Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của đềtài 9 Phân tích, xây dựng ngân hàng dữliệu hệprotein huyết thanh người Việt Nam bình thường và một sốtrạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2, leukemia,...) bằng các kỹthuật proteomics và bioinformatics; 9 Nhận dạng và xác định các ứng viên chỉthịprotein có biến đổi vềcấu trúc và chức năng liên quan đến sựphát sinh và phát triển của bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia ởViệt Nam; 9 Nghiên cứu khảnăng ứng dụng các chỉthịprotein trong phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia. Nội dung chính của đềtài 9 Phân tích, xây dựng ngân hàng dữliệu hệprotein huyết thanh người Việt Nam bình thường và một sốtrạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2 và leukemia…) bằng các kỹthuật proteomics và bioinformatics 9 Phân tích, nhận dạng và xác định các ứng viên chỉthịprotein (protein markers candidates) đối với bệnh đái tháo đường type 2 và leukemia 9 Thửnghiệm ứng dụng các ứng viên chỉthịprotein trong chẩn đoán
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI XÂY DỰNG NGÂN HÀNG DỮ LIỆU HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI VIỆT NAM ĐỂ ĐỐI PHĨ CHẨN ĐỐN BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE VÀ UNG THƯ CNĐT: PHAN VĂN CHI 8315 HÀ NỘI – 2011 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU Hiện nay, nghiên cứu y sinh học đại, triển khai kỹ thuật proteomics tìm kiếm biomarker có khả ứng dụng việc phát hiện, chẩn đoán điều trị bệnh nan y mối quan tâm nhà khoa học giới Việt Nam Biomarker khơng địi hỏi bước nghiên cứu nhiều thử thách truy tìm gen liên quan đến bệnh lý, hay việc tạo sản phẩm protein trị liệu, vaccine thường địi hỏi kỹ thuật cao, cơng phu tốn Trang bị nghiên cứu biomarker thiết bị phân tách, làm nhận dạng, xác định protein/proteome (hệ máy khối phổ phân giải cao cộng với khả sử dụng chương trình điện tốn proteomics) thiết lập số sở nghiên cứu Hơn nữa, có lợi điểm khơng số lượng mẫu phẩm dồi loại bệnh, mà dồi kiện lâm sàng việc đánh giá khả ứng dụng biomarker trị liệu Đây yếu tố cần thiết cho thống kê để thu đựơc biomarker có độ xác cao qua việc xác định loại trừ protein nhóm biomarker Điểm đặc biệt giá trị đặc thù biomarker có liên quan đến “dấu ấn” sinh học chủng tộc Các dấu ấn chủ đề quan trọng cho nghiên cứu y học từ nguyên nhân bệnh lý tác động môi trường, dược học việc tìm kiếm hay thẩm định tính trị liệu dược phẩm Việt Nam Với kỹ thuật kết bước đầu thu nhận thời gian vừa qua cán Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam nghiên cứu hệ protein huyết người Việt Nam kĩ thuật proteomics coi tiền đề cho nghiên cứu mối quan hệ marker protein liên kết với số bệnh lý chẩn đoán lâm sàng Đó mục đích nghiên cứu hệ protein người nói chung hệ protein huyết người nói riêng, tìm hiểu tranh tổng thể protein biểu hiện, có thêm hiểu biết biến đổi hệ protein trạng thái bệnh lý khả khai thác, sử dụng thay đổi công cụ chẩn đoán điều trị bệnh cho người Trên sở trang thiết bị đồng đại proteomics đầu tư theo Dự án “Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen” Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam kết nghiên cứu bước đầu xác lập phương pháp phân tích protein/proteome, tìm kiếm thị protein huyết người thời gian qua, phê duyệt đề tài “Xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type leukemia” giai đoạn 2008-2010 với mục đích nghiên cứu có hệ thống hệ protein huyết người Việt Nam trạng thái bình thường trạng thái bệnh ĐTĐT2, leukemia, tìm protein có biến đổi đặc trưng cho trạng thái bệnh phát triển thành thị chẩn đoán bệnh Mục tiêu đề tài Phân tích, xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thường số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2, leukemia, ) kỹ thuật proteomics bioinformatics; Nhận dạng xác định ứng viên thị protein có biến đổi cấu trúc chức liên quan đến phát sinh phát triển bệnh đái tháo đường type leukemia Việt Nam; Nghiên cứu khả ứng dụng thị protein phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type leukemia Nội dung đề tài Phân tích, xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thường số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type leukemia…) kỹ thuật proteomics bioinformatics Phân tích, nhận dạng xác định ứng viên thị protein (protein markers candidates) bệnh đái tháo đường type leukemia Thử nghiệm ứng dụng ứng viên thị protein chẩn đoán PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tại phải nghiên cứu hệ protein (proteome)? Thách thức nhà sinh vật học sử dụng phong phú thơng tin di truyền sẵn có từ chương trình xác định trình tự gen khơng phải để giải mã trình tự acid amin protein mã hóa mà cịn xác định chức chúng Có nhiều nhân tố có ảnh hưởng đến gen, biểu protein trực tiếp đến protein Vì thơng tin gen protein hai chiều, kiểu hình (phenotype) tế bào bị ảnh hưởng tương tác trình chuyển hố điều chỉnh cách thống bên tế bào Protein đầu chức tế bào cho biết thơng tin thích đáng nhất, đặc biệt giải thích biểu chúng có tính đến động học ngữ cảnh trình hóa sinh đặc biệt Sự biểu chức protein điều hoà nhiều thời điểm, từ phiên mã đến dịch mã sau dịch mã Các q trình này, nói chung khơng thể dự đốn từ kết phân tích trình tự gen Sau dịch mã, đa phần phân tử protein lại bị biến đổi hoá học tương tác protein-protein hay phản ứng với nhóm carbohydrate, phosphate Chính biến đổi (post-translational modifications, PTMs) đóng vai trị chủ yếu kích hoạt chức nhiều protein khơng phải mã hố trực tiếp từ gen Kết từ gen ban đầu ta tìm thấy đa dạng biểu hiện, cấu trúc chức nhiều loại protein khác Ở thể khác nhau, mức độ đa dạng khác Những nghiên cứu sơ cho thấy, từ gen phát sinh từ tới hai protein vi khuẩn, ba nấm men, tới sáu người (Wilkins MR et al, 1996; Banks RE et al, 2000; Tyers M and Mann M, 2003) Trên sở số gen phát khả biến đổi sau dịch mã, người ta ước tính thể người có tới triệu protein cần nghiên cứu (Banks RE et al, 2000; Jensen ON, 2004) Từ phân tích ta thấy, proteome bổ trợ genome, hai khái niệm khác không gian thời gian Khi trình tự gen khơng thể cho biết thơng