VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HĨA HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI HỢP TÁC THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VIỆT NAM – CHLB ĐỨC TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH CÁC CHẤT HOẠT ĐỘNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN THUỘC BASIDIOMYCETES PHÂN LẬP TỪ RỪNG MƯA NHIỆT ĐỚI BẮC VIỆT NAM (2006- 2008) Cơ quan chủ trì: Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Mai Hương 7408 15/6/2009 Hà Nội, 2008 -1- MỤC LỤC MỤC LỤC PHẦN I MỘT SỐ THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI 1.1 Thời gian thực 205 1.2 Kinh phí duyệt 1.3 Danh sách cán tham gia thực dự án 1.4 Xuất xứ thỏa thuận có với đối tác nước ngồi 256 PHẦN II NỘI DUNG KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CỦA NHIỆM VỤ Tình hình nghiên cứu .7 1.1 Tình hình nghiên cứu nước 257 1.2 Tình hình nghiên cứu nước .257 Mục tiêu Nhiệm vụ .258 Nội dung nghiên cứu 258 Dự kiến sản phẩm 259 PHẦN III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 10 3.1 Môi trường 10 3.2 Phương pháp nghiên cứu 11 Phương pháp đánh giá hoạt tính enzym 12 Phương pháp phân tích đường khử 12 Thử hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity) 13 Phương pháp thử hoạt tính chống ơxi hố 13 Các phương pháp tách chiết xác định cấu trúc hoá học 13 Phương pháp phân loại chủng nấm lớn 14 Phương pháp nghiên cứu động vật thực nghiệm 14 PHẦN IV KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN 16 A PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM LỚN 16 I Quy trình phân lập nấm .16 II Kết phân lập 17 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MẪU QUẢ THỂ NẤM THU THẬP ĐƯỢC 20 Phân lập chủng nấm lớn rừng QG Cúc Phương rừng QG Cát Bà: 20 Phân lập chủng nấm lớn rừng Tuyên Quang (12 chủng) .25 B QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH SƠ BỘ VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC 20 I Nghiên cứu khả sinh enzym chủng nấm phân lập 26 Quy trình tách tinh enzym .26 Kết thử hoạt tính enzym 28 2.1 Khảo sát sơ hoạt tính enzym đĩa thạch 28 2.2 Khảo sát khả sinh enzym laccaza, mangan peroxidaza va lignin peroxidaza số chủng nấm lớn có hoạt tính enzym phân lập từ vườn quốc gia Cúc phương 30 2.3 Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym chủng CP8 312 II Kết sàng lọc hoạt tính sinh chống ơxy hố, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính gây độc tế bào 36 Quy trình chiết tách sơ dịch lên men chủng nấm .36 Kết thử hoạt tính 37 2.1 Hoạt tính chống oxy hoá hệ DPPH 367 2.2 Hoạt kháng vi sinh vật kiểm định 41 2.3 Kết hoạt tính gây độc tế bào ung thư 49 -2- III Nghiên cứu cấu trúc hợp chất phân lập từ chủng nấm MA10, HT hoạt tính sinh học chúng 55 3.1 Chủng nấm MA10 55 3.1.1 Quy trình phân lập chất 55 3.1.2 Kết phân lập chất xác định cấu trúc 55 3.2 Chủng nấm Hầu thủ (HT) 59 3.2.1 Phương pháp 59 3.2.2 Phương pháp 62 3.3 Kết thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro chất phân lập 67 3.3.1 Kết thử hoạt tính gây độc tế bào 67 3.3.2 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 67 3.3.3 Kết thử hoạt tính chống ơxi hố 68 IV Kết phân loại số chủng nấm lớn có hoạt tính cao 69 4.1 Xác định trình tự vùng ITS-rDNA chủng nấm phân lập MA5 MA27 69 4.2 Kết phân loại chủng MA10 70 4.3 Kết phân loại chủng HT .71 4.4 Chủng CP8 72 4.5 Các chủng phân loại CHLB Đức 73 C SẢN XUẤT VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM .73 I Kết Thử nghiệm in vivo tính an tồn hiệu lực chế phẩm HT1 động vật thực nghiệm .74 II Kết nghiên cứu an toàn chế phẩm HT1 74 III Kết nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ chế phẩm HT1 80 IV Tác dụng HT1 trình tạo máu .80 PHẦN V KẾT LUẬN .892 PHẦN VI DANH SÁCH CÁN BỘ ĐƯỢC ĐÀO TẠO THÔNG QUA DỰ ÁN 896 PHẦN VII DANH MỤC CÁC SẢN PHẨM CỦA ĐỀ TÀI 897 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 -3- PHẦN I MỘT SỐ THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI Đặt vấn đề: Nấm lớn số vi sinh vật hoại sinh sống nhiệu mơi trường sinh thái, chúng có vai trị lớn việc thúc đẩy tốc độ chu trình tuần hồn vật chất tự nhiên, khoáng hoá chất hữu cơ, làm mơi trường sinh thái tăng độ phì nhiêu cho đất Sau xenlulo, lignin thành phần sinh học khổng lồ sinh chất liệu hình thành chất mùn, than bùn than đá Là hợp phần polymer thơm, phần gắn kết rắn thành tế bào khoang thực vật Sự phân giải sinh học polyme rắn lignin nấm lớn trình đặc biệt quan trọng lợi ích sinh thái công nghệ sinh học, chẳng hạn ứng dụng công nghệ dệt nhuộm giấy, cải thiện đất trồng trọt, xử lý nước thải, tổng hợp sinh hoá học Vai trò phân giải chất hữu nấm, đặc biệt phân giải ligno-xenluloza chủ yếu enzym ngoại bào thuộc nhóm peroxidase, đặc trưng cho enzym laccase lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) versatile peroxidase (VP) ( Hakkata, 2001) Các loài nấm nghiên cứu Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Dichomitus squalens, Phlebia radiata, Heterobasidium annosum, Phellinus pini, Cyathus stercoreus, Ceriporiopsis subvermispora, Polypous thuộc nhóm Nấm mục trắng (white rot fungi) ( Hofrichter, 2002, 2004) Việt nam, nấm lớn ý từ lâu Từ việc thu hái nấm tự nhiên nuôi trồng, du nhập giống từ nước Cùng với phát triển khoa học kĩ thuật, khoảng 10 năm trở lại đây, bùng nổ xu hướng sử dụng nấm dược liệu từ việc bổ xung nguồn dinh dưỡng nhằm tăng cường sức khoẻ hệ miễn dịch, điều trị hỗ trợ phòng chống bệnh hiểm nghèo Tác dụng dương tính xu làm nấm lớn nói chung nấm dược liệu nói riêng ngày trở thành tâm điểm ý nhà khoa học nước Trong số cơng trình nghiên cứu nấm lớn Việt nam, trước hết phải kể đến cơng trình GS., TSKH Trịnh Tam Kiệt nhiều năm nghiên cứu cặn kẽ nấm lớn việt nam, phân bố, phân loại, hình thái tiềm nói chung Tiếp theo PGS., TS Lê bá Dũng với cơng trình nghiên cứu nấm vùng Tây ngun TS Lê Xuân Thám với nấm dược liệu nuôi trồng du nhập từ nước ngoài, GS., TS Nguyễn Lân Dũng với phương pháp nuôi trồng nấm ăn nấm dược liệu Gần dự án hợp tác Việt nam Hàn quốc “ Phát triển công nghệ sản xuất nấm dược liệu phục vụ tăng cường sức khoẻ” PGS., TS Nguyễn Thị Chính, trường đại học khoa học tự nhiên Tuy nhiên, dự án hầu hết nghiên cứu khác, chủ yếu tập trung vào phân tích thành phần dinh dưỡng, phương pháp nuôi trồng tổng kết kết nghiên cứu nước Nhật bản, Hàn quốc, Trung quốc khả điều trị số bệnh đối tượng nấm dược liệu Linh chi, Vân chi, nấm đầu khỉ …mà chưa có khảo sát nghiêm túc thành phần thành phần hố học chất có hoạt tính sinh học nấm dược liệu nói riêng nấm lớn nói chung Đặc biệt là, nay, Việt nam chưa có cơng bố nghiên cứu enzym ngoại bào có khả phân giải chất hữu khó tan từ nấm lớn Tất kết nghiên cứu nước cho thấy nấm lớn nguồn chất có hoạt tính sinh học nguồn gien đa dạng sinh học đầy hứa hẹn (Kenmoku H, et al.,2002 Timm Ankea, et al, 2002) Với y vọng từ rừng mưa nhiệt đới Việt nam, với thảm thực vật vô phong phú, cung cấp cho sưu tập nấm quí giá với khả tiềm ẩn chưa khai phá -4- Tên đề tài: Nghiên cứu khả sinh chất hoạt động sinh học số loài nấm lớn thuộc Basidiomycetes phân lập từ rừng mưa nhiệt đới Bắc Việt nam Chủ nhiệm dự án phía Việt Nam: Lê Mai Hương Học hàm, học vị, chuyên mơn : Phó giáo sư, Tiến sĩ Sinh học-chun ngành Vi sinh vật Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính, TS Từ tháng 9/2005 cơng nhận thành viên hội đồng biên tập tạp chí Agricultural Chemistry & Biotechnology Hàn quốc ( The Korean Society for Applied Biological Chemistry) Điện thoại quan: 844.8361899 Điện thoại nhà riêng: 8449716567 Điện thoại di động: 0936190907 