Đang tải... (xem toàn văn)
Con tôm ôm cây lúa” hiện là mô hình nông nghiệp sinh thái được đánh giá cao về hiệu quả kinh tế lẫn tác đ ộng tích cực lên môi trường, khi luân canh giữa vụ tôm và vụ lúa thì các chất dinh dưỡng trong vụ tôm sẽ được lúa hấ p thụ và do đó giảm bớt nhiều chi phí hoá chấ t bón phân. Ngoài ra, nuôi tôm thịt trong đi ều kiện quảng canh như vậy sẽ hạn chế dịch bệnh, đảm bảo tôm phát triển bình thường và tận dụng tốt ngu ồn nước đang bị xâm mặn như hiện nay. Bên cạnh mô hình nông nghiệp sinh thái nuôi trồng quảng canh, thì mô hình nuôi tôm công nghiệp với mật độ cao ở nước ta vẫn là nguồn cung cấp chính cho xu ất khẩu. Thái Lan là nư ớc có lượng tôm xuất khẩu lớn nhất thế giới, sản lượng lên đến 250.000 tấn/năm, theo sau đó là các nước trong khu vực Đông Nam Á với hệ thống nuôi tôm công nghiệp quy mô lớn, dẫn đến 80% lượng tôm trên thế giới đư ợc sản xuất từ khu vực này. Để đáp ứng nhu cầu về con giống, các trang trại nhân giống tôm đã áp dụng hình thức nuôi với mật độ rất dày đặc cả tôm giống lẫn lượng thức ăn, vì nuôi trong những bể cô lập (trung bình thể tích 4 m 3 ) nên thức ăn thừa tồn đ ọng trong bể là rất lớn, khi đó lượng thức ăn này bị phân hu ỷ ra các hợp chất thứ cấp và cuối cùng về ammonia do các nhóm vi khuẩn amon hoá thực hiện, chính lượng ammonia này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lư ợng tôm giống về sau [13]. Để tôm phát tri ển tốt, cần kiểm soát lượng ammonia (NH3) phải nhỏ hơn 0,1 ppm (1,33-1,53 mg/L ở pH 8,0 và nhiệt độ 28-30 0 C), nếu lượng ammonia tăng cao sẽ làm tôm bắt mồi kém, sinh trưởng chậm và dễ nhiễm bệnh. Thông thường người ta sẽ thường xuyên luân chuyển đến 40% lượng nước trong bể để giảm nồng độ các chất thải độc hại, việc làm này đã gây tình trạng phú dưỡng cho các ngu ồn nước lân cận, dẫn đ ến tăng nguy cơ xuất hiện tảo đ ộc và vi sinh vật gây bệnh. Do vậy, việc quản lý ngu ồn nước trong các trang trại nuôi tôm (tôm giống và tôm thương phẩm) là một yêu cầu tiên quyết trong việc nâng cao sản lượng và hạn chế thiệt hại đ ến môi trường xung quanh [10, 13]. Hiện có nhiều giải pháp kĩ thuật để kiểm soát nồng độ ammonia (TAN – total ammonia nitrogen) trong nước, phương pháp phổ biến là cho nước nuôi tôm chạy qua một lớp vật liệu đệm, vi khuẩn nitrate hoá sẽ được giữ trên lớp vật liệu đệm này sẽ tiến hành oxy hoá ammonia trong nư ớc thải, có thể tiến hành sục khí để tăng hi ệu quả, các nghiên cứu liên quan
i MỤC LỤC CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Giới thiệu về Nitrosomonas sp. 3 2.1.1 Phân lập, duy trì và nuôi cấy 3 2.1.2 Đặc điểm về giống 4 2.1.3 Nitrosomonas europaea 7 2.1.4 Nitrosomonas eutropha 8 2.1.5 Nitrosomonas marina 9 2.1.6 Nitrosomonas mobilis 10 2.2 Giới thiệu về Nitrobacter sp. 11 2.2.1 Nitrobacter winogradsky 11 2.2.2 Nitrobacter alkalicus 12 2.2.3 Nitrobacter hamburgensis 14 2.2.4 Nitrobacter vulgaris 15 2.3 Quá trình nitrate hoá 15 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nitrate hoá 25 2.3.3 Khả năng bám dính 27 2.4 Thu sinh khối Nitrosomonas europaea theo mẻ (batch) và liên tục 28 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 29 2.4.2 Kết quả thí nghiệm 30 2.5 Giới thiệu về Acetobacter xylinum và màng bacterial cellulose 34 2.5.1 Sơ lược vi khuẩn Acetobacter xylinum 35 2.5.2 Các đặc điểm cấu trúc của BC 36 2.5.3 Vai trò của bacterial cellulose đối với Acetobacter xylinum 37 2.5.