh chÊt c«ng nghƯ cải thiện so với việc sử dụng proteaza phân cắt không đặc hiệu khác Hơn nữa, khả phân cắt hạn chế protein tới peptit mà không tới axit amin colagenase së cho viƯc sư dơng enzym nµy cho viƯc thủ phân hạn chế protein với mục đích cải thiện tính chất chức dinh dỡng protein công nghệ protein 4.6.6 Thử nghiệm sản xuất số sản phẩm thử nghiệm Sản phẩm từ thịt bò cấp thấp: Từ kết thu đợc, tiến hành thử nghiệm sản xuất số sản phẩm từ thịt bò cấp thấp chứa nhiều colagen (xuc xich tõ thÞt vai, thÞt cỉ, bittet thÞt vai), xư lý víi colagenase cđa FS-2 60 ë nhiƯt ®é 110C, đánh giá khả thủy phân mẫu đánh giá cảm quan sơ mẫu thí nghiệm Kết thực nghiệm cho thấy có khác biệt hàm lợng NH2 mẫu xử lý so với đối chứng (tăng tơng ứng 7,5 17% Kết đánh giá cảm quan so sánh cho thấy có khác biệt độ mềm mẫu Quy trình tạo sản phẩm nh sau: Thịt (vai, chân bò) Loại bỏ màng, gân Xay nhỏ - 2mm Để qua đêm - 200C Làm ấm 40C/4h Gia vÞ bỉ sung -> Phèi trén - > colagenase Ph¶n øng 11-150C/1h 43 ↓ Nhåi xóc xÝch ↓ SÊy Bảo quản sản phẩm định lợng, định hình bitet Đong gói chân không Bảo quản sản phẩm Công thức sản phẩm thử nghiệm nh sau: Thịt bß : 100gam NaCl : 0,75gam Na5P3O10 : 0,5gam Colagenaza : 128U Gia vị chứa colagenase Trên sở kết trình bày trên, thiết lập công thức gia vị chứa colagenase dùng cho thịt bò chứa nhiều colagenase để sử dụng thông dụng Tất thành phần gia vị đợc sấy kho tách riêng tớc đem phối trộn với Gia vị chứa 10U/g colagenase ảnh chụp mẫu sản phẩm đợc trình bày phụ lục F Chơng V Đánh giá kết 5.1 Độ tin cậy kết Mọi thí nghiệm thực báo cáo đợc lặp lại hai lần Các thí nghiệm đợc thùc hiƯn víi ho¸ chÊt tinh khiÕt sư dơng cho nghiên cứu Thiết bị phơng pháp nghiên cứulà thông dụng, đại tin cậy Do số liệu thu đợc theo tài số liệu trung thực, xác tin cậy 5.2 Tính ổn định công nghệ Các quy trình công nghệ kết nghiên cứu để đề tài đợc lặp lại không dới 50 lần Các lần thí nghiệm cho kết lặp lại Nh quy trình công nghệ đề tài tin cậy ổn định, nhiên mô hình phòng thí nghiệm 44 Một yếu tố khác cần lu ý mục tiêu đề tài sử dụng colagenase cho sản xuất thực phẩm, để đề tài chủ trơng tập trung nghiên cứu quy trình thu nhận chế phẩm enzym kỹ thuật an toàn Quy trình đà đợc hoàn chỉnh kiểm tra tính ổn định nh điều kiện ổn định hoạt tính enzym Enzym đợc kiêm tra tính an toàn để dùng thực phẩm 5.3 Kết đào tạo Đề tài đà tham gia đào tạo 04 cán khoa học trình độ đại học, 01 tiến sĩ nâng cao trình độ cá cán tham gia đề tài lĩnh vực công nghệ enzym công nghệ vi sinh 5.4 Đánh giá toàn diện Đề tài nghiên cứu đà hoàn thành mục tiêu nghiên cứu đặt Các kết đề tài đà góp thêm kiến thức công nghệ enzym Việt Nam (enzym colagenase enzym cha đợc nghiên cứu Việt Nam) nh tìm nguồn enzym an toàn cho phép khai thác sử dụng enzym cho thực phảam ngành khác Do đề tài nghiên cứu mở đầu nh mục tiêu đề tài tìm kiếm nguồn enzym, kết đề tài quy mô phòng thí nghiệm Kết luận kiến nghị Từ kết nghiên cứu đà trình bày, xin đợc rút số kết luận sau đây: Đà phân lập xác định hoạt tính colagenase hệ vi sinh vËt cđa mét sè thùc phÈm lªn men truyền thống Việt Nam nớc lân cận Đà lựa chọn đợc chủng vi khuẩn không sinh độc tố Bacilus subtilis FS - đợc phân lập từ chợp cá chủng hoạt động su tập Hoàn thiện 01 quy trình tổng hợp enzym với môi trờng nhân giống, môi trờng tổng hợp enzym, thêi gian tèi thÝch thu nhËn enzym víi 45 c¬ chÊt lµ gelatin - polypepton - glucose (0,3% - 0,75% - 