tin biến đổi sau phiên mã có ảnh hưởng định đến chức hoạt tính protein mức độ biểu gen khơng thể phản ánh số lượng protein có hoạt tính tế bào Thực có khoảng 2% số bệnh tật biết xác định có sai lệch trình tự gen, hay cịn coi monogenic (Strohman R, 1994); 98 % số bệnh lại cần làm sáng tỏ mức tương tác protein, hay gọi mạng protein (protein network) (Ideker T et al, 2008 ) Bài toán đặc biệt quan trọng proteomics bao gồm việc xác định PTMs vai trò chúng q trình điều hồ tương tác protein-protein Nghiên cứu proteome nghiên cứu trực tiếp chức genome, trả lời câu hỏi sau: (i) phần genome biểu hiện; (ii) đâu, có sản phẩm biểu hiện; (iii) sản phẩm protein bị biến đổi (iv) sản phẩm có tương tác kết tương tác Bộ gen tập hợp thơng tin mã hố dẫn cho q trình tạo protein, cịn proteome phức tạp nhiều Dựa phân loại vùng (domain) có liên quan đến chức protein, Venter cộng (Venter JC et al, 2001) tiến hành dự đoán phân chia tỷ lệ sản phẩm protein có từ hệ gen người (Nanni L et al, 2010) Cho đến chưa xác định xác liệu có loại protein có tế bào người Những cơng bố gần cho thấy, xác định giải cho 21 037 trình tự protein từ gen người (Imanishi T et al, 2004) Cùng với phát triển kỹ thuật proteomics, ngày có thêm nhiều loại protein nhận dạng xác định, bổ trợ cho trình tự cơng bố gen Ví dụ, huyết người, năm 2002 phát 490 loại protein khác (Adkins JN et al, 2002) cơng bố năm 2004 cho thấy số 1.444 (Chan KH et al, 2004) gần nhất, năm 2005, theo kết xác định so sánh 35 phịng thí nghiệm dự án proteome huyết tương người HUPO, số 3.020 (Omenn GS et al, 2005) Lượng thông tin phong phú nghiên cứu proteome đem lại hoàn toàn bổ trợ cho thông tin di truyền từ nghiên cứu genome Proteomics sở cho phát triển genomics chức Sự phối hợp genomics, proteomics bioinformatics đóng vai trị chủ đạo nghiên cứu sinh-y học, tảng cho phát triển sản phẩm chẩn đoán chữa bệnh tương lai Chỉ ngoại trừ số bệnh di truyền, mà gen đóng vai trị quan trọng chẩn đốn, phần lớn bệnh mãn tính ung thư, tim mạch, đái tháo đường liên quan đến mức độ biểu hiện, hoạt động tương tác protein (Kristine AP et al, 2009) Như vậy, dấu ấn sinh học (biomarker) hay gọi “chữ ký” (signature) trường hợp thị protein, phân tử khơng mang bí ẩn q trình bệnh lý, mà cịn mang tính đặc thù, liên quan tới nhiều yếu tố, bao gồm vấn đề chủng tộc sinh thái Việc truy tìm chữ ký sinh học giúp đạt kết có tầm ứng dụng hữu hiệu lớn lao y học Nghiên cứu biomarkers giúp tạo mơ hình phân tử bệnh lý có khả khảo sát thí nghiệm cụ thể, qua xác định vai trò gen sản phẩm cho chẩn đốn trị liệu Theo xu hướng phát triển môn Genomics, Proteomics Bioinformatics, có mạng lưới liên kết phịng thí nghiệm nhằm tiến đến tạo dựng kho liệu (consortium) biomarker cho bệnh lý đề tài sinh học khác (http://www.innovation.org/index.cfm/NewsCenter/Briefings/The_Biomarkers_Consortium ) Trên sở đánh giá tình hình nghiên cứu, phân tích cơng trình nghiên cứu có liên quan thấy, proteomics thật làm thay đổi nhiều sinh học ngành liên quan Nhờ có khái niệm proteomics, sống phiên genome tĩnh lặng thật trở thành proteome động Việc nghiên cứu proteome-tập hợp protein biểu bổ trợ hệ gen mô hay kiểu tế bào, giúp thu thơng tin bổ sung hữu ích cho kiến thức hỗ trợ cho nghiên cứu chẩn đốn lâm sàng Đây cách tiếp cận để tìm kiếm biomarkers, “chữ ký” hay cịn coi nhóm gene hay protein tượng/dữ kiện sinh học Biomarker nghiên cứu trọng yếu sinh học đại năm qua, có kết cho thấy tầm quan trọng tương quan lớn lao biomarker nhiều ngành mơn Sinh-Y- Dược học Từ cơng trình nghiên cứu biomarker nhiều trung tâm nghiên cứu, có thành hứa hẹn ứng dụng tốt đẹp biomarker cho việc chẩn đoán bệnh trị liệụ Việc ứng dụng biomarker để hoàn chỉnh thay thử nghiệm thường quy vấn đề thời gian Những biomarker nhằm giúp tiên đoán sớm xác trường hợp bệnh lý từ ung thư đến tim mạch, đái tháo đường…; biomarker có giá trị tiên đốn hiệu ứng thuốc để giúp chuyên gia y tế lấy định đắn cho việc điều trị bệnh nhân Đi xa nữa, biomarker có tiềm ứng dụng liệu pháp trị liệu cá nhân (personalized medicine) Như nêu trên, tảng nghiên cứu biomarker dựa protein, vai trị nghiên cứu proteomics thiết yếu Tuy nhiên, số lượng lớn lao (dự đoán khoảng có từ 300.000 đến 500.000 protein), đặc biệt chất phức tạp protein trở ngại lớn cho nghiên cứu biomarker Theo tài liệu nghiên cứu, có khoảng gần 1500 ứng viên proteins coi có liên quan đến ung thư đương nhiên việc tiêu chuẩn hóa protein cần thiết để chọn lọc protein thực có gía trị ứng dụng Hơn nữa, thực tế địi hỏi phải có thử nghiệm lâm sàng chi tiết dài hạn, trước triển khai biomarker thành sản phẩm có giá trị cộng đồng xã hội (Polanski M, Anderson NL, 2006; Austin MJF, Babiss L, 2006) Huyết hệ protein đặc biệt chẩn đoán bệnh, cách tiếp cận Sự hấp dẫn huyết việc chẩn đoán bệnh định hai đặc trưng: (i) mẫu lấy dễ dàng an tồn, (ii) mẫu khơng phản ánh tồn diện phenotype người, mà cho biết trạng thái thể thời điểm đặc biệt Có thể phân protein huyết thành nhóm: (1) Các protein tiết từ mơ Đó protein phần lớn tiết từ gan, ruột có khối lượng phân tử lớn 45 kDa, lớn kích thước phân tử lọc qua thận Chính vậy, chúng kéo dài thời gian lưu hành huyết thanh; (2) Các globulin miễn dịch Đó kháng thể hoạt động chủ yếu huyết tương, đại diện cho lớp protein phức tạp Đã có ước tính cho phải có tới hàng triệu trình tự kháng thể khác lưu hành hệ tuần hoàn người trưởng thành (Anderson NL, & Anderson NG, 2002); (3) Liên kết thụ cảm “khoảng cách xa” Trong nhóm protein gồm peptide ”cổ điển” protein hormone (ví dụ insulin, erythropoietin ; (4) Liên kết thụ cảm “địa phương” Loại bao gồm cytokine tác nhân điều hòa khoảng cách ngắn Đây thường peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, dễ dàng bị lọc qua thận Bởi vậy, chúng lưu hành thời gian ngắn huyết tương thiết kế để làm trung gian cho tương tác tế bào, sau hồ loãng vào huyết tương; (5) Các “hành khách” tạm thời Đó protein khơng phải hormone, tạm thời lưu thông huyết tương đường chuyển động tới vị trí hoạt động chúng Ví dụ, protein từ lysosome tiết sau qua hệ thụ cảm (receptor) tập hợp thể tiêu bào; (6) Các sản phẩm phát sinh từ mơ Đó protein hoạt động bình thường tế bào/mơ, giải phóng vào huyết tương sau tế bào bị chết bị tổn thương Các protein bao gồm nhiều loại marker quan trọng troponin, creatine kinase, myoglobin (đang sử dụng chẩn đoán bệnh nhồi máu tim); (7) Các protein tiết bị lỗi Những protein giải phóng từ khối u mơ bị bệnh Đó marker ung thư mà protein bình thường, tế bào khối u biểu hiện, tiết ra, giải phóng vào huyết tương; (8) Các protein ngoại lai Đó protein thể lây nhiễm (vi sinh vật) ký sinh giải phóng lưu hành hệ tuần hoàn Sự diện lớp protein kể cho thấy đa dạng đáng ngạc nhiên hệ proteome huyết Câu hỏi là: có protein có mặt huyết thanh? Nếu tính loại protein huyết lại có chừng 10 đến 20 dạng glycosyl hố với khoảng kích thước khác nhau, tổng số phải có khoảng 50 000 dạng phân tử protein khác Ngoài ra, phải kể đến nhóm lớn protein hình thành tiết từ mô sở số gen xác định gen người (25 000 – 30 000) số sản phẩm protein phát sinh từ gen (khoảng 10 protein/gen) Như vậy, mặt nguyên lý, huyết proteome toàn diện phiên lớn Sử dụng huyết chẩn đoán bệnh cách tiếp cận hiển nhiên, tiến hành thành công thập niên qua (Burtis CA & Ashwood ER, 1999; Lembo AJ et al, 2009; Magni F et al, 2010) Tuy nhiên, tiềm cách tiếp cận ”trực tiếp” lúc dễ xác định Thách thức lớn nghiên cứu proteome huyết người không số lượng lớn protein (>10 000 loại) có mặt đó, mà tỷ lệ hàm lượng chênh lệch chúng (1012) Chỉ nhóm nhỏ protein albumin, alpha2-macroglobulin, transferin immunoglobulin chiếm tới 80 % lượng protein tổng số huyết gây trở ngại cho việc ứng dụng kỹ thuật 2-DE truyền thống (Tirumalai RS et al., 2003; Zhang R et al, 2004, Sarker M, Hanumanthu G & Pandey A, 2007) Để tiến hành phân tích hữu hiệu, thơng thường protein có nồng độ cao thường phải loại bỏ, thực kỹ thuật hàng loạt protein quan trọng có nồng độ thấp (ví dụ, cytokine) bị loại theo Những công bố gần cho thấy, số lượng protein phân tích phương pháp khối phổ phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật xử lý tách chiết ban đầu mẫu huyết (Anderson NL & Anderson NG, 2002; Adkins JN et al, 2002; Celis JE et al, 2004; Tirumalai RS et al, 2003; Diamandis EP, 2007) Cũng lý kể trên, việc chọn kết hợp sử dụng hợp lý phương pháp, đặc biệt phương pháp có độ nhạy xác cao sắc ký lỏng đa chiều (MDLC) điện di gel kết hợp với hệ khối phổ liên tiếp (MALDI ESI-MS/MS) có độ nhạy phân giải cao, tự động phân tách, nhận diện xác định tổng thể, bao gồm protein/peptide nồng độ thấp (fmol) dựa Ngân hàng liệu Gen Protein NCBInr MSDB quan trọng phân tích tìm kiếm marker chẩn đốn huyết Một điểm đáng ý nghiên cứu hệ protein huyết hệ LC-MS/MS cho thấy khả phân tích nhận diện tồn diện khơng thành phần, mà cịn biến đổi cấu trúc tương tác nhiều loại protein Cũng vậy, nghiên cứu với cách tiếp cận tương tự giúp tìm kiếm protein marker đích thực cho việc giải thích chế bệnh sinh, chẩn đốn đánh giá tác động thuốc Sử dụng cách tiếp cận phương pháp mô tả cho phép thấy tranh tương tác tập hợp thị protein có nguồn gốc từ các mơ khác nhau, có liên quan đến q trình phát sinh phát triển bệnh lý, đề xuất phương pháp chẩn đoán đúng, loại trừ sai sót dựa thị đơn lẻ (Diamandis EP, 2004; Hortin GL et al, 2006; Horin GL, 2007) Đây nội dung mục đích nghiên cứu Dự án Proteome Huyết tương Người (Human Plasma Proteome Project) coi dự án quan trọng Tổ chức Nghiên cứu Proteome Người (Human Proteome Organization, HUPO, http://www.hupo.org; Asia and Oceania Human Proteome Organization, AOHUPO, http://www.aohupo.org) với tham gia hàng chục phịng thí nghiệm proteomics hàng đầu giới Cũng cần phải nói thêm, HUPO hoạt đông từ 2001, đạt nhiều thành tựu phối hợp thành phần nhà nước tư nhân, nỗ lực tạo dựng hợp tác có hiệu hệ nhà khoa học nghiên cứu proteomics, xây dựng tảng vững proteomics, mang lại trật tự nghiên cứu hệ protein tế bào, thúc đẩy nghiên cứu phát triển liên ngành Sinh-Y-Dược học Nếu hội nghị quốc tế HUPO thường niên lần 1-3 (Versailles 2002, Montreal 2003, Bejing 2004) chủ yếu giới thiệu kết giải mã hệ gen, hội nghị HUPO lần (Munich 2005) tập trung chủ yếu vào chức hệ gen (From Defining the Proteome to Understanding Function), tiêu đề hội nghị HUPO lần (California 2006) áp dụng nghiên cứu từ phịng thí nghiệm phục vụ người bệnh (Translating Proteomics from Bench to Bedside), từ hội nghị HUPO lần (Seoul 2007) phát triển công nghệ ứng dụng biomarkers (Proteomics: from Technology Development to Biomarkers Applications) Nghiên cứu proteomics đái tháo đường type Mặc dù, chế phân tử phát triển bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) biến chứng chúng nghiên cứu nhiều, hiểu biết để phát giai đoạn sớm ĐTĐ hạn chế Việc triển khai kỹ thuật sinh học phân tử mở hướng để tìm hiểu trình phát triển bệnh chẩn đốn bệnh giai đoạn sớm Bằng cách sử dụng kỹ thuật genomic nhà khoa học tìm số gen coi có liên quan đến bệnh ĐTĐ type như: PPARγ (Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ) (Yael R et al, 2010), IRS-1 (insulin receptor substrate 1) (Bishop JR et al, 2010), KCJN11 (potassium inward rectifier 6.2) (Winkler M et al, 2009), SLC2A1 (glucose transporter 1), PPARGC-1 (PPARγ -coactivator-1) (Joly E et al, 2009) CAPN10 (calpain 10), TCFL2 (transcription factor 7-like 2) (Chauhan G et al, 2010; Dennis T et al, 2010) Năm 2005, tổ chức nghiên cứu ĐTĐ Madras nghiên cứu đa hình gen k121Q nhận thấy chúng có vai trị quan trọng với phát triển bệnh ĐTĐ type tộc người châu Âu Á (Abate N et al, 2005) Mohan cộng nghiên cứu nhóm người Ấn Độ Châu Âu tìm thấy liên quan đa hình alen A Thr394Thr (G-A) gen PCG-1 với ĐTĐ type (Vimaleswaran KS et al, 2005) Ngoài ra, nghiên cứu mức độ biểu gen bệnh nhân ĐTĐ type 2, Rao cộng gen PBCs biểu tăng máu bệnh nhân này, đồng thời ông cho thấy mức độ biểu gen lipoprotein lipase (LPL) Apolipoprotein C – III (APOC III) có khác người bị ĐTĐ type hội chứng tăng lipid (Rao PV et al, 2005) Những nghiên cứu mở triển vọng cho nhà khoa học việc kiểm tra chế gây bệnh khả thị gen việc chẩn đoán bệnh ĐTĐ type Với phát triển kỹ thuật proteomic, biểu ĐTĐ type nghiên cứu mức độ protein (Hongfang L et al, 2010) Ngay từ năm 