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo BC 38 2.5.5 Các ứng dụng của bacterial cellulose 39 2.6 Nghiên cứu về hệ vi khuẩn nitrate hoá và ứng dụng 40 CHƢƠNG 3. NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG 43 3.1 Qui trình thực hiện 43 3.2 Tạo chất mang BC 43 3.3 Lên men thu sinh khối hệ vi khuẩn nitrate hoá 46 3.4 Phương pháp xác định ammonia, nitrite và nitrate 47 3.4.1 Xác định hàm lượng ammonia NH 3 theo TCVN 2662-78 và 4563-88 48 3.4.2 Xác định hàm lượng nitrite NO 2 - theo TCVN 2658-78 và 4561-88 50 3.4.3 Xác định hàm lượng nitrite NO 3 - theo TCVN 4562-88 52 3.5 Kết quả bước đầu 53 3.5.1 Cố định vi khuẩn lên BC 53 3.5.2 Thử nghiệm chế phẩm 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các môi trường khác nhau dùng nuôi cấy vi khuẩn nitrite hoá. Môi trường 1, 2 và 3 đề xuất tương ứng bởi Soriano và Walker (1968), Watson (1971) và Krinmel và Harms (1982) đối với vi khuẩn phân lập từ đất, môi trường 4 đề xuất bởi Watson (1965) đối với vi khuẩn phân lập từ biển và môi trường 5 đề xuất bởi Koops và cộng sự (1976) đối với vi khuẩn phân lập từ nước lợ. Tất cả các môi trường đều cần 5 g/l CaCO 3 hoặc 4 g/l HEPES như chất đệm pH [7] 4 Bảng 2. Các đặc điểm phân loại giống vi khuẩn nitrite hoá [7] 5 Bảng 3. Năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá các hợp chất vô cơ so với từ glucose (-686 kcal/mol) [11] 16 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi quang học [7] 5 Hình 2. Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về hình dạng và kích thước tế bào giữa các loài trong cùng giống Nitrosomonas. IM là màng bao tế bào chất (intracytoplasmic membrane), C là carboxysome [7] 5 Hình 3. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosospira [7] 6 Hình 4. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosovibrio [7] 6 Hình 5. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosolobus [7] 7 Hình 6. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosococcus [7] 7 Hình 7. Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi quang học. Bar = 5 μm [4] 8 Hình 8. Quan sát tế bào Nitrosomonas europaea dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4] 8 Hình 9. Quan sát tế bào Nitrosomonas eutropha dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4] 9 Hình 10. Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử quét. Bar = 1 μm [4] 9 Hình 11. Quan sát tế bào Nitrosomonas marina dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4] 10 Hình 12. Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử quét. Bar = 1μm [4] 10 Hình 13. Cấu trúc tế bào Nitrosomonas mobilis dưới kính hiển vi điện tử. Bar = 1 μm [4] 11 Hình 14. Vi khuẩn Nitrobacter winogradsky được nhuộm Gram âm, có dạng quen ngắn. Bar = 1 μm [4] 12 Hình 15. Khuẩn lạc Nitrobacter alkalicus sau 2 tháng nuôi cấy ở pH 10. Bar = 0,1 cm [15] 12 Hình 16. Tiên mao (F) ở Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi. Bar = 1 μm [15] 13 Hình 17. Cấu trúc tế bào Nitrobacter alkalicus dưới kính hiển vi điện tử. Lớp vỏ bao bên ngoài (S) được cấu tạo gồm nhiều tiểu đơn vị protein ghép với nhau. Bar = 1 μm [15] 13 Hình 18. Cấu trúc lớp vỏ bên ngoài tế bào vi khuẩn Nitrobacter alkalicus. Bar = 0,5 μm [15] 13 Hình 19. Các bào quan ở Nitrobacter alkalicus (M) màng intracytoplasmic, (P) polyphosphate và (H) hạt polyhydroxybutyrate. Bar = 1 μm [15] 14 Hình 20. Vi khuẩn Nitrobacter hamburgensis được nhuộm Gram âm, có dạng quả lê. Bar = 250nm. [4] 14 Hình 21. Cấu trúc tế bào Nitrobacter vulgaris gồm lớp màng introcytoplasmic và carboxysome. Bar = 250 nm. [4] 15 Hình 22. Hướng di chuyển electron dựa trên thế khử của các chất trong tế bào. Những chất khử luôn là chất cho điện tử, và các chất oxi hoá luôn là chất nhận điện tử. [11] 17 Hình 23. Hai giai đoạn của quá trình nitrate hoá 18 Hình 24. Cấu trúc carboxysome và các enzyme cấu tạo lớp vỏ [18]. 