Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu gen Pres, gen X của virut viêm gan B trong mô, huyết thanh và một số dấu ấn huyết thanh ở bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan
Bộ giáo dục v đo tạo y tế trờng đại học Y h nội nguyễn thị vân anh Nghiên cøu gen PreS, gen X cđa virut viªm gan B m«, huyÕt vμ mét sè dÊu Ên huyÕt bệnh nhân ung th biểu mô tế bo gan Chuyên ngành: Miễn dịch học Mà số: 62.72.04.20 tóm tắt luận án tiến sỹ y học H Nội - Năm 2009 Công trình đợc hoàn thành tại: trờng đại häc y hµ néi Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: GS.TS Văn Đình Hoa PGS.TS Nguyễn Thị Vinh Hà Phản biện 1: GS.TSKH Đỗ Trung Phấn Viện Huyết học Truyền máu Trung Ương Ph¶n biƯn 2: GS TS Nguyễn Bá Đức Bệnh viện K Ph¶n biƯn 3: PGS.TS Phan Thị Thu Anh Trng i hc Y H Ni Luận án đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà n−íc Häp t¹i: Hội trường tầng tịa nhà A1- Trường Đại học Y Hà Nội Vµo håi 14 00 ngày 14 tháng 09 năm 2009 Có thể tìm hiểu luận án th viện: - Th viện Quốc gia - Th viện trờng Đại học Y Hà Nội - Th viện thông tin Y học Trung ơng Các công trình đ công bố có liên quan đến luận án Nguyễn Thị Vân Anh cs (2006), Bớc đầu nghiên cứu số đặc ®iĨm cđa HBV- DNA m« ung th− gan b»ng PCR”, Y học Việt Nam, (322), tr 25-30 NguyÔn Thị Vân Anh cs (2007), Hoàn chỉnh kỹ thuật tách ADN từ mô ung th gan phản ứng PCR xác định HBV, Y hc thc hnh s 3, tr 20-22 Nguyễn Thị Vân Anh cs (2007), “Nhận xét số dấu ấn virut viêm gan B huyết bệnh nhân ung thư gan”,Y hc Vit Nam,(332), tr 47-52 Nguyễn Thị Vân Anh cs (2008) Nghiên cứu tính đa hình thái vùng gen X HBV bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan kỹ thuật cloning, Tạp chÝ Y häc ViƯt Nam, (350), tr 14-21 Ngun Thị Vân Anh cs (2008), Trình tự gen HBV thuộc kiểu gen B C bệnh nhân Việt Nam, Tạp chí Y học Việt Nam, (351), tr.16-23 Đặt vấn đề Nhiễm virut viêm gan B (HBV) gặp hầu hết nớc giới mối quan tâm chung cộng đồng ảnh hởng sức khoẻ, kinh tÕ, x· héi c¸c biÕn chøng cđa nã gây nớc vùng Châu á, thời gian nhiƠm tiỊm tµng cã thĨ diƠn biÕn 20- 30 năm lây nhiễm HBV truyền từ mẹ sang hoạt động tình dục đờng lây chủ yếu Trong suốt trình mang virut kéo dài, biến chứng thành viêm gan mạn tính, xơ gan, ung th gan chiÕm tõ 15%- 40% sè ng−êi nhiƠm HBV m¹n tính Trên 70% trờng hợp ung th biểu mô tế bào gan (HCC) có liên quan tới nhiễm HBV ViƯt Nam, cã 8,4 triƯu ng−êi mang HBV m¹n tÝnh vào năm 2005, nhiên số trì giảm bớt khoảng triệu vào năm 2025 thực tốt chơng trình tiêm chủng Ung th gan sau trình nhiễm HBV biến chứng cuối thờng gặp Việt Nam, dự báo năm 2025 có khoảng 25.000 trờng hợp mắc HCC Cơ chế ung th gan HBV đà đợc nhiều tác giả giới chứng minh nghiên cứu từ thực nghiệm phòng thí nghiệm động vật Hai vùng gen quan trọng HBV đợc thấy có liên quan nhiều tới chế gây HCC vùng gen PreS vùng gen X cđa HBV Gen X lµ V.oncogen cđa HBV cã thể làm đột biến nhiễm sắc thể tế bào chủ sản phẩm protein đợc mà hoá từ vùng gen gây rối loạn phân bào, ức chế apoptosis, ức chế sửa chữa ADN Gen PreS2 mà hoá cho MHBs có liên quan tới chế tăng phân bào kích thích liên tục tín hiệu c-raf1/Erk2 Đột biến hai vùng gen này, thờng thấy đột biến đoạn làm tăng nguy HCC đà đợc chứng minh Mét sè nghiªn cøu giới cho thÊy HBV cã tÝnh biÕn ®ỉi cao, thËm chÝ cã sù khác mô huyết Nghiên cứu đặc ®iĨm cđa vïng gen X, gen PreS mơ huyết nhằm tìm hiểu thay đổi HBV bệnh nhân nhiƠm HBV m¹n tÝnh, bệnh nhân ung th− biểu mô