1%), NaCl 1%, 35 - 370C, pH 7,4 enzym thu nhận pha cân (28h) Đề xuÊt 01 quy tr×nh thu nhËn chÕ phÈm enzym tinh khiết Hoàn thiện 02 quy trình thu nhận enzym kỹ thuật Các quy trình cho phép thu hồi enzym với hiệu suất 50 - 59% Đà xác định đợc đặc tính colagenase B subtilis FS - 2: điều kiện tối u cho phản øng enzym: 50oC, pH 9; enzym bỊn ë nhiƯt ®é cao (mất 15% 35% hoạt độ 60oC 65oC), bỊn vïng pH - 10; KLPT cđa enzym: 125 kDa, bao gồm hai dới - đơn vị có KLPT phần 60 kDa; chất đặc hiệu: colagen gelatin Chế phẩm enzym đợc làm ổn định với chất bổ sung ổn định khác nhau, dới dạng chế phẩm kỹ thuật cho mục đích sử dụng khác nhau: tinh bột biến tính, Ca+2, ChitosanChế phẩm đợc thử nghiệm ổn định hoạt tính thời gian bảo quản Khảo sát tính an toàn chế phẩm cho thấy chế phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn Đà nghiên cứu thăm dò khả sử dụng colagenase từ B subtilis S - để làm giảm tính gây dị ứng số protein thực phẩm làm sở tạo sản phẩm không dị ứng Sử dụng colagenase làm tăng chất lợng v thịt chứa nhiều colagen, nâng cao giá trị tăng cho sản phẩm Colagenase đợc chứng minh đặc tính đặc hiệu làm mềm thịt Nghiên cứu thăm dò khả sử dụng colagenase sản xuất nớc mắm cho thấy enzym thuỷ phân dân tộc cá sau ngày nuôi cấy FS - Hàm lợng axit chợp cá tăng 25% bổ sung enzym chợp Kết cho phép nâng cao hiệu suất thu hồi rút ngắn thời gian lọc nớc mắm 10 Thử nghiệm sản xuất số sản phẩm: chế phẩm enzym kỹ thuật, gia vị chứa colagenase, xúc xích bitết từ thịt bò chứa nhiều colagen 46 Kiến nghị Cha có đủ thời gian, kinh phí sở vật chất để sản xuất thử enzym quy mô lớn hơn, thu nhận lợng lớn enzym để tiến đến giới thiệu sản phẩm rộng rÃi, khả đa kết nghiên cứu thực tế bị hạn chế Đề nghị đợc tiếp tục khai thác kết nghiên cứu khai thác ứng dụng thực tế lĩnh vực thực phẩm lĩnh vực khác Nhóm thực đề tài Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, sinh tổng hợp enzym colagenase ứng dụng thực phẩm xin trân trọng cảm ơn Bộ KHCN Ban chủ nhiệm chơng trình Công nghệ sinh học, Ban chủ nhiệm đề tài 04 - 07 đà cho phép đợc thực nội dung nghiên cứu đà đăng ký Chúng xin chân thành cảm ơn phối hợp Ban th ký đề tài đà giúp đỡ nhóm đề tài thủ tục hành cần thiết để ®Ị tµi cã thĨ thùc hiƯn ®óng tiÕn ®é Nhãm đề tài Colagenase xin trân trọng cảm ơn Ban lÃnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, trờng đại học Bách khoa Hà Nội đà hết lòng ủng hộ công việc nghiên cứu 47 Tài liệu tham khảo Nguyễn Quỳnh Anh Thu nhËn, øng dơng pepsin vµ proteaza axit cđa A.niger y học chăn nuôi đề tài Phó tiến sĩ khoa học, trờng Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội, 1985 Nguyễn Hữu Chấn Enzym xúc tác sinh học Nhà xuất Y học, Hà Nội, 1983 Một số phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật học Tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, 1987, 441 Lê Văn Nhơng Ngô Thị Mai Tổng hợp cảm ứng tổng hợp thể c¸c enzym ë vi sinh vËt Vi sinh vËt häc (tuyển tập) Tập II Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1975 Lơng Đức Phẩm, Hồ Sởng Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 19758, 470 Lâm Xuân Thanh, Nghiên cứu phơng pháp biến hình protein đậu tơng ứng dụng công nghiệp thực phẩm Đề tµi Phã tiÕn sÜ khoa häc kü thuËt, Hµ Néi, 1996 Phạm Quốc Thăng, Đồng Thanh Thu, Vũ Kim Thành Nghiên cứu sản xuất Pancreatin Báo cáo Hội nghị khoa học trờng Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội, 