20 Hình 25. Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrosomonas [2-3, 8-9, 11] 23 Hình 26. Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrobacter [3, 8-9, 11, 16] 24 Hình 27. Sự tạo thành nitrite trong quá trình sinh trưởng của N. europaea trên môi trường được cấy 4% dịch giống và hàm lượng ammonia ban đầu là 7,8 mM [12] 28 Hình 28. Thiết bị fermenter dùng nuôi cấy theo mẻ và liên tục để xác định các yếu tố sinh trưởng tối ưu cho Nitrosomonas [14] 30 Hình 29. Tác động của sắt đến sự phát triển của Nitrosomonas trong nuôi cấy theo mẻ. (A): đường cong sinh trưởng ở mẫu đối chứng, không có sắt. (B): đường cong sinh trưởng ở mẫu thí nghiệm có hàm lượng sắt là 0,5ppm [14] 32 Hình 30. Sự sinh trưởng của Nitrosomonas trong chế độ nuôi cấy liên tục. Đường cong phía trên là mật độ tế bào theo thời gian, đường cong phía dưới là hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4 [14] 33 Hình 31. Cấu trúc BC ở một số loài vi khuẩn 34 iv Hình 32. BC được tạo từ môi trường tĩnh (a) và môi trường lắc (b) 37 Hình 33. (a) hệ vi sợi ở BC và (b) ở thực vật, độ phóng đại x5000 [5] 40 Hình 34. Hình chụp dươi kính hiển vi điện tử những mẫu gỗ A. altissima đã được loại lignin. A và B: kích thước mẫu 300-500µm. C và D: kích thước mẫu 500-710µm [10] 41 Hình 35. Chế phẩm sau khi cố định, kích thước 300-1500µm. Thời gian cố định lần lượt là A: 6h, B: 12h, C: 24h và D: 72h [10] 42 Hình 36. Thiết bị cố định dạng khuấy đảo, dung tích 50L. Sau 4 ngày cố định, khả năng nitrate hoá của chế phẩm đạt cao nhất [10] 42 Hình 37. Đồ thị thể hiện hoạt lực nitrate hoá của chế phẩm theo thời gian. Tiến hành thí nghiệm lặp lại 3 lần [10] 42 Hình 38. Quan sát tế bào Acetobacter xylinum dưới kính hiển vi để kiểm tra các đặc điểm vi thể 44 Hình 39. Khuẩn lạc Acetobacter xylinum 44 Hình 40. Sau khi đảm bảo chắc chắn giống đang có là Acetobacter xylium thì từ ống giống gốc (A) ta cấy chuyền qua ống thạch nghiêng (B), nếu thao tác không đúng sẽ dẫn đến tạp nhiễm (C) 45 Hình 41. Cùng với việc cấy chuyền, ta sẽ tiến hành nhân giống cấp 1 trong ống nghiệm. (1+2) lớp màng BC tạo ra sau 5 ngày nhân giống, (3) các tế bào kết thành dải màu nâu nhạt 45 Hình 42. Tiến hành nhân giống cáp 2, sau khi cấy giống vào erlen chứa môi trường ở bình (A), để yên erlen ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày sẽ thấy xuất hiện lớp màng mỏng phía trên (B), nếu để đến 1 tuần thì lớp màng sẽ càng dày (C) 45 Hình 43. Tiến hành lên men thu BC bằng cách cấy vào khay nhựa chứa môi trường lên men (A), sau 7 ngày ta sẽ thu được sản phẩm (B). 46 Hình 44. Trong quá trình lên men, nếu nguyên liệu nước dừa già đã bị nhiễm bào tử nấm mốc thì khả năng mốc mọc lên khi lên men là rất cao. Ngoài ra, nguyên nhân tạp nhiễm còn do rửa dụng cụ không sạch và khay bị hở nắp nên bào tử nấm lọt vào 46 Hình 45. (A) Dịch giống Nitrobacter sp., (B) Dịch giống Nitrosomonas sp. 47 Hình 46. Hình thái tế bào Nitrobacter (bên trái) và Nitrosomonas (bên phải) dưới kính hiển vi. 47 Hình 47. Đường chuẩn NH 3 49 Hình 48. Đường chuẩn NO 2 - 51 Hình 49. Đường chuẩn NO 3 - 53 Hình 50. BC sau khi xử lý và hấp tiệt trùng, ở pH trung tính được sử dụng làm chất mang 54 Hình 51. Chế phẩm BC thu được sau 24, 48, 72 giờ cố định 54 Hình 52. Chế phẩm BC ở các chế độ bẫy-hấp phụ khác nhau được đem thử nghiệm trên nước biển 