tế bào gan Việt Nam cho tíi chưa tác giả đề cập đến Vì nghiên cứu đợc tiến hành nhằm mục tiêu: Nghiên cứu tỷ lệ ADN- HBV(+), trình tự nucleotid vùng gen PreS, X huyết mô ung th bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan Phát số đột biến vùng gen PreS, X bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan Xác định tỷ lệ phân bố kiĨu gen cđa HBV víi mét sè dÊu Ên hut bệnh nhân ung th biểu mô tế bào gan ý nghÜa khoa häc vμ thùc tiƠn cđa ln ¸n ý nghÜa thùc tiƠn: 1.1 øng dơng đợc số kỹ thuật sinh học phân tử: tách chiết ADN từ mô, huyết thanh, kỹ thuật Nested- PCR, cloning, giải trình tự gen để phục vụ cho nghiên cứu sinh học phân tử 1.2 Nghiên cứu đánh giá đợc đầy đủ đặc ®iĨm hai vïng gen X, gen preS cđa HBV, lµm sở liệu cho nghiên cứu HBV Việt Nam 1.3 Kết nghiên cứu cho thấy khả đột biến HBV cao, có khác cấu trúc gen mô huyết Vì vậy, điều trị thuốc kháng virut viêm gan B gặp nhiều khó khăn 1.4 Phát nhiều dạng đột biến vùng gen X bệnh nhân ung th gan, dạng đột biến đà đợc chứng minh có khả gây ung th gan thực nghiệm Đây chế làm tăng nguy ung th gan nhiễm HBV ë ViƯt Nam ý nghÜa khoa häc vµ đóng góp luận án 2.1 Phát đợc khác trình tự nucleotid gen PreS, gen X HBV mô huyết 2.2 Gen X HBV tồn dới nhiều hình thái đột biến khác nhau: đoạn, thêm đoạn, chuyển đoạn, tích hợp vào NST 14 Đột biến A1762T/ G1764A gặp nhiều nhóm HCC so với nhóm ngời lành mang virut Vì vậy, yếu tố quan trọng giúp tiên lợng bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính 2.3 Tỷ lệ phân bố kiểu gen B,C hai nhóm bệnh nhân ung th gan ngời lành mang virut tơng đơng 2.4 Kiểu gen C nhóm HCC chậm chuyển đảo huyết kiểu gen B 2.5 Với cặp mồi đợc sử dụng nghiên cứu, kỹ thuật Nested-PCR cho phép đánh giá mức độ phân ly gen X, gián tiếp đánh giá khả đột biến đoạn thêm đoạn Bố cục luận án Đặt vấn đề, Tổng quan Đối tợng phơng pháp nghiên cứu Kết Bàn luËn, kÕt luËn 32 trang 21 trang 37 trang 26 trang Chơng : Tổng quan ti liệu 1.1.Tình hình nhiễm HBV biến chứng thờng gặp: Nhiễm HBV gặp hầu hết quốc gia giới, tỷ lệ nhiễm tùy thuộc vào chủng tộc vùng địa lý Trên giới có khoảng triệu ngời bị phơi nhiễm với HBV, khoảng 400 triệu ngời mang HBV mạn tính 50 triệu trờng hợp đợc chẩn đoán năm Nhiễm HBV nguyên nhân gây nên biến chứng xơ gan ung th gan số nớc nằm vùng dịch tễ lu hành HBV cao, đặc biệt nớc vùng Châu Nguy hàng năm HCC 0,4%-0,6% bệnh nhân nhiễm HBV xơ gan, 2% bệnh nhân nhiƠm HBV cã x¬ gan ViƯt Nam n»m vïng dịch tễ lu hành HBV cao giới, tỷ lƯ nhiƠm HBV céng ®ång cao, chiÕm tõ 15-20% Trên 70% ngời mắc ung th gan có HBsAg(+) Biến chứng viêm gan cấp, viêm gan mạn, xơ gan, ung th gan gặp đối tợng nhiƠm HBV ë ViƯt Nam 1.2 CÊu tróc HBV vµ chức kháng nguyên: HBV thuộc nhóm Hepadnavirus cấu trúc lõi ADN, có tính đặc biệt với tế bào gan Các kháng nguyên: HBsAg, HBeAg, HBcAg, Polymerase, HBxAg đợc mà hoá từ khung đọc mở quan träng cÊu tróc gen cđa HBV lµ: PreS1/PreS2/S; PreC/C; Polymerase gen X Ngoài ra, có vùng gen tăng cờng đóng vai trò quan trọng chép virut: vùng EnhI, EnhII vùng gen khởi động promoter kích thích mà hoá tiền gen Đặc điểm khung đọc mở đoạn gen đợc gối chồng lên trình phiên mà Khung đọc mở mà hoá cho protein HBsAg n»m trän vïng gen polymerase, khung ®äc më vïng gen PreC/C nằm phần gen polymerase phần gen X, khung đọc mở vùng gen X nằm gối vùng polymerase PreC Nh vậy, số gen cấu trúc HBV có kích thớc dài so víi cÊu tróc bé gen cđa HBV T−¬ng øng víi kháng nguyên