Email: lehuong00@yahoo.com Địa quan: 18 đường Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy, Hà nội, Việt nam 55A phố Hàng chuối, Hà nội, Việt nam Địa nhà riêng: Cơ quan chủ trì phía Việt Nam : Cơ quan chủ trì: Viện Hố học Hợp chất thiên nhiên, Viện KH & CN Việt nam Địa chỉ: 18 đường Hoàng Quốc Việt, Cầu giấy, Hà nội, Việt nam Điện thoại: 844.8360830 Fax: 844.7564390 Chủ nhiệm đối tác nước ngoài: Martin Hofrichter Học hàm, học vị, chuyên môn : Giáo sư, TS Habil Điện thoại quan: 493583771521 Email: hofrichter@ihi-zittau.de Cơ quan đối tác nước ngoài: Viện trường đại họcquốc tế- Trường đại học tổng hợp Zittau, CHLB Đức Địa chỉ: Internationales Hochschulinstitut Zittau Markt 2302763 Zittau, Germany University of Applied Sciences Hochschule Zittau/Gôrlitz TheodorKôrner- allee 16, 02763 Zittau, Germany (03583)771521 Điện thoại: Fax: (03583)771534 1.1 Thời gian thực hiện: 03 năm: Từ tháng 1/2006 đến tháng 12/2008 1.2 Kinh phí duyệt: Kinh phí cấp: 950 triệu đồng -5- 1.3 Danh sách cán tham gia thực dự án: TT Họ tên A B Phía Việt Nam PGS.TS Lê Mai Hương GS.TS Châu Văn Minh ThS Trần Thị Như Hằng ThS Trần Thị Hồng Hà ThS Đỗ Hữu Nghị Phía đối tác nước GS TS Martin Hofrichter GS.TS Roland Schubert Ulrike Schneider TS Rene Ullrich TS Christiane Liers Cơ quan công tác Số tháng làm việc cho nhiệm vụ Viện Hoá học HCTN nt nt nt nt 30 16 16 16 16 Trường đại học tổng hợp Zittau, CHLB Đức nt nt nt nt 24 12 24 12 12 1.4 Xuất xứ thỏa thuận có với đối tác nước ngoài: Thời gian ký kết thoả thuận: 30/ 8/2005 Cấp ký kết thoả thuận: Viện hoá học Hơp chất thiên nhiên Viện trường đại học Zittau Các nội dung thoả thuận chính: - Thoả thuận trao đổi hợp tác khoa học hai quan viện Hoá học HCTN viện trường đại học zittau bao gồm: Tổ chức chương trình nghiên cứu; tổ chức chuyến thăm viếng trao đổi lãnh đạo hai bên; đào tạo cán khoa học trao dổi kĩ thuật, nguyên vật liệu xuất thông tin khoa học có liên quan; tổ chức hội thảo - Trước mắt, thời gian 2005- 2008, hai bên hợp tác thực dự án:” Nhận diện, khai thác tinh chế enzym chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn (Basidiomycetes) phân lập từ rừng mưa nhiệt đới phía Bắc Việt nam” Ban chủ nhiệm dự án phía Việt nam TS Lê Mai Hương PGS., TS Châu Văn Minh, phía Đức GS., TS Martin Hofrichter GS., TS Roland Schubert - Thoả thuận có hiệu lực thời hạn năm tính từ ngày kí xem xét gia hạn tiếp tục cho phù hợp với điều kiện thời điểm bên trước tháng trước thoả thuận hết hiệu lực -6- PHẦN II NỘI DUNG KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CỦA NHIỆM VỤ Tình hình nghiên cứu 1.1 Tình hình nghiên cứu nước Viện hoá học hợp chất thiên nhiên sở đầu lĩnh vực đánh giá hoạt tính sinh học chất có nguồn gốc thiên nhiên, bao gồm chất từ nấm Phịng thí nghiệm: Gồm 15 phịng thí nghiệm phịng chun mơn với đầy đủ trang thiết bị đầu tay phục vụ nghiên cứu nâng cấp thông qua dự án đầu tư chiều sâu “Nâng cấp trang thiết bị thí nghiệm Viện hố học hợp chất thiên nhiên năm 2001” Trang thiết bị chủ yếu: Các thiết bị phục vụ công tác chiết tách xác định cấu trúc (săc ký lỏng kết nối khối phổ HPLC –MS, sắc ký khí kết nối khối phổ GC – MS, phổ hồng ngoại IR, phổ tử ngoại UV, phổ công hưởng từ hạt nhân NMR (PTN Trung tâm) Trong lĩnh vực nghiên cứu hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên Việt nam, phịng thí nghiệm thử hoạt tính sinh học TS Hương phụ trách phịng thí nghiệm tiến hành kĩ thuật đánh giá hoạt tính sinh học chất có nguồn gốc thiên nhiên theo kĩ thuật đại với trang thiết bị tiên tiến tiến hành labo có tên tuổi giới, bao gồm kĩ thuật : Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư người, hoạt tính chống oxy hố, …Trong vài năm trở lại đây, phòng tập trung vào nghiên cứu chất có hoạt tính sinh y dược học từ nấm dược liệu