54 CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU Trước tình hình biến đổi khí hậu diễn ra ngày một gay gắt như hiện nay, việc hướng đến những quy trình chăn nuôi, trồng trọt theo hướng sinh thái, thân thiện với môi trường là một đòi hỏi nóng bỏng của xã hội, đặc biệt là ở Việt Nam, khi mà nông nghiệp vừa là truyền thống lâu đời vừa là đòn bẩy kinh tế đưa cả nước thoát nghèo và thoát khủng hoảng như lịch sử đã minh chứng. Thời điểm tháng 4/2010, các tỉnh khu vực ven biển và đồng bằng sông Cửu Long đang gánh chịu sự hạn hán, nhiễm mặn nghiêm trọng gây nguy hại đến an ninh lương thực của cả nước và trên thế giới. Bài toán cho một nền nông nghiệp bền vững hiện đang đặt ra cho các nhà khoa học, nhà quản lý ở Việt Nam phải giải quyết nhanh, mạnh và kịp thời, nếu không những hệ luỵ tiếp theo từ sự suy giảm nông nghiệp sẽ rất khó lường. “Con tôm ôm cây lúa” hiện là mô hình nông nghiệp sinh thái được đánh giá cao về hiệu quả kinh tế lẫn tác động tích cực lên môi trường, khi luân canh giữa vụ tôm và vụ lúa thì các chất dinh dưỡng trong vụ tôm sẽ được lúa hấp thụ và do đó giảm bớt nhiều chi phí hoá chất bón phân. Ngoài ra, nuôi tôm thịt trong điều kiện quảng canh như vậy sẽ hạn chế dịch bệnh, đảm bảo tôm phát triển bình thường và tận dụng tốt nguồn nước đang bị xâm mặn như hiện nay. Bên cạnh mô hình nông nghiệp sinh thái nuôi trồng quảng canh, thì mô hình nuôi tôm công nghiệp với mật độ cao ở nước ta vẫn là nguồn cung cấp chính cho xuất khẩu. Thái Lan là nước có lượng tôm xuất khẩu lớn nhất thế giới, sản lượng lên đến 250.000 tấn/năm, theo sau đó là các nước trong khu vực Đông Nam Á với hệ thống nuôi tôm công nghiệp quy mô lớn, dẫn đến 80% lượng tôm trên thế giới được sản xuất từ khu vực này. Để đáp ứng nhu cầu về con giống, các trang trại nhân giống tôm đã áp dụng hình thức nuôi với mật độ rất dày đặc cả tôm giống lẫn lượng thức ăn, vì nuôi trong những bể cô lập (trung bình thể tích 4 m 3 ) nên thức ăn thừa tồn đọng trong bể là rất lớn, khi đó lượng thức ăn này bị phân huỷ ra các hợp chất thứ cấp và cuối cùng về ammonia do các nhóm vi khuẩn amon hoá thực hiện, chính lượng ammonia này sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng tôm giống về sau [13]. Để tôm phát triển tốt, cần kiểm soát lượng ammonia (NH 3 ) phải nhỏ hơn 0,1 ppm (1,33-1,53 mg/L ở pH 8,0 và nhiệt độ 28-30 0 C), nếu lượng ammonia tăng cao sẽ làm tôm bắt mồi kém, sinh trưởng chậm và dễ nhiễm bệnh. Thông thường người ta sẽ thường xuyên luân chuyển đến 40% lượng nước trong bể để giảm nồng độ các chất thải độc hại, việc làm này đã gây tình trạng phú dưỡng cho các nguồn nước lân cận, dẫn đến tăng nguy cơ xuất hiện tảo độc và vi sinh vật gây bệnh. Do vậy, việc quản lý nguồn nước trong các trang trại nuôi tôm (tôm giống và tôm thương phẩm) là một yêu cầu tiên quyết trong việc nâng cao sản lượng và hạn chế thiệt hại đến môi trường xung quanh [10, 13]. Hiện có nhiều giải pháp kĩ thuật để kiểm soát nồng độ ammonia (TAN – total ammonia nitrogen) trong nước, phương pháp phổ biến là cho nước nuôi tôm chạy qua một lớp vật liệu đệm, vi khuẩn nitrate hoá sẽ được giữ trên lớp vật liệu đệm này sẽ tiến hành oxy hoá ammonia trong nước thải, có thể tiến hành sục khí để tăng hiệu quả, các nghiên cứu liên quan CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 2 đã được áp dụng như phương pháp dòng chảy chìm (submerged flow biofilter) (Abeysinghe et al. 1996), nitrate hoá hiệu suất cao qua lớp đệm (high-rate linear-path trickling nitrification filter) (Twarowska et al. 