cấu trúc kháng thể: antiHBs, antiHBe, antiHBc, antiHBx hình thành đáp ứng miễn dịch thể nhiễm HBV HBsAg kháng nguyên vỏ virut, cấu trúc từ thành phần SHBs, MHBs, LHBs Do vậy, thành phần có liên quan tới xâm nhập virut vào tế bào gan HBcAg tạo nên vỏ capsid, giúp cho phần lõi virut xâm nhập vào nhân tế bào, tạo điều kiện cho virut tồn phát triển HBcAg protein có tính kháng nguyên mạnh, kháng thể anti HBc thờng xuất huyết với nồng độ cao kéo dài sau nhiều năm bị phơi nhiễm HBeAg có liên quan tới lẩn tránh đáp ứng miễn dịch virut Những trẻ có mẹ mang HBeAg nhiều khả trở thành ngời mang mạn tính 89% trờng hợp HBeAg dơng tính(+) có mức độ chép virut cao HBx: lµ mét protein cã kÝch th−íc nhá nhÊt, cÊu tróc gåm 154 acid amin, cã vai trß quan träng chÐp cđa virut, tÝch hỵp gen cđa virut vào gen tế bào chủ, gây rối loạn chức tế bào làm tăng nguy ung th gan nhiễm HBV Hiện nay, dựa khác vỊ tr×nh tù nucleotid cđa HBV, cã Ýt nhÊt kiểu gen đợc xác định giới, ký hiệu từ A-H, phân bố khác theo khu vực địa lý, khác kích thớc, vị trí khung đọc mở Các kiểu gen khác có ý nghĩa khác tiên lợng bệnh lâm sàng 1.3.Diễn biễn số dấu ấn huyết nhiƠm HBV: 1.3.1.DiƠn biÕn c¸c dÊu Ên viêm gan B cấp: Giai đoạn đầu huyết xuất đồng thời dấu ấn HBV: HBsAg(+), HBeAg(+) ADN-HBV Nếu bệnh nhân hồi phục kháng nguyên vòng tháng, sau kháng thể xuất Đặc biệt IgM HBc xuất sớm giảm sau giai đoạn viêm cấp việc chẩn đoán xác định nhiễm viêm gan B cấp thờng dựa có mặt kháng thể Kháng thể (IgG HBc IgG HBs) xuất muộn nhng tồn kéo dài sau nhiều năm kháng thể đợc sử dụng để xác định trình phơi nhiễm viêm gan B 1.3.2.Diễn biến dấu ấn huyết viêm gan B mạn tính Nhiễm HBV mạn tính, gỈp chđ u trun däc tõ mĐ sang thời kỳ bào thai giai đoạn nhiễm chu sinh Các triệu chứng lâm sàng hầu nh thay đổi, trẻ hoàn toàn bình thờng tuổi trởng thành nh không đợc xét nghiệm máu đà bị nhiễm HBV Nồng độ HBsAg, ADN-HBV thờng cao tồn nhiều năm, tỷ lệ trẻ HBsAg 15-40% sô ngời mang HBsAg mạn tính có biến chứng viêm gan mạn, xơ gan ,ung th gan 1.4.Cơ chế tổn thơng mô bệnh học gan nhiễm HBV Cơ thể nhiễm HBV loại thải virut hệ thống đáp ứng miễn dịch tự nhiên đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Hoạt động yếu tố miễn dịch, tế bào miễn dịch, cytokin kích thích trình viêm gan làm cho nguy huỷ hoại tế bào gan tăng lên Tuỳ thuộc mức độ hoạt động viêm mà ảnh hởng tới chức gan cấu trúc mô học gan Viêm mạn tính làm tăng nguy ung th gan 1.5.Cơ chế ung th gan liên quan tới nhiễm HBV - Các yếu tố thuận lợi làm phát triển HCC bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính: - Dịch tễ: nớc có tỷ lệ lu hành HBV cao tần xuất mắc HCC cao - Giới: Nam giới mắc HCC chiếm tỷ lệ cao nữ lần - Gia đình: Gia đình có ngời mắc HCC nguy HCC tăng 5,55 lần - Tuổi: Nguy HCC tăng dần theo tuổi, tuổi cao nguy mắc cao - Mức độ chép virut: Nguy HCC ng−êi cã nång ®é ADNHBV >105 copies/ml cao gÊp 10,2 lần so với ngời có nồng độ ADNHBV thấp - Vai trò dấu ấn huyết thanh: HBeAg dấu ấn tiên lợng, có tới 89% bệnh nhân HBeAg (+) dơng tính có nồng độ ADN- HBV tồn cao > 105copies/ ml - KiÓu gen: kiÓu gen B, C thờng gặp Châu á, có nguy HCC cao kiểu gen khác - Tổn thơng tế bào mạn tính, xơ gan làm tăng nguy HCC Ngoài yếu tố: nghiện rợu, aflatoxin, thuốc lá, đồng nhiễm loại virut viêm gan khác làm tăng nguy HCC - Bằng chứng phân tử gây ung th− gan HBV: Vai trß cđa gen X protein gen X (HBx) chế HCC Gen X gen đa chức năng, có vai trò quan träng chÐp