1983 Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn, Hoá học thực phẩm Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1994,292 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lẫn Dũng Enzym vi sinh vật Tập Nhà xuất Khoa häc vµ Kü tht, Hµ Néi, 1982 10 Tun tËp báo cáo khoa học Hội nghị khoa học trờng Đại học Bách khoa Hà Nội lần thứ 16 Tập I, Hà Nội, 1990 11 Tuyển tập báo cáo khoa học Hội thảo quốc gia khu vực nhân năm Louis Pasteur, Hà Nội, 1995 48 12 Viện công nghiệp thực phẩm Các công trình nghiên cứu ứng dụng Công nghệ sinh học Công nghiệp thực phẩm giai đoạn 1986 - 1995 Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1996 13 Wolgang Frit Sche Chơng 7: Enzym: Cơ sở hoá sinh vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Néi, 1983 14 AudigiÐ Cl., Zonszain F Biochimie Structure Doin Ðditeurs Paris, 1987 15 Cheftel JC., Cheftel H and Besancon P Introduction µ la biochimie et µ la technologie des aliments Vol 9eme tirage, Techniques et Documentation - Lavoisier, Paris, 1992 16 Chefel JC., Cuq JL Et Lorient D ProtÐines alimentaires Techniques et Documentation - Lavoisier, Paris, 1985 17 Cuq Jean - Louis Les mÐthods modernes d’analyse rapide en microbiologie alimentaire Agro - alimentaire information N.9, C.D.I.U.P.A., Massy, Paris, 1993 18 Ribardeau - Dumas B., Bringion G., Grosclaude F et Mercier J.C Structure primÌre de la casÐine β-A2 bovine Sequence complete Eur J Biochem 225, 1972, 505 - 514 19 Scriban RenÐ Biotechnologie Technique et Documentation Lavoisier, Paris, 1993 20 Weil Jack Henry Biochimie gÐnÐrale 8e Ðdition, Masson, Paris, 1997 21 Adornnithee S., Akiyama K., Sasaki T., Takata R Isolation and characterization of a colagenolytic enzyme from Bacillus licheniformis N22 J Ferment Bioeng., 78, 1994, 283 - 287 22 Ahmed T., Fuchs G.J Gastrointestinal allergy to food: a review Diarrhoeal Dis Res Dec 15, 1997, 211 -223 23 Amano M., Ogawa H., Kofima K., Kamidair T., Suetsugu S., Yoshihama M., Satoh T., Samejima T and Matsumoto I Identification of 49 the major allergents in wheat flour responsible for bakers asthma Biochem J 330, 1998, 1229 - 1234 24 Andrew P The gel filtration behavior of protein related to their molecular weihgts over a wide range Biochem J 96, 1965, 595 - 606 25 Ashie I.N.A and Shimpson B.K α2- macroglobulin inhibition of endogenous protease in fish muscle J Food Sci., 61, 1996, 357 - 361 26 Bailey A.j The chemistry of intramuscular colagen In “Recent advances in the chemistry of meat” Royal Society of Chmistry, London 1984, 22-27 27 Barman T.E Enzyme handbook Vol.2 1985, 2nd ed., Springer Verlag, Berlin - Heidenberg 28 Bernal V.M and Stanley D.W Change in the melting characteristic bovinetendon colagen induced by a bacterial colagenase J Food Sci 51, 1986, 834 - 835 29 Bernal V.M and Stanley D.W Stability of bovine muscle cnnective tissues J Food Sci., 52, 1987, 876-878 30 Boethling R.S.J> Bacteriol 123 1975, 954-960 31 Bond M.D and Van Wart H.E Characterization of the individual colagenase from Clostridium histolyticum Biochemistry, 23, 1984, 3085 3091 32 Brocklehurt K., Baines B.S., and Kierstan M.P.J Papain and other constituents of Cariva papaya L In “Topic in enzyme fermentation Biotechnology” Ellis Horwood Ltd Chicago, 1981 33 Claus D and Berkeley, R.C.W Bergeys manual of systematic bacteriology Vol 2, ed by Sneath, P.H.A Mair, N.S and Sharpe M.E., William and