1996, Rema cộng cho thấy mức độ biểu haptoglobulin huyết tăng lên bệnh nhân ĐTĐ type so với mẫu đối chứng (Rema M, Mohan V, Snehalatha C, 1996) Năm 2004, Zhang cộng cách sử dụng 2DE kết hợp khối phổ mức độ biểu protein haptoglobulin, complement component 3, complement component 4, alpha2-HS glycoprotein, Alpha-1B-glycoprotein, Alpha-1-antichymotrypsin, Apolipoprotein-AI, Apolipoprotein B100, Factor H, Pro-platelet basic protein, Serine (hoặc cysteine) proteinase Inhibitor clade A, Serine (hoặc cysteine) proteinase Inhibitor clade C, Vitronectin precursor, Fibronectin, C1 inhibitor, Alpha-2 macroglobulin có thay đổi bệnh nhân ĐTĐ type (Zhang R et al, 2004) Khi nghiên cứu hệ protein nước tiểu cách sử dụng phương pháp proteomic, Jain cs tìm thấy biểu đặc biệt protein, thị ĐTĐ type 2: zinc alpha-2 glycoprotein, alpha-1 acid glycoprotein, alpha-1 microglobulin IgG (Jain S et al, 2005) năm 2009, Jiang H cộng chứng minh protein E-cadherin nước tiểu coi thị cho ĐTĐT2 (Jiang H et al, 2009) Nghiên cứu gần nhóm nhà khoa học người Ấn Độ hệ proteome nước tiểu cho thấy so sánh mức độ biểu protein nước tiểu bệnh nhân ĐTĐ bệnh thận so với ĐTĐ không mắc bênh thận DE protein có mức độ biểu tăng lên 1,5 lần ở: 1B-Glycoprotein tăng lần, zinc- 2-glycoprotein (5.9 lần), 2-HS-glycoprotein (4.7 lần), vitamin D–binding protein (VDBP) (4.8 lần), calgranulin B (3.9 lần), 1-antitrypsin (A1AT) (2.9 lần), hemopexin (2.4 lần ) Đặc biệt so sánh với mẫu đối chứng người ta nhận thấy VDBP tăng 11.1 lần, zinc- 2glycoprotein (6.0 lần), 2-HS-glycoprotein precursor (2.3 lần), A1AT (2.2 lần) Và protein có mức độ biểu giảm 1.5 lần bệnh nhân ĐTĐ bệnh thận so với ĐTĐ không mắc bệnh thận Transthyretin giảm 4.3 lần, apolipoprotein (apo) A-I (3.2 lần), 1microglobulin/bikunin precursor (AMBP) (1.61 lần), plasma retinol-binding protein (1.52 lần) So sánh với mẫu đối chứng mức độ giảm protein rõ rệt hơn: AMBP giảm 5.06 lần, retinol-binding protein (2.56 lần) apoA-I (2.53 lần) (Rao PV et al, 2007) Xinghai Li cộng Atk có chức phần đường tín hiệu insulin ức chế trực tiếp PGC-1γ (peroxisome proliferator activated receptorcoactivator) tế bào gan Con đường điều khiển tiết lipid ĐTĐ type ức chế PGC-1γ gây Akt dẫn đến hạn chế oxi hóa axit béo gan Đẩy mạnh tác động PGC-1γ tế bào gan kháng insulin chống lại khơng cân lipid quan sát thấy ĐTĐ type (Xinghai Li, 2007) Bên cạnh đó, nghiên cứu tế bào thần kinh Huang CJ cộng khẳng định protein Calcium-activated calpain-2 có liên quan đến phá hủy tế bào beta bệnh nhân ĐTĐ2 (Huang CJ et al, 2010) Như vậy, việc sử dụng kỹ thuật proteomic nghiên cứu hệ protein nói chung bệnh nhân ĐTĐ type mở hội việc tìm kiếm biomarker phục vụ chẩn đoán sớm bệnh Ở Việt Nam, tỷ lệ ngày gia tăng nguyên nhân biến tính phức tạp bệnh ĐTĐ type 2, nhiều nghiên cứu dịch tễ, phương pháp điều trị dự phòng tiến hành tổng kết (Tạ Văn Bình cs, 2006) Về mặt chẩn đốn, chủ yếu tập trung vào xét nghiệm đường huyết nhanh, xét nghiệm dung nạp đường qua đường miệng, xét nghiệm đường huyết ngẫu nhiên, xét nghiệm đường máu lúc đói tầm sốt máu chích đầu ngón tay Như vậy, bệnh thường phát nồng độ đường máu tăng cao (Nguyễn Khoa Diệu Vân cs, 2005; Tạ Văn Bình, 2006) Cũng có số nghiên cứu quan hệ nồng độ CPR (C reactive protein) – protein miễn dịch với BMI (body mass index) số bệnh nhân ĐTĐ type (Hoàng Đăng Mịch, 2006), hay giá trị HBA1C huyết chẩn đoán ĐTĐ (Nguyễn Thị Phương Mai cs, 2006) Nghiên cứu proteomics leukemia Leukemia dạng ung thư quan tạo huyết cầu tủy xương hệ thống bạch huyết (lymph system) Trong leukemia bạch cầu sản xuất cách nhanh chóng rối loạn tạo bạch cầu bất thường không hoạt động bạch cầu ung thư xâm lấn đến hồng cầu tiểu cầu, ngăn chặn sản xuất phá hủy tế bào Nói chung, leukemia chia làm dạng cấp tính mãn tính Leukemia cấp tính có triệu chứng sớm, tiến triển nhanh, khơng chẩn đốn điều trị sớm đưa đến tử vong nhanh có nhiều subtyp khác Leukemia loại mãn tính có tiến triển chậm, thường khơng có hay có triệu chứng nhiều năm Những nghiên cứu proteomics leukemia không làm sáng tỏ phân loại leukemia, mà cịn góp phần xác định kháng ngun ung thư, chẩn đốn sớm đánh giá q trình điều trị bệnh (Cui JW et al, 2004; Cui JW et al, 2005) Trong năm năm gần đây, với hồn thiện việc đọc trình tự hệ gen (genome) người phát triển mạnh mẽ phương pháp, kỹ thuật nhằm xác định chức gen mối liên quan chúng Đã có nghiên cứu chuyển đoạn nhiễm sắc thể, kiểu gen đặc biệt, đột biến liên quan mật thiết với bệnh ung thư bạch cầu Kết thay đổi phát thấy mức độ biểu mRNA, mức độ biểu protein nhờ phương pháp RT-PCR, DNA microarray, kỹ thuật/cách tiếp cận nghiên cứu proteomics điện di chiều, điện di chiều nhuộm huỳnh quang (2D-DIGE), khối phổ (MALDI/SELDI-MS/MS), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Các gen mã hóa cho CREB (cAMP response element binding protein), PRAME (preferentially expressed antigen in melanoma), FLT3 (Fetal Liver Tyrosine Kinase 3), p14ARF p16INK4a, MTHFR vài số nhiều gen phát có mức độ biểu mRNA bất thường liên quan tới bệnh bạch cầu Mặt khác, chúng xem đích đến loại thuốc dùng điều trị bệnh Mã hóa cho protein bám nhân tố đáp ứng cAMP, CREB điều khiển gen chịu trách nhiệm cho q trình tăng số lượng/trưởng, biệt hóa sống sót tế bào (Sakamoto KM, Frank DA, 2009) CREB 18 ThS Đỗ Thị Vinh An Bệnh viện Bạch Mai 19 CN Vũ Văn Trường nt 20 CN Nguyễn Quang Vinh nt Các quan, đơn vị phối hợp: - Bệnh viện Nội tiết Trung ương - Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội - Trường Phổ thông Trung học Dân tộc Nội trú tỉnh Quảng Ninh Mở đầu Hiện nay, nghiên cứu y sinh học đại, triển khai kỹ thuật proteomics tìm kiếm biomarker có khả ứng dụng việc phát hiện, chẩn đoán điều trị bệnh nan y mối quan tâm nhà khoa học giới Việt Nam Trang bị nghiên cứu biomarker thiết bị phân tách, làm nhận dạng, xác định protein/proteome (hệ máy khối phổ phân giải cao cộng với khả sử dụng chương trình điện tốn proteomics) thiết lập số sở nghiên cứu Hơn nữa, có lợi điểm không số lượng mẫu phẩm dồi loại bệnh, mà dồi kiện lâm sàng việc đánh giá khả ứng dụng biomarker chẩn đoán trị liệu Đây yếu