virut, tÝch hỵp gen cđa virut vào gen tế bào chủ Có nhiều loại đột biến gặp vùng gen X bệnh nhân HCC nh cắt đoạn, đảo đoạn, chuyển đoạn, thêm đoạn Đột biến điểm vị trí A1762T/G1764A vùng gen X đợc thấy xuất trớc phát triển HCC Tích hợp gen HBV vào ADN tế bào chủ làm hoạt động gen tế bào chủ bị rối loạn, đặc biệt gen quan trọng cho tăng trởng biệt hoá tế bào gan, tăng cờng biểu lộ protein tham gia vào trình phân bào ức chế apoptosis Mặt khác, tích hợp gen làm tăng cờng biểu lộ gen đột biến gen HBV, đặc biệt thờng thấy vùng PreS, X HBV vùng gen khác bệnh nhân HCC Các protein thay đổi chức đợc sản xuất từ vùng gen bị đột biến làm tăng nguy HCC HBx protein điều hòa đa chức năng, tác động trực tiếp gián tiếp vào nhiều chức tế bào vật chủ nh: điều khiển tín hiệu chuyển dạng làm tăng sinh tế bào, kích thích khởi động mạng lới cytokin gây viêm cấp mạn tính, làm thay đổi chức bảo vệ tự nhiên tế bào, tham gia tác động vào hầu hết chế hình thành HCC: Đích HBx tác động Hoạt hoá phiên mà Điều hoà đờng tín hiệu Điều hoà apoptosis Điều hoà chu kỳ tế bào Điều hoà tạo mạch máu Điều hoà chức telomere ức chế sửa chữa lỗi ADN Cân liên kết tế bào Vai trò đột biến cắt đoạn gen Pre S2/S cđa HBV ung th− gan: Trªn thùc nghiƯm, vïng PreS2 kÕt hỵp víi vïng gen S mà hoá cho MHBs HBV, thay đổi hoạt hoá liên tục tín hiệu phân bào c-raf1/Erk2 dẫn đến tăng sinh tế bào gan Protein đợc sản xuất từ vùng PreS/S bị đột biến cắt đoạn vùng kÕt thóc COO cã thĨ kÝch thÝch béc lé gen tiỊn gen sinh u lµ c-fos tõ tíi 10 lần Đột biến cắt đoạn gen PreS đà đợc tìm thấy bệnh nhân HCC Việt Nam Ung th gan bệnh nhân HBsAg: Nhờ phát triển kỹ thuật sinh học phân tử năm gần đà phát đợc số trờng hợp viêm gan mạn, ung th gan nhng HBsAg hut ©m tÝnh NhiỊu ý kiÕn cho trờng hợp thuộc nhóm nhiễm HBV tiềm tàng Tỷ lệ bệnh nhân HCC thuộc nhóm nhiễm HBV tiềm tàng gặp lâm sàng Có nhiều giả thiết chế giải thích cho vắng mặt HBsAg huyết bệnh nhân là: sụt giảm chép HBV, đột biến gen HBsAg, tác động yếu tố ngoại môi Trong số bệnh nhân HCC mà HBsAg âm tính, ngời ta phát thấy có mặt HBx mô ung th gan nghĩa có vai trò HBV chế ung th gan bệnh nhân HBV tích hợp, trì gen nhiễm sắc thể tế bào chủ không sản xuất protein cấu trúc Chơng Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu 2.1 Đối tợng: 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Nhóm nghiên cứu: ung th biểu mô tế bào gan có nhiễm HBV - Các bệnh nhân đợc xét nghiệm có HBsAg(+) - Các bệnh nhân đợc chọc hút tế bào gan sinh thiết mô có kết chẩn đoán giải phẫu bệnh ung th biểu mô tế bào gan - Các bệnh nhân đợc lấy huyết mẫu mô theo cặp thời điểm Nhóm chứng: ngời lành mang virut viêm gan B - HBsAg(+) phát kiĨm tra søc kh - ALT, AST 0,05) Đánh giá tiêu nhóm HCC nhóm chứng: Các dấu ấn HBV: HBeAg, antiHBe, antiHBc, antiHBs; nhóm tuổi đợc lựa chọn tơng đơng nhóm bệnh nhóm chứng 3.2 Kết nghiên cứu gen PreS, gen X HBV mô huyết thanh: 3.2.1.Kết Nested-PCR, PCR vùng gen PreS, X mô HT: 3.2.1.1.Kết Nested PCR vùng gen PreS: Thang chuÈn(M) 800 700 600 500 400 300 200 100 400bp Hình 3.1: Sản phẩm PCR gen PreS điện di agarose 1,5% Nhận xét: Băng xuất vị trí ~ 400bp đợc đánh giá có ADN-HBV(+), băng không vị trí ADN-HBV(-) Bảng 3.5: Kết phát gen vùng PreS mô HT bệnh nhân HCC Kết phản øng ADN- HBV(+) ADN- HBV(-) Tæng sè HuyÕt Sè BN Tû lƯ 33 94,3% 5,7% 35 100% M« Sè BN 20 15 35 Tû lÖ 57,1% 42,9% 100% 11 Nhận xét: Có khác kết nested-PCR mô huyết Tỷ lệ dơng tính gen vïng PreS