Agaricus blazei, Lentinus eddodes, Herricium erinaceus, Coriolus versicolor Hiện phịng Sinh học thực nghiệm chủ trì thực số đề tài có liên quan đến nấm noiis chung nấm dược liệu nói riêng 1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Mặc dầu điều trị bệnh thảo dược có đề cập tới vai trò tăng cường miễn dịch nấm lớn, cần nói thêm khả hình thành chất có hoạt tính kháng sinh từ nấm Có thể nói, nấm lớn nguồn chất kháng sinh vô phong phú từ tự nhiên Các glucan thành tế bào nấm chất có khả kích thích miễn dịch, cịn chất trao đổi thứ cấp lại có khả diệt khuẩn kháng vi rút mạnh Thêm vào đó, chúng cịn co khả kháng kí sinh trùng, bao gồm kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum (UK Biodiversity Group) Tác giả khác( Sway et al., 2000) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm nấm ăn, thuộc nhóm agaricales cho thấy nấm sị (Pleurotus ostreatus) có khả kháng nấm Asp Niger số 31 nấm đáng gờm gây bệnh phổi nhà nơng Yamabushitake (Hericium erinaceus) có hoạt tính kháng nấm mốc Aspergillus niger nấm men Saccharomyces cervesiae Ngoài ra, nấm cịn có hoạt tính dịng tế bào HeLa (Kenmoku H., et al., 2002) Bên cạnh chất trao đổi phân tử nhỏ ngoại bào có hoạt tính mà chất phân tử lớn biểu hoạtt ính kháng vi sinh vật gây bệnh Chẳng hạn polysaccharide lentinan từ nấm Hương -7- (Lentinus edodes) schizophyllan nấm lỗ (Schizophyllum commune) biểu hoạt tính kháng nấm men gây bệnh Candida albicans tụ cầu vàng Staphylococcus aureus Lentinan cịn có hoạt tính ức chế Mycobacterium tuberculosis Listeria monocytogenes , chất chiết từ khuẩn ty nấm cịn có hoạt tính kháng virus herpes virus type (HSV-1) Thêm nữa, polysaccharides lentinan kích thích hệ thần kinh có hiệu đièu trị Alzheimer (Mizuno, T., 1995) Còn nghiên cứu khác nấm vân chi (Trametes versicolor) ức chế Candida albicans Một nghiên cứu khảo sát 13 bệnh nhân nữ bị bệnh nấm có kết tốt 12 người sau với nấm đông cô gà gỗ (Grifola frondosa) Tất kết cho thấy nấm lớn nguồn chất có hoạt tính sinh học nguồn gien đa dạng sinh học đầy hứa hẹn (Kenmoku H, et al.,2002 Timm Ankea, et al, 2002) Mục tiêu Nhiệm vụ - Góp phần tìm hiểu bổ xung nguồn đa dạng lớn nấm lớn phân bố vùng rừng mưa nhiệt đới Bắc Việt nam - Tìm kiếm, sàng lọc chất có hoạt tính sinh học chất xúc tác sinh học phục vụ đời sống; nâng cao hiệu sử dụng thông qua liệu đánh giá hoạt tính cấu trúc số chất có hoạt tính - Nâng cao trình độ, cập nhật kiến thức nghiên cứu khoa học cán thông qua trao đổi hợp tác với nước bạn Tăng cường tiềm lực khoa học bao gồm sở vật chất thiết bị Nội dung nghiên cứu: Nội dung nghiên cứu nước Phân lập chủng nấm từ gỗ mục, cành gãy từ thảm mục địa điểm quần thể khác rừng mưa nhiệt đới Bắc Việt nam: Cúc phương (Ninh bình), Cát bà (Quảng ninh), Sapa (Lào cai) Lập giống nấm bảo tồn bao gồm chủng phân lập có hoạt tính đáng ý(10-50 chủng) 1-2 chủng du nhập từ nước bạn Sàng lọc sơ hoạt tính enzym peroxidases phân giải lignin từ nấm sưu tập Sàng lọc chất có hoạt tính phục vụ y học từ dịch ni cấy nấm sưu tập theo hướng kháng vi sinh vật kiểm định, kháng u, chống ơxy hố; Nghiên cứu hố học chất có hoạt tính theo định hướng hoạt tính sinh học Sản xuất 01 chế phẩm thực phẩm chức thử nghiệm động vật thực nghiệm Sản xuất thử nghiệm 01 chế phẩm enzym thô trường với qui mô nhỏ Đào tạo xuất -8- Nội dung kế hoạch hợp tác với đối tác nước Nhận dạng xác định tên phân loại chủng nấm Sản xuất,tinh chế đặc tính enzym haloperoxidases, laccases, arylalcohol oxidases peroxidases phân giải lignin chủng có hoạt tính cao Phân lập trình tự gien chủng nấm có hoạt tính tiêu biểu Tách chiết nghiên cứu hố học chất có hoạt tính Thử nghiệm ứng dụng Đào tạo cán xuất Dự kiến sản phẩm: Bộ giống nấm thu thập phân lập vùng rừng núi phía Bắc Việt nam lí lịch sinh thái Tên