1997) [17], bench-scale fluidized bed bioreactor (Ng et al. 1996), hệ thống xử lý liên tục với vật liệu đệm là gel alginate cố định vi khuẩn nitrate hoá (Kim et al. 2000)… các nghiêu cứu này đã tiến hành ở qui mô pilot và đạt được những thành công nhất định. Cụ thể, hệ thống xử lý nước thải dùng phương pháp này đã làm giảm đến 25% lượng ammonia theo nghiên cứu tiến hành bởi Chin và Ong (1997) ở trang trại nuôi tôm thương phẩm. Tuy vậy, nhược điểm lớn của các phương pháp trên chính là chi phí đầu tư ban đầu lớn, tốn kém trong quá trình bảo trì-vận hành, hơn nữa, công nghệ sử dụng khá phức tạp nên khó ứng dụng đối với những hộ nuôi tôm có quy vừa và nhỏ vốn là thành phần chủ lực trong sản xuất tôm giống ở những nước Đông Nam Á. 1. Phương pháp dòng chảy qua lớp đệm [17] 2. Phương pháp dòng chảy chìm [17] Giải pháp sử dụng trực tiếp chế phẩm vi sinh để xử lý ammonia hiện đang được ứng dụng nhằm khắc phục nhược điểm của phương pháp vật liệu đệm. 2 hệ vi khuẩn được sử dụng trong chế phẩm vi sinh thuộc nhóm hoá tự dưỡng, Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp., đây là những chủng có tốc độ sinh trưởng chậm, thường có sẵn trong nước nuôi tôm nhưng vì việc thay nước thường xuyên đã làm rửa trôi hệ vi khuẩn có lợi này, kết quả là hoạt lực nitrate hoá tự nhiên trong bể nuôi tôm bị giảm đáng kể. Các chế phẩm thương mại thì hiện trên thị trường rất nhiều nhưng hiệu quả thật sự thì vẫn chưa rõ ràng bởi các nhà sản xuất thường nói quá hiệu quả của chế phẩm. Các nguyên nhân dẫn đến sự kém hiệu quả khi sử dụng chế phẩm vi sinh tự do này (dạng lỏng, dạng bột) là chúng có khả năng thích nghi kém với môi trường nước nuôi tôm từng địa phương, khu vực, sự cạnh tranh cơ chất với chủng vi sinh vật nội tại trong bể nuôi tôm. Trở ngại lớn nhất là việc duy trì mật độ tế bào vi khuẩn nitrate hoá phải ở mức cao thì mới có khả năng phân giải ammonia một cách rõ ràng, điều này rất khó đảm bảo khi vi khuẩn nitrate hoá cũng bị rửa trôi trong quá trình thay nước. Chính vì thế, mục tiêu nghiên cứu của tôi là kết hợp giữa 2 phương pháp trên lại với nhau, làm thế nào tạo ra một chế phẩm có khả năng nitrate hoá vừa rẻ tiền, thích hợp cho các hộ nuôi trồng vừa và nhỏ, tiết kiệm chi phí đầu tư, bảo dưỡng trang thiết bị, vừa có hoạt lực nitrate hoá cao, hệ vi sinh vật ít bị rửa trôi và giảm tỉ lệ thay nước thường xuyên. Chất mang BC (bacterial cellulose) có thể là một giải pháp trọn vẹn cho các tiêu chí trên. CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về Nitrosomonas sp. Winogradsky là người đặt nền tảng nghiên cứu về các loại vi khuẩn oxi hoá ammonia (vi khuẩn nitrite hoá) vào năm 1892. Tuy vậy, việc phân lập và nghiên cứu sâu hơn về các loại vi khuẩn này đã không được tiếp nối nên trong một thời gian dài, người ta chỉ biết đến chủng Nitrosomonas europaea. Bắt đầu từ năm 1960, Watson và cộng sự đã mở ra một kỉ nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy loại vi khuẩn này, họ đã phát hiện và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxi hoá ammonia khác. Từ đó đến nay, kiến thức về loại vi khuẩn này liên tục được cập nhập, người ta đã dùng kỹ thuật PCR để xác định đoạn gen amoA (mã hoá cho trung tâm hoạt động của enzyme chìa khoá trong quá trình nitrite hoá là ammonia monooxygenase-AOB) và phương pháp phát hiện trực tiếp vi khuẩn này bằng kỹ thuật FISH (fluorescence in situ hybridization). Với các thành tựu này, việc kiểm soát các loại vi khuẩn oxi hoá ammonia trong thực tế trở nên dễ dàng hơn rất nhiều. 