cđa HBV hut bƯnh nh©n HCC chiếm 94,3%, mô gan chiếm 57,1% 3.2.1.2 Kết qu¶ s¶n phÈm Nested-PCR vïng gen tõ 1286 -1948: M 11 18 19 20 21 22 50 52 53 5456 19M50M52M54M Thang chuÈn(M) 1000 800 700 600 500 400 300 200 100 Phân ly 663bp Hình 3.2: Sản phẩm Nested- PCR điện di agarose 1,5% Nhận xét: Có nhiều băng sản phẩm mẫu bệnh phẩm Sản phẩm có vị trí, kích thớc 663bp đợc xác định ADN-HBV(+) Các vị trí băng khác xuất kèm theo đợc đánh giá dơng tính có đoạn ADN phân ly Bảng 3.6: Kết Nested- PCR gen X mô HT bệnh nhân HCC: Kết phản ứng ADN-HBV (+) ADN-HBV(+)phân ly ADN- HBV(-) Tỉng sè Hut Sè BN Tû lƯ 22,9% 13 37,1% 14 40% 35 100% M« Sè BN 10 22 35 Tû lÖ 28,6% 8,6% 62,8% 100% NhËn xét: Có khác kết nested- PCR mô huyết Số bệnh nhân có ADN-HBV(-) mô gan cao huyết (62,8% 40%) Tỷ lệ phân ly huyết nhiều mô 3.2.2 Kết trình tự Nu gen PreS, gen X mô HT: Kết so sánh trình tự gen PreS mô HT bệnh nhân HCC: 12 Bảng 3.7: Nhận xét số vị trí Nu aa khác mô huyết bệnh nhân HCC Số vị trí thay đổi 69 80 86 87 97 64 88 91 Tr×nh tù Nu 12 2 11 Tr×nh tù aa 1 2 Ký hiƯu mÉu nghiªn cøu NhËn xÐt: Các mẫu bệnh nhân đợc xếp theo cặp huyết mô So sánh trình tự nu, trình tự acid amin vùng gen preS mô gan huyết nhãm HCC, cho thÊy tû lƯ kh¸c vỊ Nu hai kiểu gen 41/312 (13,2%), số vị trí Nu thay đổi mô huyết mẫu nhiều 12 vị trí vị trí thay đổi acid amin Phát đột biến gen X HBV mô HT kỹ thuật cloning: Kết sàng lọc PCR sau cloning mét sè mÉu cã ph©n ly xïng gen X: 663bp 600bp 428bp 663bp Hình 3.3 3.4: Sản phẩm điện di thạch clon mẫu số 18 HT mô 663bp 663bp 621bp 438bp Hình 3.5: Sản phẩm điện di clon mẫu số 80HCC huyết mô 13 663bp 663bp 508bp 438bp Hình 3.6: Sản phẩm ®iƯn di c¸c clon mÉu sè 64 HCC hut mô 685bp 800bp 663bp 663bp Hình 3.7: Hình ảnh điện di clon mẫu 22HCC mô huyết Nhận xét: Các kết gen X hình ảnh điện di sàng lọc PCR mồi X1 CR2 đợc tách dòng với dạng khác Ký hiệu sản phẩm kích thớc đợc xác định sau đà đợc giải trình tự Bảng 3.8: Một số đặc điểm clon khác phát vùng gen X cặp mẫu mô - huyết bệnh nhân HCC: Số mẫu 10HCC 12HCC 18HCC 22HCC 62HCC 64HCC 69HCC 80HCC KÝch th−íc gen M« HT 663, 663 663,592 663 663,355 663,428 685,768 663 663 663, 663,508 663,438 663 663 663,621 663,438 NhËn xÐt: KiĨu gen M« HT C C C C B, B B B B B C C B B B B Đặc điểm giải trình tự gen Mô HT X X X,X xoá đoạn X X, X/gen ngời/PreC X,Xxoá đoạn X chèn đoạn X X X X,X xoá đoạn X,Xxoá đoạn X X X,X xoá đoạn X,Xxoá đoạn 14 Trong cặp mẫu mô gan huyết bệnh nh©n HCC, sau thùc hiƯn kü tht cloning, ë mẫu mô huyết cho thấy có nhiều loại sản phẩm gen X xuất Vùng gen tơng ứng với kích thớc chủng chuẩn ngân hµng lµ 663bp cã ë 7/8 mÉu huyÕt vµ 8/8 mẫu mô Tuy nhiên, kèm với sản phẩm xuất thêm số sản phẩm bất thờng: - Xoá đoạn: kích thớc sản phẩm 621, 592, 508, 438, 353; Thêm đoạn: 685, 768; Tích hợp gen ngời; chuyển đoạn - 8/8 trờng hợp không thấy thay đổi kiểu gen mô huyết Kết giải trình tự số clon xuất đặc biệt bệnh nhân HCC: 220 1286 NST 14 ngời PreC/C 1506 1948 Xoá đoạn 1286 1948 41bp 151bp Chèn đoạn 21bp Mẫu số 80 Mẫu số 64 224bp Chèn đoạn 1286 Mẫu số18 1948 100bp Mẫu số 22 Chuyển đoạn 1286 1948 Tóm tắt sơ đồ giải trình tự gen (sơ đồ: 3.3; 3.4; 3.5; 3.6; 3.7; 3.8; 3.9) 3.3 Kết kiểu gen, số đột biÕn cđa HBV nhãm HCC vµ nhãm chøng: KiĨu gen phân bố kiểu gen nhóm HCC nhóm chứng: Bảng 3.9: Tỷ lệ kiểu gen HT nhóm HCC nhóm chứng: Kết Số BN Tỷ lệ Giá trị Nhận xét: Nhóm HCC (n=35) Nhóm chứng (n=32) B C KX§ B C KX§ 22 11 22 62,9% 