khoa học chủng nấm phân loại Các liệu hoạt tính sinh học chủng nấm phân lập được: hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào, chống ơxy hố… Tính chất hố học chất có hoạt tính bao gồm kiện phổ, cấu trúc tính chất hố lí khác Chế phẩm enzym dạng thơ Enym tinh Chế phẩm nấm thơ có hoạt tính sinh học khác, chẳng hạn hoạt tính giảm cholesterol huyết chuột thí nghiệm Các chương trình xử lý số liệu phân tích kết Cơng bố 5- 10 báo báo cáo hội nghị, đào tạo NCS, thạc sĩ sinh viên -9- PHẦN III NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.1 Môi trường Môi trường phân lập nấm: Mẫu nấm phân lập mơi trường thạch malt 20% bổ sung chất kháng sinh kháng khuẩn kháng nấm trường hợp cần thiết mẫu phân lập có nguy nhiễm nấm vi khuẩn cao Các kháng sinh sử dụng là: Chloramphenicol, Penicillin, Streptomycin, Benomy 50 g/l Nystatin 40 g/l Môi trường nuôi cấy nấm: -Môi trường Khoai tây (g/l): Khoai tây 200; Đường 20; Thạch 15; -MT Giá đỗ (g/l): Giá đỗ 1%; Đường 2%; Pepton 0,5% -MT3 Cám gạo (g/l): Cám gạo 1%; Đường 2%; Pepton 0,5% -MT4 Bột cá (g/l): Bột cá nhạt 1%; Đường 2%; Pepton 0.5% -MT5 Bột ngô (g/l): Bột ngô 1%; Đường 2%; Pepton 0,5% -MT6 Đậu tương (g/l): Bột đậu 1%; Đường 2%; Pepton 0,5% Sáu loại MT lọc thơ vải lọc sau đổ vào bình tam giác 250ml lượng dịch 100ml tương ứng với loại MT -MT bổ sung vitamin: Khoai tây 1%; Đường 2%; Pepton 0,5%;vitamin B1 50mg/l; Vitamin B2 1mg/l; inozitol 50mg/l Mơi trường thử hoạt tính enzym - Kirk [g/l]: Glucoza 20; 2,2’ Dimetyl succinat 2,2; KH2PO4 2; MgSO4.7H2O 0,5; CaCl2 0,1; NH4C4H4O6 0,25; Cao nấm men 0,1; Agar: 20; pH=5 - MT Malt [g/l]:mạch nha: 50; Soya-Pepton: 3; Agar: 20; pH=5,6-6 - MT Đậu tương [g/l]: Đậu tương bột: 30; Agar:20; pH=5,5 - MT khoai tây [g/l]: Khoai tây: 200; Glucoza: 20; Agar: 15; pH=5,5 - MT Cà chua: 400ml nước cà chua (200g cà chua gọt vỏ, bỏ hạt, bổ xung 200ml H2O cất, xay nhỏ); Agar: 20g; bổ xung nước cất cho đủ 1000ml - MT Bột gỗ [g/l] : Bột gỗ: 30; Agar: 15; pH=5,5 - Dung dịch khoáng: Na2HPO4 1g; axit xitric: 2,5g - MT thử hoạt tính Xenluloza: Dung dịch khống 200ml; 1g Na-CMC; 4g thạch - MT thử hoạt tính Amilaza: Tinh bột tan 2g; 200ml dung dịch khoáng; 4g thạch - MT thử thử khả khuyếch tán Enzyme phân giải Lignin: Môi trường Malt; chất thị ABTS [2,2’-azinobis(3-ethylthiazoline-6-sulfonate)] - Mt thử hoạt tính phân giải lipit: CaCl2.H2O: 0,001g; pepton: 5g; thạch: 15g; Tween 80: 10ml (bổ xung sau khử trùng) - Các môi trường nuôi cấy thử hoạt tính enzym: Ni cấy nấm mơi trường có thành phần dinh dưỡng khác có kí hiệu SH1- SH9 dựa mơi trường mơi trường Kirk (kí hiệu: K) [g/l]: Glucoza 20; 2,2’ Dimetyl succinat 2,2; KH2PO4 2; MgSO4.7H2O 0,5; CaCl2 0,1; NH4C4H4O6 0,25; Cao nấm men 0,1; pH=5 + Môi trường SH2: K + 0,2mM MnCl2 + Môi trường SH1: K + 0,1mM MnCl2 + Môi trường SH3: K + 1,0mM MnCl2 + Môi trường SH4: K + 2,0mM MnCl2 + Môi trường SH5: K + 4,0mM MnCl2 + Môi trường SH6: K + 10,0mM MnCl2 + Môi trường SH7: K + 50ml Malt+10ml cà chua + Môi trường SH8: K + 30 ml cà chua+ 30ml H2O - 10 - 24 42,85 d 1,76 m 25 32,85 d 33,10 d 1,38 m 26 19,44 q 19,66 q 0,84 (d, J=6,5 Hz) 27 21,51 q 19,96 q 0,82 (d, J=6,5 Hz) 28 a 43,23 d 17,76 q 17,62 q 0,91 (d, J=6,5 Hz) đo CDCl3, b125 Mhz, c500MHz Hình 2.2.3.c Phỉ 13C-NMR cđa MH-3 50 H×nh 2.2.3.d Phỉ 13C-NMR phổ DEPT MH-3 Độ chuyển dịch hóa học dạng píc đa vạch H 3,63 (1H, m, H-3) đặc trng cho cấu hình proton H-3 tơng ứng với cấu hình nhóm OH vị trí [8] Nối đôi ngoại vòng đợc xác định dạng trans giá trị số tơng tác lớn (J = 15,5 Hz) Cùng với xuất nhóm metyl, nối đôi nội vòng bị vị trí gợi ý tới hợp chất ergosterol, steroit phổ biến thiên nhiên Từ tất phân tích đà nêu, giá trị phổ 13C-NMR MH3 đợc mang so sánh với giá trị đà đợc công bố ergosterol [13] Sự phù hợp hoàn toàn