tố cần thiết cho thống kê để thu đựơc biomarker có độ xác cao qua việc xác định loại trừ protein nhóm ứng viên biomarker (biomarker candidates) Điểm đặc biệt giá trị đặc thù biomarker có liên quan đến “dấu ấn” sinh học chủng tộc Các dấu ấn chủ đề quan trọng cho nghiên cứu y học từ nguyên nhân bệnh lý tác động môi trường, dược học việc tìm kiếm hay thẩm định tính trị liệu dược phẩm Việt Nam Với kỹ thuật kết bước đầu thu nhận thời gian vừa qua cán Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam nghiên cứu hệ protein huyết người Việt Nam kĩ thuật proteomics coi tiền đề cho nghiên cứu mối quan hệ marker protein liên kết với số bệnh lý chẩn đoán lâm sàng Đó mục đích nghiên cứu hệ protein người nói chung hệ protein huyết người nói riêng, tìm hiểu tranh tổng thể protein biểu hiện, có thêm hiểu biết biến đổi hệ protein trạng thái bệnh lý khả khai thác, sử dụng thay đổi cơng cụ chẩn đốn điều trị bệnh cho người Trên sở trang thiết bị đồng đại proteomics đầu tư theo Dự án “Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Gen” Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam kết nghiên cứu bước đầu xác lập phương pháp/kỹ thuật phân tích protein/proteome, tìm kiếm thị protein huyết người thời gian qua, đề tài “Xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type leukemia” giai đoạn 2008-2010 phê duyệt với mục đích nghiên cứu có hệ thống hệ protein huyết người Việt Nam trạng thái bình thường trạng thái bệnh ĐTĐT2, leukemia, tìm protein có biến đổi đặc trưng cho trạng thái bệnh phát triển thành thị chẩn đoán bệnh Mục tiêu đề tài: (i) Phân tích, xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thường số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2, leukemia, ) kỹ thuật proteomics bioinformatics; (ii) Nhận dạng xác định ứng viên thị protein có biến đổi cấu trúc chức liên quan đến phát sinh phát triển bệnh đái tháo đường type leukemia Việt Nam; (iii) Nghiên cứu khả ứng dụng thị protein phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type leukemia Nội dung đề tài: (ι) Phân tích, xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thường số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type leukemia…) kỹ thuật proteomics bioinformatics; (ιι) Phân tích, nhận dạng xác định ứng viên thị protein (protein marker candidates) bệnh đái tháo đường type leukemia; (ιιι) Thử nghiệm xác định ứng viên thị protein chẩn đoán 10 Các phương pháp nghiên cứu chính: Thu thập, lựa chọn mẫu máu người bình thường máu người bệnh từ người tình nguyện Bệnh Viện Nội tiết Trung ương, Bệnh viện K, Bệnh viện Bạch Mai (Bộ Y tế), Học viện Quân Y (Bộ Quốc phòng) Các mẫu lựa chọn theo tiêu chuẩn chặt chẽ lâm sàng có hồ sơ bệnh án rõ ràng Tất mẫu huyết chuẩn bị theo phương pháp Xử lý mẫu huyết người: Dịch huyết loại albumin (HSA) Immuglobulin (IgG) Aurum Serum Protein mini Kit(Bio-Rad, USA) Phân tách glycoproteins sử dụng cột lực đa lectin: Mẫu huyết pha loãng dung dịch đệm cân cột đưa vào cột lực đa lectin ConA Xác định protein: Hàm lượng protein mẫu xác định theo phương pháp Bradford với thuốc nhuộm protein hãng Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) Điện di hai chiều 2-DE: protein phân tách theo điểm đẳng điện trọng lượng phân tử tiến hành việc sử dụng strip IPG buồng điện di PROTEAN IEF SDS-PAGE hóa chất, thuốc nhuộm mua từ hãng Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) Amersham Bioscience (Amersham Bioscience Ltd, USA) Thủy phân trypsin: (1) Các mẫu huyết xử lí loại albumin, globulin phân đoạn protein thu từ cột sắc kí làm khơ li tâm chân khơng, tiếp hịa vào 50 mM NH4HCO3 Các mẫu khử 10 mM Dithiothreitol (DTT), alkyl hóa mM Iodoacetamide (IAA), sau thủy phân trypsin (loại sử dụng cho đọc trình tự, Sigma-Aldrich) 12 37°C Phản ứng thủy phân dừng lại acid formic với nồng độ cuối 0.1%; (2) Các vệt protein cắt từ gel polyacrylamide sau nhuộm Coomassie bạc rửa, làm khơ hịa lại đệm để thủy phân trypsin Sau thủy phân, peptide chiết khỏi gel phân tích hệ thống khối phổ Sắc kí lỏng nano đa chiều (MDNanoLC): Dung dịch sau thủy phân hồ vào 0.1% acid formic phân tích hệ NanoLC để phân tách theo chiều thứ cột sắc kí (LC Parking, Dionex) chất trao đổi cation mạnh (SCX) Sắc kí chiều thứ hai thực cột ngược pha C18 (GraceVydac, Hesperia, CA) với pha động chứa 0.1% acid formic nước (A) 0.1% acid formic 85% acetonitrile (B) Các peptide thơi với gradient tuyến tính từ 5% đến 100% dung dịch B với tốc độ dòng 0.2 µl/phút Phân tích khối phổ: Máy khối phổ QSTAR XL vận hành chế độ IDA (Information Dependent Acquisition) để thực việc chuyển từ quét phổ TOF MS đơn ion nằm dải khối (TOF mass) từ 400 đến 1200 sang khối phổ liên tiếp ion phân tử có mật độ cao lớn 15 xác định tự động nhờ phần mềm BioAnalyst QS v1.4 (AppliedBiosystems) Sai số khối (mass tolerance) đặt mức 100 ppm, thời gian không thực lại MS/MS mảnh 90 giây làm MS/MS ion nằm khoảng (±) đơn vị cửa sổ khối (amu window) ion Hiệu điện đặt để ion hóa mẫu dung dịch từ đầu Fused Silica PicoTip 2200V Tin sinh học (Phân tích liệu): Phổ khối CID thu từ nanoLC-MS/MS phân tích phần mềm Mascot v1.8 Đây phần mềm có khả phân tích liệu phổ MS/MS để nhận dạng protein dựa thuật toán Mowse (Boutilier et al, 2004) phát triển Matrix Science (London, UK) Ngân hàng liệu dùng để tìm kiếm Mascot NCBInr, ngân hàng liệu protein khơng đồng tồn diện với khoảng triệu trình tự khác cài đặt cập nhật hệ máy tính HP Proliant Server (s/n:2UA5100LXZ) Các thơng số tìm kiếm Mascot sau: enzyme thủy phân trypsin, sai số khối lượng peptide ± 0,5 Da, sai số khối mảnh ion phổ MS/MS ± 0,3 Da Sửa đổi cố định carbamidomethyl (C) Trạng thái điện tích ion phân tử chọn +2 (double charge) +3 (triple charge) Mức độ xác đặt mặc định 99,5% Với thơng số kết cho protein có tổng điểm số 31 Việc phân tích liệu phổ giới hạn ngân hàng liệu protein Homo sapiens toàn Ngân hàng Dữ liệu NCBInr 10 Xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người: sử dụng hệ quản trị ngân hàng liệu Microsoft Access phầm mềm chuyên dụng có liên quan 11 Các kết đề tài 11.1 Đã thu thập mẫu máu/huyết của: (i) Người bình thường (100 