2.1.1 Phân lập, duy trì và nuôi cấy Để phân lập một loại vi khuẩn nào đó, ta nắm vững nguyên tắc “cơ chất nào thì sẽ có vi sinh vật loại đó phân huỷ”, vì vậy cần lấy mẫu ở những nơi mà vi khuẩn nitrite hoá tập trung cao. Tiếp theo, sử dụng phương pháp MPN ứng với một loạt các loại môi trường nuôi cấy khác nhau nhằm phản ánh tác động của yếu tố môi trường lên quá trình nghiên cứu. Chẳng hạn, trong quá trình tăng sinh khối từ môi trường acid, pH thấp và thêm vào urea như nguồn cơ chất sinh năng lượng duy nhất, người ta có thể phân lập được những chủng trội của vi khuẩn nitrite hoá, có thể thích nghi trong điều kiện khắt nghiệt. Về tổng quát, hai yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất là ammonia (NH 3 ) và nồng độ muối, tiếp đến là nhiệt độ và pH môi trường. Sau khi có được công thức môi trường thích hợp nhất cho vi khuẩn nitrite hoá phát triển, ta sẽ dùng một trong hai cách sau để phân lập vi khuẩn nitrite hoá là: phương pháp MPN (số lượng tế bào chắc chắn có thể) dựa trên phân phối Poisson khi phân tích một loạt mẫu pha loãng theo nhiều tỉ lệ khác nhau vào các ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho vi khuẩn nitrite hoá phát triển; phương pháp trãi đĩa petri từ mẫu ban đầu. Cần lưu ý là vi khuẩn nitrite hoá phát triển cực kì chậm, nên đối với phương pháp MPN thì có thể xác định mẫu có chứa tế bào vi khuẩn sau 2-3 tuần nuôi cấy (dựa trên sự thay đổi màu sắc cho chất chỉ thị pH gây ra), phương pháp trãi đĩa thì cần chờ đến 6-8 tuần mới thu được khuẩn lạc. Các môi trường chuẩn để nhân giống được liệt kê bên dưới, đối với môi trường giữ giống, thì CaCO 3 (5 g/l) hoặc N-2-hydroxyethyl-piperarine-N’-2’ethanesulfonic acid (HEPES, 4,77 g/l) được dùng như một chất đệm pH. Khi nuôi cấy, thì pH luôn được chỉnh bằng NaHCO 3 10%. Giá trị pH tối ưu phụ thuộc vào nồng độ các muối ammonium thêm vào. 10 mM muối ammonium thêm vào ở pH 8.0 được xem là tạo điều kiện rất tốt cho quá trình phát triển của vi khuẩn. Nếu nuôi cấy ở thể tích lớn thì cần phải khuấy hoặc sục oxy vào. Nhiệt độ 30 0 là thích hợp với quá trình phát triển của vi khuẩn. Thời gian cấy chuyền trong CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 khoảng 3-4 tháng, có thể trữ vi khuẩn nitrite hoá ở dạng dịch lỏng chứ không nhất thiết ở dạng thạch nghiêng. Việc lưu trữ bằng phương pháp lạnh sâu về cơ bản tỏ ra không thành công. Bảng 1. Các môi trường khác nhau dùng nuôi cấy vi khuẩn nitrite hoá. Môi trường 1, 2 và 3 đề xuất tương ứng bởi Soriano và Walker (1968), Watson (1971) và Krinmel và Harms (1982) đối với vi khuẩn phân lập từ đất, môi trường 4 đề xuất bởi Watson (1965) đối với vi khuẩn phân lập từ biển và môi trường 5 đề xuất bởi Koops và cộng sự (1976) đối với vi khuẩn phân lập từ nước lợ. Tất cả các môi trường đều cần 5 g/l CaCO 3 hoặc 4 g/l HEPES như chất đệm pH [7] Thành phần Môi trƣờng 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 1000 1000 1000 600 Nước biển (ml) 1000 400 NH 4 Cl (mg) 535 1320 500 (NH 4 ) 2 SO 4 (mg) 500 130 MgSO 4 .7H 2 O (mg) 40 200 49,3 200 CaCl 2 .2H 2 O (mg) 40 20 147 20 KH 2 PO 4 (mg) 200 54,4 50 K 2 HPO 4 (mg) 87 114 KCl (mg) 74,4 NaCl (mg) 584 Chelated iron FeNaEDTA (mg) 1 1 FeSO 4 .7H 2 O (μg) 973,1 Fe-EDTA (mg) 0,5 Na 2 MoO 4 .2H 2 O (μg) 100 1 (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 .4H 2 O (μg) 37,1 MnCl 2 .4H 2 O (μg) 200 2 MnSO 4 .4H 2 O (μg) 44,6 CoCl 2 .6H 2 O (μg) 2 2 CuSO 4 .5H 2 O (μg) 20 25 20 ZnSO 4 .7H 2 O (μg) 100 43,1 100 H 3 BO 3 (μg) 49,4 Phenol red 0,5% (ml) 0,1 1 1 Cresol red 0,5% (ml) 1 1 2.1.2 Đặc điểm về