vị trí tơng ứng cho phép khẳng định hợp chất MH-3 ergosterol Hỵp chÊt MH4 - Ergosterol peroxide Hỵp chÊt MH4 nhận đợc dới dạng tinh thể hình kim màu trắng Công thức phân tử C28H44O3 đợc xác định liệu phổ khối với píc ion [M+H]+ 429,2 với liệu phổ 1H-, 13C- NMR phổ DEPT 28 21 22 24 20 18 17 11 26 25 27 13 19 23 14 10 HO O O H×nh 2.2.4.a CÊu tróc hãa häc cđa MH-4 51 H×nh 2.2.4.b Phỉ 1H-NMR cđa MH-4 Phỉ 1H vµ 13C-NMR cđa MH4 tơng tự nh MH3 ngoại trừ tín hiệu cacbon nối đôi thay vào xuất tín hiệu cacbon bậc bốn liên kết trực tiếp với nguyên tử ôxy vùng trờng thấp 79,44 (s) 82,17 (s) Điều gợi ý tới xuất cầu peroxide MH4 dạng dẫn xuất MH3 52 Hình 2.2.4.c Phổ 13C-NMR phổ DEPT MH-4 Bảng Giá trị phỉ NMR cđa MH4 C δC [9] δC a, b δHa, c HMBC (H→C) (multicipility, J in Hz) 30,20 t 30,09 t 1,56 (m) 1,85 (m) 34,77 t 34,71 t 1,72 (m) 1,96 (m) 66,47 d 66,49 d 3,97 (m) 39,44 t 39,37 t 1,27 (m) 1,97 (m) 82,15 s 82,17 s - 135,22 d 135,22 d 6,24 (d, 8,5) C-5, 8, 10 130,77 d 130,75 d 6,50 (d, 8,5) C-5, 8, 9, 10 79,42 s 79,44 s - 51,25 d 51,12 d 1,51 (m) 10 37,03 s 36,99 s - 11 20,66 t 20,64 t 1,41 (m) 1,62 (m) 12 37,03 t 39,91 t 1,55 (m) 2,11 (m) 13 44,61 s 44,58 s - 14 51,76 d 51,70 d 1,58 (m) 15 23,44 t 23,42 t 1,25 (m) 1,53 (m) 16 28,59 t 28,65 t 1,37 (m) 1,78 (m) 17 56,33 d 56,23 d 1,24 (m) 18 12,90 q 12,88 q 0,86 (m) 19 18,18 q 18,18 q 0,88 (m) 20 39,64 d 39,73 d 2,03 (m) 21 20,90 q 20,89 q 1,01 (d, 7,0) C-17, 20, 22 22 135,45 d 135,44 d 5,14 (dd, 8,5, C-20, 21, 24 53 15,5) 23 132,33 d 5,22 (dd, 8,5, 15,5) 24 42,82 d 42,79 d 1,87 (m) 25 33,11 d 33,08 d 1,50 (m) 26 19,64 q 19,65 q 0,88 (d, 6,5) 27 19,93 q 19,96 q 0,83 (d, 6,5) 28 a 132,39 d 17,56 q 17,57 q C-20, 24, 28 0,91 (d, 6,5) đo CDCl3, b125 Mhz, c500MHz Hình 2.2.4.d Phỉ HSQC cđa MH-4 54 H×nh 2.2.4.e Phỉ HMBC cđa MH-4 55 Từ tất phân tích đà nêu, số liệu phổ 13C-NMR MH4 đợc mang so sánh với số liệu đà đợc công bố hợp chất ergosterol peroxide [9], trùng khớp hoàn toàn giá trị tơng ứng cho phép khẳng định cÊu tróc hãa häc cđa MH4 lµ 5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol (egosterol peroxide) Ngoài điều lần đợc khẳng định tơng tác phổ cộng hởng từ hạt nhân hai chiều HMBC (Bảng Hình 2.2.4.e) Theo tài liệu đà công bố, hợp chất thể hoạt tính kháng Escherichia coli Salmonella typhimurium (với giá trị IC50 tơng ứng 350 500 àg/ml) [10], chống dị ứng [11] Ngoài hợp chất thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung th dày (SNU-1), ung th− gan (SNU354), ung th− trùc trµng vµ sarcoma-180 chuột với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) tơng ứng 18,7, 158,2, 84,6 74,1 àg/ml [12] Hình 2.2.4.f Phổ ESI-MS MH-4 2.2.5 Hợp chất MH5 - -Adenosine Hợp chất MH5 nhận đợc dới dạng tinh thể hình kim màu trắng Công thức phân tử đợc xác định C10H13N5O4 dựa kết phổ khối lợng ESIMS (tại m/z 267,8 [M+H]+ 289,8 [M+Na]+) phổ cộng hởng từ hạt nhân (1H, 13 C-NMR vµ DEPT) NH2 N N N N HO 5' O H 4' H 3' OH 1' H 2' H OH H×nh 2.2.5.a CÊu tróc hãa häc cđa MH-5 56 Hình 2.2.5.b Phổ 1H-NMR MH-5 Trên phổ 1H-NMR MH5 xuất tín hiệu đặc trng đơn vị đờng -D-Ribofuranosyl 5,88 (d, J = 6,5 Hz, H-1’), 4,61 (dd, J = 4,0 vµ 10,5 Hz, H-2’), 4,15 (br s, H-3’), 3,97 (dd, J = 3,5 vµ 6,5 Hz, H-4’), 3,57 (m, Ha-5’) vµ 3,68 (m, Hb-5’) B¶ng KÕt qu¶ phỉ NMR cđa MH5 δHa, c C δC [13] δ 152,5 d 152,41 d 8,14 (s) 149,1 s 149,08 s - 119,4 s 119,37 s - 156,2 s 156,17 s - 140,0 d 139,95 d 8,34 (s) C-4, 1’ 88,1 d 87,95 d 5,88 (d, 6,5) C-4, 8, 2’ 2’ 73,6 d 73,47 d 4,61 (dd, 4,0, 10,5) 3’ 70,8 d 70,68 d 4,15 (br s) 4’ 86,1 d 85,92 d 3,97 (dd, 3,5, 6,5) 5’ 61,8 t 61,69 t 3,57 (m) a, b C (multiplicity, J in Hz) HMBC (H→C) C-4, 57 3,68 (m) NH2 - 7,32 (s) OH-2’ - - 5,42 * OH-3’ - - 5,17 (d, 3,0) OH-5’ a - - C-5 5,43 * đo DMSO, b125 Mhz, c500MHz Hình 2.2.5.c