mẫu) người có tiền sử đời không mắc bệnh lây truyền, di truyền, bệnh ung thư đái tháo đường type 2; (ii) Người bệnh đái tháo đường type (ĐTĐT2) trạng thái bệnh sớm (chỉ số đường huyết xấp xỉ 7,0 có nguy mắc bệnh cao), nhẹ (chỉ số đường huyết tăng 7,0 chưa xuất biến chứng bệnh) nặng (chỉ số đường huyết cao 14 có biến chứng bệnh) (100 mẫu) Phần công việc phối hợp với Bệnh viện Nội tiết Trung ương (iii) Người bệnh leukemia dạng cấp mãn (100 mẫu) sở tiêu chí mẫu đặt theo yêu cầu đề tài Phần công việc phối hợp với Bệnh viện Bạch Mai 11.2 Đã tiến hành xử lí mẫu huyết thanh, phân tách, thu nhận hệ protein huyết tổng thể, hệ protein bền nhiệt hệ glycoprotein Các mẫu huyết xử lí phương pháp khác để thu nhận: (i) Hệ protein tổng thể (chỉ tiến hành loại protein có hàm lượng cao albumin, globulin ); (ii) Hệ protein bền nhiệt (phân đoạn nhiệt huyết thanh) (iii) Hệ glycoprotein (sử dụng cột sắc kí lực concanavalin A) 11.3 Đã phân tích, nhận dạng hệ protein huyết tổng thể, hệ protein bền nhiệt hệ glycoprotein Các hệ protein phân tách phương pháp điện di chiều (2-DE) kết hợp với hệ sắc kí lỏng nano đa chiều kết nối với hệ khối phổ liên tục (nanoLC-MS/MS) tổng số 90 mẫu huyết thanh: (i) người bình thường (30 mẫu); (ii) người bệnh ĐTĐ2 (ở trạng thái bệnh: sớm, nhẹ nặng): 30 mẫu (iii) mẫu bệnh nhân leukemia (dạng cấp mãn): 30 mẫu Các liệu protein nhận được phân tích xử lí phần mềm Mascot v1.8 11.4 Đã tiến hành xây dựng sở liệu hệ protein huyết người Việt Nam xếp sau protein: số thứ tự, số đăng kí protein, tên protein xếp theo thứ tự ABC, số đăng kí Uniprot protein (được link với trang web có đầy đủ thông số kết nghiên cứu protein này), chức protein, vị trí protein tế bào, biến đổi protein (nếu có) liên quan đến bệnh (nếu có) Từ sở liệu tìm thơng số, kết nghiên cứu liên quan đến protein Đề tài xây dựng Ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thường, người bệnh ĐTĐT2 người bệnh leukemia Mỗi ngân hàng lại gồm sở liệu tách riêng của: hệ protein tổng thể, hệ protein bền nhiệt hệ glycoprotein huyết Riêng sở liệu bệnh leukemia lại tách thành phần leukemia cấp leukemia mãn Như tổng số xây dựng 12 sở liệu khác Mỗi sở liệu chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn protein loại Danh sách cụ thể sau: 11.4.1 Ngân hàng liệu hệ protein huyết người bình thường: gồm sở liệu sau: (i) Cơ sở liệu hệ protein tổng thể mẫu huyết người Việt Nam bình thường (30 mẫu): 3696 protein (ii) Cơ sở liệu hệ protein bền nhiệt mẫu huyết người Việt Nam bình thường (30 mẫu): 1386 protein (iii) Cơ sở liệu hệ glycoprotein mẫu huyết người Việt Nam bình thường (30 mẫu): 385 protein 11.4.2 Ngân hàng liệu hệ protein huyết bệnh nhân ĐTĐT2: gồm sở liệu sau: (i) Cơ sở liệu hệ protein tổng thể mẫu huyết người bệnh ĐTĐT2 (30 mẫu): 4044 protein (ii) Cơ sở liệu hệ protein bền nhiệt mẫu huyết người bệnh ĐTĐT2 (30 mẫu): 1110 protein (iii) Cơ sở liệu hệ glycoprotein mẫu huyết người bệnh ĐTĐT2 (30 mẫu): 468 protein 11.4.3 Ngân hàng liệu hệ protein huyết bệnh nhân leukemia: gồm ngân hàng liệu sau: 11.4.3.1 Ngân hàng liệu hệ protein huyết bệnh nhân leukemia dạng cấp: gồm sở liệu sau: (i) Cơ sở liệu hệ protein tổng thể mẫu huyết người bệnh leukemia dạng cấp (22 mẫu): 3081 protein (ii) Cơ sở liệu hệ protein bền nhiệt mẫu huyết người bệnh leukemia dạng cấp (22 mẫu): 2912 protein (iii) Cơ sở liệu hệ glycoprotein mẫu huyết người bệnh leukemia dạng cấp (22 mẫu): 248 protein 11.4.3.2 Ngân hàng liệu hệ protein huyết bệnh nhân leukemia dạng mãn: gồm sở liệu sau: (i) Cơ sở liệu hệ protein tổng thể mẫu huyết người bệnh leukemia dạng mãn (8 mẫu): 1994 protein (ii) Cơ sở liệu hệ protein bền nhiệt mẫu huyết người bệnh leukemia dạng mãn (8 mẫu): 1506 protein (iii) Cơ sở liệu hệ glycoprotein mẫu huyết người bệnh leukemia dạng mãn (8 mẫu): 141 protein Ngân hàng Dữ liệu hệ protein huyết người Việt Nam hệ thống liên kết toàn liệu thu kể Khi phép cơng bố thiết lập trang web liệu Các nhà khoa học quan tâm sử dụng tra cứu Trên sở sở liệu thiết lập, đưa danh sách protein có liên quan đến phát sinh phát triển bệnh: (i) Đối với bệnh ĐTĐT2 danh sách protein có liên quan đến bệnh ĐTĐT2 số bệnh chuyển hoá (bệnh tim mạch, bệnh thận, bệnh mắt, bệnh thần kinh ); (ii) Đối với bệnh leukemia: danh sách protein có liên quan đến bệnh leukemia, ung thư, protein đột biến 11.5 Đã phân tích, nhận dạng xác định ứng viên thị protein (protein markers candidates) bệnh đái tháo đường type leukemia phương pháp điện di 2DE 11.5.1 Đối với bệnh ĐTĐT2: Bằng phương pháp điện di 2DE mẫu huyết bệnh nhân ĐTĐT2 so sánh với mẫu người bình thường, kết cho thấy protein có mức độ biểu thay đổi xác định, có protein có biểu tăng giai đoạn bệnh (sớm, nhẹ nặng) là: (1) Chuỗi haptoglobin alpha (HpA1); (2) Chuỗi haptoglobin alpha (HpA2); (3) Chuỗi haptoglobin beta (HpB); (4) Acid alpha glycoprotein (Acid A1G); (5) Fibrinogen (Chỉ mẫu glycoprotein); (6) Prolypoprotein (Proapo) (Chỉ mẫu glycoprotein); (7) Apolypoprotein CII CIII (ApoC II III) protein Tranthyretin (TTR) (Chỉ mẫu bền nhiệt) có biểu tăng giảm 11.5.2 Đối với bệnh leukemia: Bằng phương pháp điện di 2DE phân tích mức độ biểu protein huyết người bệnh leukemia so sánh với mẫu người bình thường Leukemia dạng cấp: có 11 protein bền nhiệt 12 glycoprotein có biểu thay đổi điện di 2DE mẫu bệnh biến đổi khơng có độ lặp lại cao mẫu nên chưa tìm protein có khả phát triển thành thị chẩn đoán Leukemia dạng mãn: có glycoprotein có mức độ biểu thay đổi đặc trưng 5/8 mẫu huyết bệnh nhân leukemia dạng mãn nghiên cứu, có protein có biểu tăng (Ceruloplasmin Alpha antitrypsin) protein có biểu giảm (Complement C3; Zinc-α2 –glycoprotein; Haptoglobin-β-chain; Haptoglobin α chain) Tuy nhiên để phát triển thành thị bệnh cần có nghiên cứu Bên cạnh đó, phương pháp sắc kí lỏng đa chiều kết nối khối phổ, chúng tơi tìm thấy nhiều protein đột biến, protein lai, protein liên quan đến ung thư huyết bệnh nhân leukemia (xem phần phụ lục, báo cáo tổng kết) đáng ý 11.6 Thử nghiệm ứng dụng ứng viên thị protein chẩn đoán: Đã tiến hành phát triển phương pháp Western-Blotting chẩn đoán sớm bệnh ĐTĐT2 với kháng