giống Việc phân loại vi khuẩn này về cơ bản dựa vào hình dáng của tế bào, sau đó là sự sắp xếp của màng bao tế bào chất (intracytoplasmic membrane). Với các tiêu chí này, người ta đã phân loại vi khuẩn nitrite hoá thành 5 giống chính là Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus và Nitrosovibrio. Trong đó, hiện có 16 loài vi khuẩn đã được phân biệt dựa trên tỉ lệ G+C trong DNA, hoạt động của carboxysome, hoạt tính urease, tốc độ chuyển hoá NH 3 , nồng độ tới hạn ammonia trong môi trường, yêu cầu về độ mặn và nồng độ muối tới hạn. CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 Bảng 2. Các đặc điểm phân loại giống vi khuẩn nitrite hoá [7] Đặc điểm Nitrosococcus Nitrosolobus Nitrosomonas Nitrosospira Nitrosovibrio Hình dạng Dạng tròn đến ellipse Dạng thuỳ đa hình Dạng que thẳng Cuộn xoắn ốc Dạng que mảnh, hơi cong Kích thước (μm) 1,5-1,8x1,7-2,5 1,0-1,5x1,0- 2,5 0,7-1,5x1,0- 2,4 0,3-0,8x1,0- 8,0 0,3-0,4x1,1-3,0 Kiểu tiên mao Mọc thành chùm Mọc rải rác Mọc ở cực Mọc rải rác Mọc ở cực Cấu trúc màng Có lỗ xuất hiện thành cụm Chia thành nhiều ngăn Có lỗ xuất hiện rải rác Gấp cuộn vào bên trong Gấp cuộn vào bên trong Giống Nitrosomonas (Winogradsky, 1982): tế bào về cơ bản là hình que, màng bao tế bào chất có các lỗ nằm rải rác, đôi khi lớp màng này gấp cuộn vào bên trong tế bào chất. Hình 3. Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi quang học [7] Hình 4. Hình thái tế bào Nitrosomonas dưới kính hiển vi điện tử cho thấy có sự khác nhau về hình dạng và kích thước tế bào giữa các loài trong cùng giống Nitrosomonas. IM là màng bao tế bào chất (intracytoplasmic membrane), C là carboxysome [7] Giống Nitrosospira (Winogradsky, 1933): tế bào là dạng que xoắn, đôi khi có dạng dấu phẩy. Không quan sát thấy màng bao tế bào chất. CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 Hình 5. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosospira [7] Giống Nitrosovibrio (Harms và cộng sự, 1976): tế bào dạng dấu phẩy. Không quan sát thấy màng bao tế bào chất. Màng trong tế bào gấp cuộn vào bên trong tế bào chất đã được ghi nhận. Hình 6. Cấu trúc tế bào thuộc giống Nitrosovibrio [7] Giống Nitrosolobus (Watson và cộng sự, 1971): tế bào có dạng thuỳ đa hình, chia thành ngăn bởi màng tế bào chất. [...]... Shilo (1988) cũng chứng minh khả năng tồn tại mạnh mẽ của vi khuẩn nitrate hoá trong điều kiện cố định ở các chế độ kị khí và thiếu nguồn dinh dưỡng Audic và cộng sự (1984) khám phá ra hoạt động hô hấp nitrate hoá của vi khuẩn cố định trong cột sẽ tăng đến 130% so với bình thường, và tốc độ nitrate hoá tăng rất mạnh trong giờ đầu tiên Bởi vì hoạt động nitrate hoá và khả năng sống sót sẽ rất thấp nếu vi... tạo thành ubiquinol, và đến lượt mình ubiquinol sẽ nhả điện tử và proton cho NAD + để chuyển NAD + thành NADH Con đường này là ngược so với chiều vận chuyển điện tử thông thường của cytochrome bc1 , để electron di chuyển được thì cần phải có tỉ lệ cyt c550 (dạng khử)/cyt c550 (dạng oxi hoá) và ubiquinol/ubiquinone đủ cao để đẩy H+ chuyển từ periplasm và cytoplasm thông qua phức cytochrome bc1 , nhờ đó... Quá trình nitrite hoá ở Nitrosomonas sp Hai enzyme chìa khoá ở đây là ammonia monooxygenase - AMO (oxi hoá NH3 thành NH2OH và H2O) và hydroxylamine oxidoreductase (oxi hoá NH 2OH thành NO2-) Trong tế bào vi khuẩn nitrite hoá, cơ chế chung như sau: đầu tiên, enzyme ammonia monooxygenase xúc tác chuyển NH3 ngoài môi trường thành NH2OH theo phản ứng: NH3 + O2 + 2e- + 2H+ NH2 OH + H2O + 0,7 kcal/mol (1)... oxi hoá luôn là chất nhận điện tử [11] Quá trình nitrate hoá là quá trình chuyển hoá ammonium (NH4 +) thành nitrate (NO 3-) bởi tác động của vi sinh vật trong điều kiện hiếu khí Quá trình này được thực hiện bởi hai nhóm vi khuẩn tuần tự nối tiếp nhau, gồm 2 bước: giai đoạn nitrite hoá (nitrition) chuyển NH4+ thành nitrite (NO2-) và giai đoạn nitrate hoá (nitration) từ nitrite thành nitrate (NO3-) Chuyển. .. 