Phổ 13C-NMR phổ DEPT MH-5 58 Hình 2.2.5.d Phổ HSQC MH-5 Trên phổ 13C-NMR xuất tÝn hiƯu cđa 10 cacbon víi C, CH CH2 Trong đó, tín hiệu đơn vị đờng -D-Ribofuranosyl đợc khẳng định 87,95 (d, C-1’), 73,47 (d, C-2’), 70,68 (d, C-3’), 85,92 (d, C-4) 61,69 (t, C5) [14] Hình 2.2.5.e Phổ HSQC cđa MH-5 59 H×nh 2.2.5.f Phỉ ESI-MS cđa MH-5 Tõ phân tích đà nêu trên, số liệu phổ 13C-NMR MH5 đợc mang so sánh với giá trị đà công bố hợp chất -Adenosine [13] Sự phù hợp hoàn toàn giá trị tơng ứng cho phép khẳng định cấu trúc hóa học MH5 9-D-Ribofuranosyladenine hay -Adenosine Điều lần đợc khẳng định tơng tác phổ cộng hởng từ hạt nhân hai chiều HMBC (Bảng Hình 2.2.5.e) 60 III Chủng Hàu thủ (Phơng pháp 2) Bằng sắc kÝ cét nhiỊu lÇn víi chÊt hÊp phơ silica gel hệ dung môi rửa giải khác đà thu đợc ba hợp chất từ dịch chiết diclometan H.erinaceum Hợp chất thu đợc dạng tinh thể màu trắng, có đ.n.c 178-1800C Phổ hồng ngoại cho đỉnh hấp thụ đặc trng cho dao động hoá trị nhóm hydroxyl (OH) 3400cm-1 liên kÕt C-O-C ë 1050cm-1 Phỉ khèi bơi electron ESI-MS cho pic ion phân tử m/z 427 [M-H]+ tơng ứng với công thức phân tử C28H44O3 hoàn toàn phù hợp với kết phổ NMR Phổ 13C-NMR xuất tín hiệu 28 nguyên tử cacbon đặc trng cho khung sterol, bao gåm: cacbon bËc bèn, 11 nhãm metin CH, nhãm metylen CH2 vµ nhãm metyl CH3 Trong tín hiệu hai nguyên tử cacbon bậc bốn liên kết với cầu nối epidioxy ë δC: 79.4ppm (C8) vµ 82.2ppm (C-5) hoµn toµn phï hợp với tín hiệu đà đợc xếp lại phỉ HMQC vµ HMBC cđa Chau Van Minh vµ céng sù (Chau Van Minh et al., 2004) Phæ 1H-NMR cho tín hiệu đặc trng cho liên kết đôi víi hai duplet ë δH: 6.24ppm (1H, d, J=7.5Hz, H-6); 6.51ppm (1H, d, J=7.5Hz, H-7) vµ hai duplet duplet ë δH: 5.16ppm (1H, dd, J=7.5 vµ 14.5Hz, H-22); 5.22ppm (1H, dd, J=7.0 15.0Hz, H-23), tín hiệu cđa mét multiplet ë δH 3.96ppm (1H, m, H-3) víi độ chuyển dịch nguyên tử cacbon C 66.5ppm (C-3) khẳng định cho có mặt nhóm OH liên kết với cacbon vị trí số với cấu hình -3-ol (Sheu et al 2000) Qua việc phân tích phổ hợp chất so sánh với tài liệu, đà nhận dạng đợc hợp chất 5,8-Epidioxy-5, 8-ergosta-6,22E-dien-3-ol hay ergosterol peroxide đà đợc phân lập từ loài nấm mục gỗ Inonotus radiatus (Kristi karlos & CS,1989) Các liệu phổ hợp chất hoàn toàn trùng hợp với tài liệu tham khảo (bảng III.4.11) 5,8-Epidioxy-5, 8-ergosta-6,22E-dien-3-ol (1) Tinh thể hình kim, mầu trắng, đ.n.c 178-1800C, []0D-29 (CHCl3, c.0.8); IRKBr max cm-1: 3400 (br, OH), 1050 (C-O-C) ESI-MS (m/z) 427 [M-H]+ (C28H44O3) 1H-NMR (500MHz, CDCl3): 1.90-1.95 (2H, m, H-1); 1.55-1.58 (2H, m, H-2); 3.96 (1H, m, H-3); 1.83-1.88 (2H, m, H-4); 6.24 (1H, d, J=7.5Hz, H-6); 6.51 (1H, d, J=7.5Hz, H-7); 1.67 (1H, m, H-9); 1.19-1.22 (2H, m, H-11), 1.42 (2H, m, H-12); 1.71(1H, m, H-14); 1.42-1.48 (2H, m, H-15); 1.47-1.50 (2H, m, H-16); 1.26 (1H, m, H-17); 0.83 (3H, s, H-18); 0.88 (3H, s, H-19); 1.65 (1H, m, H-20); 1.00 (3H, d, J= 6.5Hz, H-21); 5.16 (1H, dd, J=7.5 vµ 14.5Hz, H-22); 5.22 (1H, dd, J= 7.0 vµ 15.0Hz, H-23); 2.09-2.11 (2H, m, H-24, H-25); 0.79 (3H, d, J=5.5Hz, H-26); 0.81 (3H, d, J= 5.5Hz, H-27); 0.92 (3H, d, J=6.0Hz, H-28) 13C-NMR (125MHz, CDCl3) xem b¶ng III.3.11 61 28 28 22 18 26 18 23 17 12 19 20 22 27 19 17 12 20 26 23 27 O H HO O H HO OH O R R C OH NH HO OH B¶ng IV.3.11 Dữ liệu phổ 13C-NMR hợp chất Hỵp chÊt STT (CDCl3, 125MHz) 39.3 30.1 66.5 34.7 82.2 135.4 130.8 79.4 51.1 10 36.9 11 20.6 12 36.9 13 44.6 14 51.7 15 23.4 16 28.6 17 56.2 18 12.9 19 18.2 20 39.7 21 19.6 22 132.3 23 135.2 24 42.8 25 33.1 Tµi liƯu [1,2] (CDCl3, 125MHz) 39.5 30.1 66.5 36.8 82.1 135.4 130.8 79.5 51.1 36.9 20.6 39.5 44.7 51.6 23.4 28.2 56.4 12.9 18.7 39.7 19.6 132.3 135.2 42.8 33.0 Hỵp chÊt (CDCl3, 125MHz) 38.4 32.0 70.5 40.8 139.8 119.6 116.3 141.3 46.3 37.1 21.1 39.1 42.8 