Wilkins, Baltimore, 1986, 1105 - 1139 34 Cronlund A.L and Woychik J.H Solubilisation of colagen in restructured beef with colagenase and α-amylase J Food Sci., 52, 1987, 857 - 860 50 35 Daarselaar M.C.C and Harder W Some aspects of the regulation of the production of the extracellular proteolytic enzyme by a marine bacterium Arch Microbiol 101, 1974, 21 - 34 36 Dickinson E and Stanby G Food Technol 41, 1987, 74 - 116 37 Drucker H Regulation of the exoprotease in Neurospora crassa: induction and repression of enzyme synthesis J Bacteriol 110, 1972, 1041 - 1049 38 Endo A., Murakawa S., Shimizuu H and Shiraishi Y Purification and properites of colagenase from a Streptomyces specie J Biochem., 102, 1987, 163 - 170 39 Enzyme nomenclature: Recommendations of the International union of Biochemistry Academic Press, New York, 1987 40 Enzyme structure databese http:/www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/e…es/ec/ec04/ec24/ec0003 index.html 41 Enzyme structure database http:/www.genome.ad.jp/dbgetbin/www bget.ec:3.4.24.3 42 Enzyme structure database http:/www.expasy.ch/cgi-bin get enzyme-entry3.4.24.3 43 Enzyme structure database http:/srs.ebi.ac.uk/srs5bin/cgi-b…tze+[BRENDA-EC number: “3.24.4.3’] 44 Fernando L Garcia - Carreno, M Patricia Hernades - Cortes and Norman F Harrd Enzyme with peptidase and proteinase activitiy from the digestive systems of a freshwater and a marine decapod J.Agric Food Chem 42, 1994, 1456 - 1461 45 Fiochi A., Restani P., Riva E., Restelli A.R., Biasucci G., Galli CL., Giovanimi M Meet allergy: II - Effect of food processing and enzymatic digestion on the allergenicity of bovine and ovine meats J Am Cool Nutr Jun, 14, 1995, 245 - 250 51 46 Fox P.F Food enzymology, vol.2 Elsevier Applied Science, London and New York, 1991 47 Fukushima J., Takeuchi H., Tanaka E., Hamajima K., Sato Y., Kawamono S., Morihara K., Keil B and Okuda K Molecular cloning and partial DNA sequencing of the colagenase gene of Vibrio alginolyticus Microbiol Immunol 34, 1990, 977 - 984 48 Furcolo G Marziali M and Businco L Food allergay: recent finding Pediatr Med Chir 18, 1996, 551 - 557 49 Gallop P.M., Seifter S and Meilman E Study on colagen J Biol Chem 227, 1957, 891 - 906 50 Gibbons R.J and McDonal J.B Degradation of colagenous substrates by Bacteroides melaninogenicus J Biochem 81, 1961, 614 621 51 Giger O., Charilaou C.C and Cundy K.R J Clin Microbiol., 19, 1984, 68 - 72 52 Gilles A.M and Keil B Cleavage of β-casein by colagenases from Achromobacter iophagus and Clostridium histolyticum FEBS letters 6, 1976, 369 - 372 53 Goldberg GI., Wilhelm SM., Kronberger A., Bauer E., Grant GA And Eisen AZ Human fibroblast colagenase J Boil Chem 261, 1986, 6600 - 6605 54 Goodwin, B.F.J., Rawcliffe, P.M Food alergies associated with cere al product Food Chem., 11, 1983, 321 - 338 52 ... HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT Đề tài cấp Nhà nước NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ ENZYM TRONG CHẾ BIẾN MỘT SỐ... lân cận tập hợp vi khuẩn có khả tổng hợp Colagenaza Vấn đề nghiên cứu đợc đặt khuôn khổ đề tài KC 04-07là: "Nghiên cứu phân lập tuyển chọn sinh tổng hợp enzym Colagenaza ứng dụng thực phẩm" nội... hành lên men tổng hợp enzym thu nhận đợc 5000mg chế phẩm enzym tinh khiết 400g chế phẩm enzym kỹ thuật Các enzym đợc sử dụng tiếp tục nghiên cứu chế độ ổn định enzym, khảo sát khả sử dụng chúng