31,4% 5,7% 68,8% 25,0% 6,2% p>0,05 15 Sè bƯnh nh©n genotype B nhãm HCC chiÕm 62,9%, nhãm chøng chiÕm 68,8% Sè bƯnh nh©n genotype C nhãm HCC chiÕm tû lÖ 31,4%, nhãm chøng chiếm tỷ lệ 25,0% Không thấy có khác biệt kiểu gen đợc phân bố nhóm (p > 0,05) Số mẫu không xác định (KXĐ) đợc kiểu gen sản phẩm PCR Kết so sánh đặc điểm Nu, acid amin vùng gen Surface promoter (3021-3180) ë nhãm HCC vµ nhãm chøng: Trong 21/22 mÉu HCC, 21/22 mÉu chøng thc kiĨu gen B vµ mÉu chøng, 11 mÉu bƯnh nh©n HCC thc kiĨu gen C đợc giải trình tự vùng gen từ vị trí 3021-3180 Kết cho thấy điểm Nu khác mẫu phân bố rải rác nhóm HCC nhóm chứng Không tìm thấy đột biến có liên quan nhóm HCC nhóm chứng đoạn gen đợc so sánh Kết đánh giá vùng tăng cờng EnhII (vị trí từ 1636- 1774) Bảng 3.10: KÕt qu¶ Nested- PCR gen X HT nhãm HCC nhóm chứng Kết phản ứng Nhóm HCC Số BN Tû lƯ ADN-HBV (+) 22,9% ADN-HBV(+) ph©n ly 13 37,1% ADN-HBV(-) 14 40% Tæng sè 35 100% Nhãm Chứng Số BN Tỷ lệ Giá trị 15 46,9% p < 0,05 21,9% 10 31,2% 32 100% NhËn xÐt: Tỷ lệ có ADN-HBV(+) không phân ly chiếm 22,9% nhóm HCC 46,9% nhóm chứng Sự khác biệt đặc điểm dơng tính nhóm có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Bảng 3.11: Đột biến A1762T/G1764A nhóm HCC nhóm chứng: Kết A1762T/G1764A Không đột biến Số mẫu Nhận xét: Nhóm HCC Số BN Tû lÖ 12 80,0% 20,0% 15 100% Nhãm chøng Sè BN Tû lÖ 41,7% 58,3% 12 100% Giá trị p < 0,05 16 Số bệnh nhân có đột biến vị trí 1762/1764 chiếm 80% nhãm HCC, chiÕm 41,7% nhãm chøng Sù kh¸c biƯt nhóm HCC nhóm chứng có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Bảng 3.12: Kết đột biến G1896A nhóm HCC nhóm chứng Kết G1896A Không đột biến Số mẫu Nhóm HCC Số BN Tỷ lÖ 40,0% 60% 15 100% Nhãm chøng Sè BN Tû lƯ 41,7% 58,3% 12 100% Gi¸ trị p > 0,05 Nhận xét: Tỷ lệ đột biến vïng Precore nhãm HCC lµ 40%, nhãm chøng lµ 41,7% Tỷ lệ không đột biến nhóm HCC 60%, nhóm chứng 58,3% Không thấy có khác biệt hai nhóm nghiên cứu (p > 0,05) Bảng 3.13: So sánh đột biến G1896A hai kiểu gen B C Kết G1896A Không đột biến Tổng sè KiÓu gen B 11(68,8%) (31,2%) 16 (100%) KiÓu gen C 11(100%) 11 (100%) Giá trị p 0,05 p > 0,05 17 NhËn xÐt: Trong nhãm HCC, có 2/2 bệnh nhân HBeAg(+) mang kiểu gen C Tû lƯ anti HBe(-) ë kiĨu gen C lµ 27,2% cao kiểu gen B 9,1%, khác biƯt cã ý nghÜa thèng kª víi p < 0,001 Bảng 3.15: Kết so sánh kiểu gen với AFP, ALT, AST ë nhãm HCC KÕt qu¶ KiĨu gen B Kiểu gen C Giá trị AFP (ng/ml) ALT (U/L) AST(U/L) 0,05 Gi¸ trị Nhận xét: Không thấy có khác biệt phân bè ti cđa kiĨu gen ë hai nhãm nghiªn cøu (p >0,05) 18 Ch−¬ng Bμn ln 4.1.Ti, giíi, mét sè dÊu Ên hut bƯnh nh©n HCC: Tuổi trung bình nhóm nghiên cứu 50,02 9,97, ti thÊp nhÊt lµ 33 vµ cao nhÊt lµ 75 Sè bƯnh nh©n HCC tËp trung nhiỊu nhÊt ë ®é ti tõ 41- 60 chiÕm ®a sè c¸c tr−êng hợp (25/35) Theo nghiên cứu Liu CJ, nguy ung th gan ngời nhiễm HBV tăng theo tuổi Trong nghiên cứu, số bệnh nhân HCC có tuổi 60 chiếm (5/35), lại đa số tuổi dới 60 (30/35), nh nhiều bệnh nhân HCC trẻ Một đờng lây truyền chủ u cđa HBV ë ViƯt Nam lµ tõ mĐ sang nên tình trạng nhiễm HBV nớc ta kéo dài nhiều năm, yếu tố thuận lợi cho trình viêm mạn tính, phát sinh đột biến, hình thành oncogen gây ung th Giới: tỷ lệ nam/nữ 10/1, yếu tố nguy có liên quan đến địa, nghề nghiệp, thói quen sinh hoạt khác biƯt vỊ néi tiÕt cđa nam giíi so víi n÷ giới Đặc điểm dấu ấn huyết nhóm HCC: Dấu ấn HBeAg đợc đánh giá có liên quan với nồng độ ADN virut máu Việt Nam giống nh nớc vùng Châu thờng