thể kháng Haptoglobin huyết bệnh nhân ĐTĐT2 Phương pháp sử dụng phối hợp chẩn đoán bệnh ĐTĐT2 với Bệnh viện Nội tiết Trung ương 12 Các sản phẩm đề tài: 12.1 Sản phẩm Dạng I: Phương pháp thử nghiệm ứng dụng Haptoglobin phối hợp chẩn đoán bệnh ĐTĐ type phản ứng Western Blotting 12.2 Sản phẩm Dạng II: - Cơ sở liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thường số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2, leukemia): gồm Ngân hàng Dữ liệu với tổng số 12 sở liệu khác với hàng ngàn protein tìm kiếm, xếp, tìm hiểu tính chất, vị trí, chức mối liên quan đến bệnh tật 10 - Các ứng viên protein có liên quan đến phát sinh phát triển bệnh ĐTĐT2, leukemia (danh sách nêu phần 11.5) 12.3 Sản phẩm Dạng III: 13.3.1 Bài báo/báo cáo khoa học đăng tạp chí/Hội nghị Khoa học chuyên ngành quốc tế: 02 (1) Thanh Tran The, Phuong Nguyen Thi Minh, Nhi Nguyen Bich, Hoa Van Dinh, Chi Van Phan (2008) Glycosylated and Thermostable Proteins in Serum of Type Diabetes Mellitus Patients Human Genome Meeting, Hyderabad, India, September 27th-30th, 2008 (2) Chi VP, Phuong MTN, Nam TD, Nhi BN, Hai VN, Ha CD, Quang BL, Hai VN (2010) Analysis of serum thermostable proteome from dioxin-exposed veterants with type diabetes Proceeding of 30th International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants, September 12-17, 2010 San Antonio, Texas, USA 13.3.2 Bài báo/báo cáo khoa học đăng tạp chí/Hội nghị Khoa học chuyên ngành quốc gia: 15 (3) Phạm Đức Đan, Nguyễn Thị Minh Phương, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2010) Nghiên cứu xác định adipokine huyết bệnh nhân đái tháo đường type Tạp chí Y học Việt Nam 372: 130-137 (4) Nguyễn Thị Minh Phương, Phạm Đức Đan, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2010) Nghiên cứu hệ protein bền nhiệt huyết bệnh nhân đái tháo đường type Tạp chí Y học Việt Nam 372: 104-112 (5) Nguyễn Tiến Dũng, Vũ Khắc Ngọc, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2010) Sự thay đổi mức độ biểu hệ glycoprotein huyết bệnh nhân leukemia kinh dòng tủy Kỷ yếu Hội nghị Sinh học phân tử Hóa sinh Y học toàn quốc lần thứ 2, Hà Nội, ngày 18-19/9/2010, tr 132-137 (6) Nguyễn Thị Minh Phương, Lê Thị Bích Thảo, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2010) Nghiên cứu mức độ biểu haptoglobin huyết bệnh nhân đái tháo đường type Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (3A): 1-7 (7) Nguyễn Thị Minh Phương, Phạm Đức Đan, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2010) Cơ sở liệu hệ protein huyết bệnh nhân đái tháo đường type Tuyển tập báo cáo, Hội nghị Khoa học Kỷ niệm 35 năm thành lập Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Hà Nội, 10/2010 (đang in) (8) Trần Thế Thành, Vũ Minh Thiết, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2009) Nghiên cứu proteome huyết người Hội thảo VNProteomics lần thứ nhất, 1-2/4/2009, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tr.34-43 11 (9) Nguyễn Thị Minh Phương, Nguyễn Tiến Dũng, Phan Văn Chi, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi, Lê Thanh Vân, Nguyễn Vinh Quang (2009) Nhận dạng glycoprotein huyết bệnh nhân đái tháo đường type Hội thảo VNProteomics lần thứ nhất, 1-2/4/2009, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tr 44-64 (10) Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Thị Minh Phương, Vũ Khắc Ngọc, Trần Thế Thành, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi, Lê Thanh Vân, Nguyễn Vinh Quang (2009) Phân tích hệ protein huyết bệnh nhân đái tháo đường type Hội thảo VNProteomics lần thứ nhất, 1-2/4/2009, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tr 111-119 (11) Vũ Khắc Ngọc, Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi, Đỗ Thị Vinh An (2009) Phát protein bệnh đột biến huyết bệnh nhân leukemia cấp Hội thảo VNProteomics lần thứ nhất, 1-2/4/2009, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tr 129-140 (12) Phan Văn Chi (2009) Thực trạng nghiên cứu Proteomics Hội thảo VNProteomics lần thứ nhất, 1-2/4/2009, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tr 13-21 (13) Nguyễn Vinh Quang (2009) Tình hình bệnh đái tháo đường giới Việt Nam Hội thảo VNProteomics lần thứ nhất, 1-2/4/2009, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tr 96-109 (14) Đỗ Thị Vinh An, Vũ Văn Trường, Phạm Quang Vinh (2009) Kết hợp phương pháp hình thái, hóa tế bào, miễn dịch huyết học, tế bào di truyền chẩn đoán bệnh Lơ xê mi cấp người lớn khoa huyết học truyền máu Hội thảo VNProteomics lần thứ nhất, 1-2/4/2009, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, tr 119-127 (15) Do Quynh Hoa, Do T Vinh An, Nguyen Bich Nhi, Phan Van Chi (2008) A Survey of Thermostable sub-Proteome from Leukemia Patient’s Serum Tạp chí Công nghệ sinh học (4A): 591-598 (16) Nguyễn Thị Minh Phương, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2008) Sự biến đổi protein bền nhiệt glycosyl hóa bệnh nhân đái tháo đường type Tạp chí Y học Việt Nam 351(2): 91-102 11.4 Đào tạo: - Đề tài đào tạo thạc sĩ: bảo vệ năm 2008 (Trần Thế Thành, Nguyễn Thị Minh Phương) bảo vệ năm 2011 (Nguyễn Tiến Dũng, Vũ Khắc Ngọc) - Đề tài triển khai đào tạo 02 NCS (Đỗ Quỳnh Hoa: 2007-2010) Nguyễn Thị Minh Phương (2010-2014) NCS Đỗ Quỳnh Hoa nước ngồi 12/2008 11.5 Đăng kí Giải pháp hữu ích (GPHI): Đề tài đăng kí 02 GPHI với Cục Sở hữu trí tuệ: 12 (1) Phương pháp thu nhận hệ protein bền nhiệt huyết người Việt Nam với số đơn đăng kí 2-2010-00063 (2) Phương pháp thu nhận hệ glycoprotein huyết người với số đơn đăng kí 2-2010-00029; Cục Sở hữu Trí tuệ cấp Quyết định chấp nhận đơn hợp lệ số 55026/QĐ-SHTT ngày 12/10/2010 11.6 Tổ chức Hội thảo: Đề tài tổ chức thành công 01 Hội thảo Khoa học Đồ Sơn, Hải Phòng 1-2/4/2009 với 15 báo cáo khoa học có tham dự 100 nhà khoa học từ Viện nghiên cứu, Trường Đại học nước 11.7 Đoàn ra: Đề tài tài trợ cho 01 đoàn gồm cán tham dự Hội thảo khoa học chuyên ngành Proteomics làm việc sở Thụy Điển: (1) AlbaNova University Center, thuộc Trường Đại học Hoàng gia, (KTH), Stockholm; (2) Trung tâm Proteomics Lâm sàng (Clinical Proteomics Center) thuộc Trung tâm Karolinska Biomics, Viện