6,7-9,2 trong khi vi khuẩn Nitrobacter thì hoạt động trong khoảng pH 89,2 Sự thích nghi của VI KHUẨN đối với giá trị pH quá cao hoặc quá thấp đều đòi hỏi phải có một khoảng thời gian Trong nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng vi 26 CHƢƠNG 3: NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG khuẩn tự dưỡng có thể thích nghi được ở cả giá trị pH rất thấp như 3-4 hoặc giá trị pH rất cao 11-12 Trong các nguồn nước thải thường có pH nằm trong. .. trình nitrate hoá Trước khi đi sâu vào các quá trình xảy ra trên màng tế bào chất của vi khuẩn nitrate hoá, cần điểm lại kiến thức liên quan đến các hợp chất nitơ, các phức vận chuyển điện tử 2.3.1.1 -3) Ammonia NH3 ammonium NH4+ Nitrite - NO2 +5 Sự tồn tại của ammoni trong nước được phân thành 2 loại: NH3 (khí hoà tan) và NH4+ (dạng ion hoá) Sự phân chia này phụ thu c vào pH, nhiệt độ và độ mặn của... trình tổng hợp ATP ở vi khuẩn nitrate hoá về nguyên tắc rất giống với hoạt động tổng hợp ATP của ti thể ở các vi sinh vật có nhân thật Con đường chính để tạo ATP là thông qua các hoạt động oxi hoá ammonia và phân ly nước (ở vi khuẩn nitrite hoá) và oxi hoá nitrite (ở vi khuẩn nitrate hoá) , H + được tạo ra và đẩy vào periplasm (là khoảng không gian giữa màng trong và màng ngoài của tế bào vi khuẩn), từ... không cho sự di chuyển của H+ đi vào periplasm nếu electron có di chuyển từ NADH đến cytochrome c Điều này có nghĩa, việc di chuyển điện tử từ cytochrome c đến NADH oxidoreductase nhằm khử NAD + thành NADH tuy ngược với hướng vận chuyển thông thường thì ở vi khuẩn nitrate hoá điều này vẫn xảy ra nhờ các bơm proton đặt trong các phức vận chuyển điện tử gắn trên màng Ngoài ra, thế điện hoá H + ở hai bên... lệ P/O trong quá trình oxi hoá phosphoryl hoá ở vi khuẩn nitrate hoá thường bằng 1, chính vì tỉ lệ quá thấp như vậy, nên vi khuẩn nitrate hoá nói riêng và các loại vi khuẩn hoá năng vô cơ khác nói chung, cần oxi hoá một lượng lớn các hợp chất vô cơ để sinh trưởng và sinh sản, điều này nói lên tác động của hệ vi khuẩn này đối với môi trường rất sâu sắc Bảng 3 Năng lượng thu được từ quá trình oxi hoá các... gradient và quay trở vào cytoplasm thông qua phức ATPase Do đó, có thể kết luận chuỗi vận chuyển điện tử ở vi khuẩn nitrite hoá thực chất là chuyển e- từ quá trình oxi hoá ammonia qua các chất chuyển điện tử và tổng hợp nên ATP 22 Hình 29 Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrosomonas [2-3, 8-9, 11] 23 Hình 30 Con đường vận chuyển điện tử ở Nitrobacter [3, 8-9, 11, 16] 24 CHƢƠNG 3: NGHIÊN CỨU TÌNH HUỐNG . tảo độc và vi sinh vật gây bệnh. Do vậy, việc quản lý nguồn nước trong các trang trại nuôi tôm (tôm giống và tôm thương phẩm) là một yêu cầu tiên quyết trong việc nâng cao sản lượng và hạn chế. không sạch và khay bị hở nắp nên bào tử nấm lọt vào 46 Hình 45. (A) Dịch giống Nitrobacter sp., (B) Dịch giống Nitrosomonas sp. 47 Hình 46. Hình thái tế bào Nitrobacter (bên trái) và Nitrosomonas. Hình 36. Thiết bị cố định dạng khuấy đảo, dung tích 50L. Sau 4 ngày cố định, khả năng nitrate hoá của chế phẩm đạt cao nhất [10] 42 Hình 37. Đồ thị thể hiện hoạt lực nitrate hoá của chế phẩm