tồn HBeAg kéo dài, sau tuổi dậy làm tăng nguy HCC Kết nghiên cứu bảng 3.1 cho thấy số bệnh nhân HCC có HBeAg(+) không nhiều, chiếm 2/35 bệnh nhân (5,7%) nh−ng sè bƯnh nh©n antiHBe(-) chiÕm 12/35 (34,3%) cho thấy bệnh nhân HBeAg bắt đầu giảm xuống thấp dới ngỡng phát đi, kháng thể máu cha tăng, tập trung nhiều bệnh nhân 40 ti chøng tá sù tån t¹i HBeAg(+) ë ng−êi ViƯt Nam diƠn biÕn kÐo dµi sau ti tr−ëng thµnh lµ thờng gặp Theo nghiên cứu Yang HI Trung Qc, tû lƯ ung th− gan trªn ng−êi mang mét dấu ấn HBsAg 324/100.00/năm mang hai dấu ấn HBsAg, HBeAg 1169/100.000/năm Nh vậy, nguy HCC ngời mang HBeAg tăng so với ngời mang HBsAg khoảng lần So sánh kết antiHBe với số tiên lợng: AFP, ALT, AST huyết bệnh nhân HCC Kết bảng 3.2 cho thấy khác biệt nhóm antiHBe(+) antiHBe(-) Nh vậy, dù bệnh nhân thể ổn định có antiHBe(+) hay cha ổn định antiHBe(-) tăng không tăng số Điều cho thấy 19 antiHBe(+) cha phải dấu hiệu tiên lợng tốt cho bệnh nhân Một số kết nghiên cứu gần đà cho thấy, bệnh nhân bắt đầu có tổn thơng gan vào giai đoạn sau chuyển đảo huyết , vai trò ức chế miễn dịch HBeAg không còn, nhng đáp ứng miễn dịch thể chủ lại tăng lên để loại bỏ virut dẫn đến tổn thơng tế bào gan Hiện nay, xác định mét sè dÊu Ên cđa HBV cịng nh− AFP, AST, ALT để tiên lợng bệnh nhân mang HBV mạn tính hạn chế Vì vậy, xác định biến đổi cđa virut viªm gan B cã liªn quan tíi ung th gan đợc nhiều nghiên cứu đề cập đến 4.2 So sánh trình tự gen PreS, gen X mô huyết thanh: 4.2.1 Phân tích đột biến vùng PreS: Dựa sở trình chép tái tạo lại hạt virut HBV, giả thiết đợc nghĩ tíi lµ cã thĨ xt hiƯn sai sãt cđa ADNpolymerase trình chép để tái tạo lại virut tế bào gan dẫn đến hình thành đột biÕn cđa HBV ngoµi hut Mét sè nghiên cứu so sánh trình tự gen HBV mô vùng mô khác nhau, mô huyết tác giả giới: Nghiên cứu Momosaki xác định ADN mô gan ung th vùng mô cận ung th vùng gen kh¸c cho thÊy tû lƯ ADN-HBV(+) cịng kh¸c vùng gen S, C Polymerase Nghiên cứu Cho SW , Policino cho thấy khả phát HBV khác vùng gen, trình tự Nu, đột biến khác vùng mô ung th không ung th Nghiên cứu Lee PI cho thấy có khác trình tự Nu vùng gen S trẻ mẹ Điều nµy chøng tá HBV lµ mét virut cã tÝnh biÕn đổi cao, khác trình tự gen mô huyết bệnh nhân Việt Nam xảy Giải trình tự gen theo cặp mô huyết mẫu bệnh nhân HCC vùng gen PreS để so sánh khác trình tự Nu mô huyết (Bảng 3.7) cho thấy có mẫu thay đổi trình tự Nu, mẫu có vị trí thay đổi số vị trí Nu thay đổi nhiều 12 vị trí Số vị trí aa thay đổi nhiều vị trí Mặc dù có thay đổi trình tự aa Nu nhng kết nghiên cứu không thấy có thay đổi phân loại kiểu gen mẫu mô so với huyết kết nghiên cứu tơng tự để đối chiếu, nhng đà cho thấy khả thay đổi trình tự gen HBV từ mô đến huyết xảy MHBs cấu trúc protein kích thớc trung bình hạt HBsAg, đợc mà hoá từ vùng PreS vùng S, MHBs thay đổi làm hoạt hoá liên tục tín hiệu phân bào c-raf-1/Erk2 dẫn đến tăng sinh tế bào gan, protein đợc sản xuất từ vùng PreS/S bị đột biến cắt đoạn vùng kết thúc COO kích thích béc lé tiỊn gen sinh u lµ c-fos tõ tới 10 lần 20 Kích thích sản xuất protein tõ vïng gen cÊu tróc th−êng phơ thc vµo đoạn gen khởi động (promoter) Nghiên cứu so sánh trình tự đoạn promoter vùng gen PreS2 bệnh nhân nhóm HCC nhóm chứng, kết so sánh đà không tìm thấy vị trí đột biến khác biệt hai nhóm nghiên cứu Nh vậy, đột biến kích thích sản xuất MHBs ngẫu nhiên, không bị ảnh hởng từ vùng gen khởi động, phụ thuộc vào yếu tố khác 4.2.2 Các đột biến gen X