Karolinska (3) Trường Đại học Tổng hợp Uppsala Các kết đề tài: (1) Lần Việt Nam sở liệu hệ protein huyết người bình thường, người bệnh ĐTĐT2 người bệnh leukemia (hệ protein tổng thể, hệ protein bền nhiệt, hệ glycoprotein) nghiên cứu, xác định xây dựng cách có hệ thống kỹ thuật proteomics bioinformatics với hàng ngàn protein xếp, tìm kiếm đầy đủ thông tin liên quan Đây Ngân hàng Dữ liệu protein huyết người Việt Nam đồ sộ, sử dụng giảng dạy, nghiên cứu đặc điểm sinh học người Việt Nam góc độ hệ protein trạng thái bình thường bệnh lí (2) Đã tiến hành nhận dạng, xác định protein huyết có biểu thay đổi trạng thái bệnh ĐTĐT2 leukemia so với người bình thường, tìm protein có khả liên quan đến bệnh phát triển thành thị xác định bệnh 13 (3) Đã xây dựng phương pháp phối hợp chẩn đoán sớm bệnh ĐTĐT2 với thị Haptoglobin huyết phương pháp Western Blotting Bảng tổng hợp sản phẩm đề tài: STT Tên sản phẩm Đăng kí Đạt Tự đánh giá Ghi Phương pháp thử nghiệm ứng dụng thị protein phối hợp chẩn đoán bệnh ĐTĐ type phản ứng Western Blotting 1-2 Đạt Chỉ thị Haptoglobin bệnh ĐTĐT2 Cơ sở liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thường số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2, leukemia): 12 Đạt/Vượt Các ứng viên thị protein có ý nghĩa bệnh ĐTĐT2, leukemia 2 Đạt Đã đưa danh sách số protein có khả liên quan đến phát sinh phát triển bệnh Bài báo/báo cáo khoa học đăng tạp chí/Hội nghị Khoa học chuyên ngành quốc tế: 1-2 Đạt 01 abstract 01 báo toàn văn đăng Kỷ yếu Hội nghị KH Quốc tế Người thường: bình ĐTĐT2: Leukemia cấp: Leukemia mãn: 14 Bài báo/báo cáo khoa học đăng tạp chí/Hội nghị Khoa học chuyên ngành quốc gia 2-3 14 Vượt Đào tạo Thạc sỹ Vượt 1-2 Đào tạo Tiến sỹ 2/1 Đạt bảo vệ (2008), bảo vệ (2011) NCS nước ngồi Đạt Đăng kí Cục SHTT GPHI có Quyết định chấp nhận đơn hợp lệ Hội thảo với tham gia 100 đại biểu toàn quốc, 15 báo cáo khoa học Giải pháp hữu ích 2 Hội thảo Khoa học 1 Đạt 10 Đoàn 1 Đạt KẾT LUẬN: Đề tài thu kết sau: Đã thu thập mẫu máu/huyết của: (i) Người bình thường (100 mẫu); (ii) Người bệnh đái tháo đường type (ĐTĐT2) thể sớm, nhẹ nặng (100 mẫu); (iii) Người bệnh leukemia dạng cấp mãn (100 mẫu) theo yêu cầu đặt đề tài Đã tiến hành xử lí mẫu huyết thanh, thu nhận phân tích: (i) Hệ protein tổng thể; (ii) Hệ protein bền nhiệt (iii) Hệ glycoprotein phương pháp điện di chiều (2-DE) kết hợp với hệ sắc kí lỏng nano đa chiều kết nối với hệ khối phổ liên tục (nanoLC-MS/MS) 90 mẫu huyết của: (i) người bình thường (30 mẫu); (ii) 15 người bệnh ĐTĐT2 (ở trạng thái bệnh: sớm, nhẹ nặng): 30 mẫu (iii) mẫu bệnh nhân leukemia (dạng cấp mãn): 30 mẫu Các liệu protein nhận được phân tích xử lí phần mềm Mascot v1.8 Đã tiến hành xây dựng Ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thường, người bệnh ĐTĐT2 người bệnh leukemia với tổng số 12 CSDL hệ protein huyết người Việt Nam khác dạng bảng liệu xếp sau protein: số thứ tự, số đăng kí protein, tên protein xếp theo thứ tự ABC, số đăng kí Uniprot protein (được link với trang web có đầy đủ thơng số kết nghiên cứu protein này), chức protein, vị trí protein tế bào, biến đổi protein (nếu có) liên quan đến bệnh (nếu có) Mỗi sở liệu chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn protein loại Đã phân tích, nhận dạng xác định ứng viên thị protein (protein markers candidates) bệnh đái tháo đường type leukemia phương pháp điện di 2DE 4.1 Đối với bệnh ĐTĐT2: có protein có mức độ biểu thay đổi xác định, có protein có biểu tăng giai đoạn bệnh (sớm, nhẹ nặng) là: (1) Chuỗi haptoglobin alpha (HpA1); (2) Chuỗi haptoglobin alpha (HpA2); (3) Chuỗi haptoglobin beta (HpB); (4) Acid alpha glycoprotein (Acid A1G); (5) Fibrinogen (Chỉ mẫu glycoprotein); (6) Prolypoprotein (Proapo) (Chỉ mẫu glycoprotein); (7) Apolypoprotein CII CIII (ApoC II III) protein Tranthyretin (TTR) (Chỉ mẫu bền nhiệt) có biểu tăng giảm 4.2 Đối với bệnh leukemia: Leukemia dạng cấp: có 11 protein bền nhiệt 12 glycoprotein có biểu thay đổi điện di 2D mẫu bệnh biến đổi khơng có độ lặp lại cao mẫu nên chưa tìm protein có khả phát triển thành thị chẩn đoán Tuy nhiên CSDL protein huyết bệnh nhân leukemia dạng cấp mãn tỉ lệ protein liên quan đến ung thư, protein đột biến tăng lên đáng kể so với mẫu người bình thường (từ 2-5 lần) Leukemia dạng mãn: có glycoprotein có mức độ biểu thay đổi đặc trưng 5/8 mẫu huyết bệnh nhân leukemia dạng mãn nghiên cứu, có protein có biểu tăng (Ceruloplasmin Alpha antitrypsin) protein có biểu giảm (Complement C3; Zinc-α2 –glycoprotein; Haptoglobin-β-chain; Haptoglobin α chain) 16 Đã tiến hành xây dựng phương pháp Western-Blotting phối hợp chẩn đoán bệnh ĐTĐT2 với kháng thể kháng Haptoglobin huyết bệnh nhân ĐTĐT2 Phương pháp sử dụng phối hợp chẩn đoán bệnh ĐTĐT2 với Bệnh viện Nội tiết Trung ương KẾT LUẬN CHUNG: Các cán thực đề tài hoàn thành tất nội dung, sản phẩm đăng kí thuyết minh, hợp đồng đề tài theo tiến độ Các sản phẩm đề tài đạt vượt tiêu đăng kí Các báo cáo định kì kì kiểm tra nghiêm túc Đề tài nghiệm thu cấp sở hoàn tất thủ tục nghiệm thu cấp Nhà nước theo tiến độ KIẾN NGHỊ: Trên sở phát số protein có biến đổi liên quan đến phát sinh phát triển bệnh đái tháo đường type trình thực đề tài, đề nghị Ban Chủ nhiệm Chương trình Khoa học Trọng điểm KC tạo điều kiện cho đề tài thực tiếp giai đoạn với trọng tâm: “Nghiên cứu xác định protein ứng viên liên quan đến bệnh đái tháo đường type 2” Hà Nội, ngày 15 tháng năm 2010 Xác nhận Viện Công nghệ Sinh học Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Phan Văn Chi 17 ... tích protein/ proteome, tìm kiếm thị protein huyết người thời gian qua, phê duyệt đề tài ? ?Xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type. .. hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam để phối hợp chẩn đoán bệnh đái tháo đường type leukemia” giai đoạn 20 08 -20 10 phê duyệt Mục đích đề tài nghiên cứu cách có hệ thống hệ protein huyết người. .. phát triển thành thị chẩn đoán bệnh Mục tiêu đề tài Phân tích, xây dựng ngân hàng liệu hệ protein huyết người Việt Nam bình thư? ??ng số trạng thái bệnh lý (đái tháo đường type 2, leukemia, ) kỹ thuật