54.6 23.0 28.3 55.8 12.1 16.3 40.4 21.1 132.0 135.6 42.8 33.1 Tµi liƯu [3] (CDCl3, 125MHz) 38.3 31.7 70.0 40.5 139.3 119.5 115.9 140.7 46.2 37.0 21.1 39.1 42.7 54.4 23.6 28.2 55.7 12.1 16.3 40.2 21.1 131.5 135.0 42.7 33.0 62 26 27 28 19.9 20.9 17.6 19.9 20.7 17.5 20.0 19.6 17.6 19.9 19.6 17.6 Hợp chất phân lập đợc dạng tinh thể màu trắng, đ.n.c 168-1690C Phổ C-NMR cho tín hiệu nguyên tử cacbon đặc trng cho khung sterolC28 tơng tự hợp chất 1, nhiên tín hiệu hai nguyên tử cacbon bậc bốn hợp chất C 139.8ppm (C-5)/119.6 (C-6) 141.3ppm (C-8)/116.3 (C-7) cho thấy có mặt hai liên kết đôi vòng B Điều hoàn toàn phù hợp víi c¸c tÝn hiƯu cđa phỉ 1H-NMR víi δH : 5.56ppm (1H, dd, J=3.0 vµ 5.0Hz, H-6) vµ 5.39ppm (1H, dd, J=3.0 vµ 5.0Hz , H-7); cïng víi hai duplet duplet H 5.18ppm (1H, dd, J=7.5 14.5Hz, H-22); 5.23ppm (1H, dd, J=7.0 vµ 15.0Hz, H-23); mét multiplet ë H 3.63ppm (1H, m, H-3) với C 70.5ppm (C-3) đặc trng cho -3-ol Chúng nhận dạng đợc hợp chất ergosterol, liệu phổ trùng hợp với tài liệu tham khảo Ergosterol (2) Tinh thể hình kim, mầu trắng, đ.n.c 168-1690C, []0D -132 (CHCl3, c.0.5); ESI-MS (m/z) 395 [M-H]+ (C28H44O) 1H-NMR (500MHz, CDCl3): 3.63 (1H, m, H-3); 5.56 (1H, dd, J=3.0 vµ 5.0Hz, H-6); 5.39 (1H, dd, J=3.0 vµ 5.0Hz, H-7); 0.63 (3H, s, H-18); 0.95 (3H, s, H-19); 1.03 (3H, d, J=8.0Hz, H-21); 5.18 (1H, dd, J=7.5 vµ 14.5Hz, H-22); 5.23(1H, dd, J=7.0 vµ 15.0Hz, H-23); 0.78 (3H, d, J=6.0Hz, H-26); 0.79 (3H, d, J=6.0Hz, H-27); 0.92 (3H, d, J=6.0Hz, H-28) 13 C-NMR (125MHz, CDCl3) (bảng III.3.11) Hợp chất có dạng bột mầu trắng, liệu phổ NMR hợp chất đặc tr−ng cho kiĨu cÊu tróc cđa hỵp chÊt ceramide Phỉ 1H-NMR cho tÝn hiƯu cđa mét duplet t¹i δH 7.49 (1H, d, J=9.0Hz) đặc trng cho proton NH, tín hiệu cđa proton carbinol t¹i δH 3.76 (1H, dd, J=4.5 vµ 11.5Hz, H-1a), 3.81 (1H, dd, J=4.5 vµ 11.5Hz, H-1b); 3.55 (1H, dd, J=2.5 vµ 3.5Hz, H-3); 3.54 (1H, m, H-4); vµ 4.05 (1H, dd, J=4.0 vµ 8.5Hz, H-2’) Ngoµi tín hiệu singlet tù H 1.29 triplet hai nhóm CH3 đầu mạch H 0.88 (6H, t, J=6.5Hz) điển hình cho kiểu hợp chất ceramide với nhánh hidrocacbon no mạch dài nhánh axit béo 2-hydroxy Phổ 13C-NMR cho tÝn hiƯu cđa nhãm cacbonyl t¹i δC 176.0ppm, tín hiệu nguyên tử cacbon liên kết với nitơ ë δC 51.9ppm cïng víi tÝn hiƯu cđa cacbon carbinol C 61.4ppm (C-1); 75.8ppm (C-3); 72.6ppm (C-4) 72.2ppm (C-2) Dữ liệu phổ hợp chất đà đợc so sánh với alomacrorrhiza A cho thấy hoàn toàn phï hỵp víi cÊu tróc kiĨu hỵp chÊt ceramide Tuy nhiên, để nhận dạng xác cấu trúc hợp chất cần phải có thêm vài nghiên cứu khác Vì hợp chất hoạt tính độc tế bào không tiếp tục sâu nghiên cứu cấu trúc nhận dạng hợp chất ceramide Ceramide (3) Chất bột màu trắng 1H-NMR (500MHz, CDCl3): 3.76 (1H, dd, J=4.5 vµ 11.5Hz, H-1a), 3.81 (1H, dd, J=4.5 vµ 11.5Hz, H-1b); 4.11 (1H, dd, J=4.5 vµ 8.5Hz, H-2); 3.55 (1H, dd, J=2.5 vµ 3.5Hz, H-3); 3.54 (1H, m, H-4); 1.60 (2H, m, H-5); 4.05 (1H, dd, J=4.0 vµ 8.5Hz, H-2’); 1.77 (1H, m, H-3a); 1.67 (1H, m, H-3b); 7.49 (1H, d, J=9.0Hz, NH); 0,88 (6H, t, J=6.5Hz, CH3) 13C-NMR (125MHz, CDCl3): 13 63 61.4ppm (C-1); 51.9 (C-2); 75.8ppm (C-3); 72.6ppm (C-4); 176.0 (C=O, C-1’) vµ 72.2 (C-2’) 64 ... enzym chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn (Basidiomycetes) phân lập từ rừng mưa nhiệt đới phía Bắc Việt nam? ?? Ban chủ nhiệm dự án phía Việt nam TS Lê Mai Hương PGS., TS Châu Văn Minh, phía Đức... học số loài nấm lớn thuộc Basidiomycetes phân lập từ rừng mưa nhiệt đới Bắc Việt nam Chủ nhiệm dự án phía Việt Nam: Lê Mai Hương Học hàm, học vị, chun mơn : Phó giáo sư, Tiến sĩ Sinh học- chuyên... từ rừng mưa nhiệt đới Việt nam, với thảm thực vật vô phong phú, cung cấp cho sưu tập nấm quí giá với khả tiềm ẩn chưa khai phá -4- Tên đề tài: Nghiên cứu khả sinh chất hoạt động sinh học số loài