víi bƯnh ung th− gan ë ViƯt Nam: Do sản phẩm gen X phân ly nhiều (bảng 3.6) nên nghiên cứu sử dụng kỹ thuật tách dòng (cloning) sản phẩm Nested-PCR thu đợc từ vùng gen X, nhận dạng đặc điểm clon screening PCR với mồi X1 CR2, lựa chọn clon có kích thớc khác để giải trình tự mồi có trình tự vector để xác định trình tự Nu vùng gen X Các trình tự Nu bao gồm hai đầu mồi X1 CR2 Trong cặp mẫu mô huyết nghiên cứu, sau giải trình tự, so sánh trình tự mẫu với ngân hàng gen (Bảng 3.8, sơ đồ 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9) kết nghiên cứu cho thấy: vùng gen tơng ứng với kích thớc chủng chuẩn ngân hàng 663bp có 7/8 mẫu huyết 8/8 mẫu mô Tuy nhiên, kèm với sản phẩm xuất thêm số sản phẩm khác: xoá đoạn, thêm đoạn, tích hợp gen ngời NST 14, chuyển đoạn, nhng 8/8 trờng hợp không thấy có thay đổi kiểu gen mô huyết Trong nghiên cứu, đa số đột biến xoá đoạn đợc phát hiện, sản phẩm xoá có kích thớc khác đà đợc phát HBx sản phẩm mà hoá vùng gen X, protein điều hoà đa chức năng, tác động vào nhiều đích vật chủ với vai trò trực tiếp gián tiếp làm tăng nguy HCC: điều khiển tín hiệu chuyển dạng làm tăng sinh tế bào, kích thích khởi động mạng lới cytokin gây viêm cấp mạn tính, hoạt hoá oncogen ras, myc, làm chức p53 Đột biến xóa vùng gen X đầu tạo sản phẩm protein HBx bất thờng, bị thay đổi đặc tính sinh học làm tăng nguy HCC đà đợc thấy nhiều nghiên cứu thực nghiệm Theo nghiên cứu WangY cần đột biến khoảng 14aa đà làm biến đổi HBx Trong nghiên cứu này, số lợng nghiên cøu cßn ch−a nhiỊu nh−ng cịng cho thÊy vïng gen X HBV có nhiều dạng đột biến, gặp nhiều dạng bệnh nhân Đây chế quan trọng liên quan tới ung th gan HBV Các dạng đột biến vùng gen X nghiên cứu thấy có khác mô huyết Trong số mẫu nghiên cứu 64HCC, 80HCC, 18HCC cho thấy cắt đoạn mô huyết 21 Nh− vËy, chÐp cđa HBV cã sù biÕn ®ỉi từ mô huyết có tợng tái xếp gen đợc thấy nghiên cứu cđa Wang Y Ph©n tÝch gen PreS, gen X ë mô huyết theo cặp, khẳng định đợc tính ®ét biÕn cao cđa HBV, thËm chÝ kh¸c tõ mô tới huyết 4.3.Đánh giá số đột biến điểm vùng gen X thờng gặp có liên quan tới HCC lâm sàng: 4.3.1.Đột biến BCP (A1762T/G1764A): Đột biến corepromoter vị trí A1762T/ G1764A vị trí đợc nghiên cứu nhiều, cho thấy có liên quan tới tổn thơng gan HCC Dạng đột biến vị trí BCP (1762/1764) thấy khác c¸c kiĨu gen, kiĨu gen A, D, F th−êng rÊt thấy dạng đột biến này, kiểu gen B, C thờng gặp có liên quan tới HCC Nghiên cøu cđa Liu CJ cho thÊy cã thĨ gỈp > 80% loại đột biến bệnh nhân HCC hai kiểu gen B C nguy HCC bệnh nhân mang đột biến cao 12,8 lần ngời mang chủng hoang dại (không đột biến) Kết nghiên cứu bảng 3.11 cho thấy khác nhóm HCC nhóm chứng vị trí đột biến BCP có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 Đột biến BCP chiếm tỷ lệ 80% bệnh nhân HCC cao nhóm chứng (41,7%) Kết phù hợp với nghiên cứu BX Trờng, TTT Huy số nghiên cứu xác định đột biến kiểu gen B C giới theo LH Song, TX Chơng đột biến thấy bệnh nhân viêm gan mạn tính cấp tính Việt Nam Nh vậy, đột biến BCP kiểu gen B, C thờng gặp nhóm HCC làm tăng nguy HCC, hay đột biến có ý nghĩa quan trọng tiên lợng bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính 4.3.2 §ét biÕn tiỊn lâi: G1896A Tû lƯ ®ét biÕn ë nhóm HCC chiếm 40% nhóm chứng 41,7% (Bảng 3.12) Không thấy khác biệt hai nhóm với p > 0,05 Hầu hết kiểu gen C gặp dạng không đột biến, kiểu gen B thờng thấy đột biến nhiều kiểu gen C, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p