Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính của galactosidaza từ một số chủng nấm mốc aspergillus SP. và ứng dụng để sản xuất galactooligosaccarit
BỘ GI Á O DỤC V À Đ À O TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ************************** BÙI THỊ HẢI HÒA NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA β-GALACTOSIDAZA TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS SP. VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ SẢN XUẤT GALACTOOLIGOSACCARIT Chuyên ngành : Công nghệ sinh học thực phẩm Mã số: 62 54 02 05 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Hà Nội – 2009 Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Hóa sinh và sinh học phân tử, phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Phản biện 1: GS. TS. Nguyễn Đình Quyến Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm Phản biện 3: GS. TS. Nguyễn Thành Đạt Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp nhà n ước chấm luận án tiến sĩ họp tại trường Đại học Bách Khoa vào hồi… , ngày… tháng… năm 2009 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc Gia Việt Nam - Thư viện Đại học Bách Khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. ĐẶNG THỊ THU PGS.TS. NGUYỄN VĂN CÁCH NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 1) Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa (2007). Tuyển chọn và nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp β-galactosidaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. Tập 45, số 1, tr. 23 – 31. 2) Bùi Thị Hải Hòa, Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách (2008). Tách, tinh chế và xác định đặc tính của β-galactosidaza từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 3. Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV. Tr 298 – 300. 3) Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách, Lê Quang Hòa, Nguyễn Văn Cường, Bùi Thị Hải Hòa (2008). Tách dòng và xác định trình tự gen lacA mã hóa sinh tổng hợp β-galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus oryzae 3. Tạp chí Di truyền học và ứng dụng. Số 1-4, tr. 12 – 19. 4) Dang Thi,T.; Le Quang,H.; Nguyen Van,C.; Bui Hai,H. (2008). Cloning and expression of the gene coding for beta-galactosidase from Aspergillus oryzae BK03. EMBL Nucleotide Sequence Database, Accession Number FM955406. 5) Bùi Thị Hải Hòa, Đặng Thị Thu, Nguyễn Văn Cách (2009). Khảo sát các điều kiện thích hợp cho phản ứng transgalactozyl sử dụng β-galactosidaza từ Aspergillus oryzae 3 để sản xuất galactooligosaccarit (GOS) từ lactoza. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. Tập 47, số 2, tr. 101 – 107. 1 MỞ ĐẦU Đường chức năng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm chức năng, được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như chống sâu răng, chống bệnh tiểu đường, không gây béo phì, có khả năng kích thích hoạt động của hệ tiêu hóa Galactooligosaccarit (GOS) là sản phẩm của phản ứng transgalatozyl lactoza dưới sự xúc tác của β-galactosidaza và thuộc nhóm đường chức năng. GOS có tác dụng tốt cho sự phát triển của hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột như Bifidobacterium, Lactobacillus và ức chế các vi sinh vật gây bệnh. Vì vậy, nhu cầu về các loại đường chức năng có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người như GOS để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là rất lớn β-galactosidaza là một tác nhân sinh học có tác dụng polyme hoá lactoza tạo ra GOS. Trong tự nhiên β-galactosidaza được phân bố khá rộng rãi trong các vi sinh vật, thực vật (lá bina, cà chua ) và các cơ thể động vật. Đặc biệt β-galactosidaza được tìm thấy với hàm lượng và hoạt lực cao ở các loài vi khuẩn như Bacillus cicurlans, nấm men Kluyveromyces fragilis, K. lactis và các chủng nấm mốc A. oryzae, A. niger với ưu điểm β- galactosidaza từ nấm mốc là enzym chịu nhiệt, hoạt động tối ưu ở pH th ấp và hoạt tính chuyển galactozyl cao nên rất phù hợp để sản xuất GOS từ lactoza, chế biến sữa và các sản phẩm thực phẩm khác. Với những ưu điểm đó β-galactosidaza là một trong những mối quan tâm lớn của các nhà khoa học trên thế giới Tại Việt Nam, mặc dù đã có một số nghiên cứu về β-galactosidaza và ứng dụng vào công nghiệp chế biến sữa, nhưng cho tới nay vẫ n chưa có công bố nào về việc nghiên cứu thu nhận và sử dụng β-galactosidaza để sản xuất đường chức năng galactooligosaccarit. * Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu thu nhận, tinh chế và xác định đặc tính β-galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus sp. - Tách dòng gen mã hóa sinh tổng hợp β-galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus sp. - Đề xuất được qui trình sản xuất galactooligosaccarit bằng việc sử dụng β- galactosidaza. * Nội dung nghiên cứ u 1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc Aspergillus sp có hoạt tính β- galactosidaza cao. 2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và động học của quá trình lên men sinh tổng hợp β-galactosidaza từ Aspergillus sp. 2 3. Nghiên cứu các điều kiện thu nhận chế phẩm β-galactosidaza kỹ thuật và tinh khiết. 4. Xác định một số đặc tính của β-galactosidaza từ Aspergillus sp . 5. Tách dòng, xác định và phân tích trình tự gen mã hóa sinh tổng hợp β- galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus sp. 6. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sản xuất GOS. 7. Phân tích đánh giá các chỉ tiêu kỹ thuật của sản phẩm GOS. * Những đóng góp mới của luậ n án 1. Là công trình đầu tiên ở Việt Nam đã nghiên cứu một cách có hệ thống β-galactosidaza từ A. oryzae 3 làm nền tảng để khai thác các khả năng ứng dụng của enzym này. 2. Đã thành công trong việc tách dòng và giải trình tự gen lacA mã hóa cho β-galactosidaza của chủng A. oryzae 3, các phân tích về tương quan phát sinh chủng loại cho thấy gen lacA của chủng A. oryzae 3 thuộc nhóm gen mã hóa β-galactosidaza từ các chủng A. oryzae RIB 40 và A. candidus. 3. Đã đề xuất đượ c quy trình sản xuất Galactooligosaccarit (GOS) ở qui mô phòng thí nghiệm sử dụng chế phẩm enzym β-galactosidaza từ A. oryzae 3. Chế phẩm đạt chất lượng trên 50% GOS. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. β-GALACTOSIDAZA β-D-galactosit galactohydrolaza (E.C. 3.2.1.23) còn gọi là lactaza hay β- galactosidaza. β-galactosidaza thường được thu nhận từ nguồn tế bào động vật, thực vật hoặc vi sinh vật, nhưng nguồn thu chủ yếu và kinh tế vẫn là từ nguồn vi sinh vật như nấ m men, nấm mốc, vi khuẩn. β- galactosidaza thu được từ các nguồn khác nhau có đặc tính khác nhau. β-galactosidaza được xác định là enzym thuộc nhóm glycosidaza, xúc tác cho phản ứng thủy phân lactoza thành β-D-galactoza và α-D- glucoza và phản ứng galactozyl chuyển hóa các gốc β-D-galactosit của lactoza tạo ra galacto-oligosaccarit (GOS). Mặc dù có tác dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như di truyền học, y học nhưng hiện nay β-galactosidaza được ứng dụng chủ yếu vào lĩnh vực công nghiệp thực ph ẩm, đặc biệt là sản xuất đường chức năng GOS. 1.2. GALACTOOLIGOSACCARIT (GOS) Trong những năm gần đây, các nghiên cứu thu nhận và sử dụng các oligosaccarit còn gọi là prebiotic đang được triển khai mạnh mẽ ở một số nước công nghiệp phát triển như Hoa Kỳ, Nhật Bản, Đức, Áo Các oligosaccarit được ưa chuộng trong công nghiệp thực phẩm vì đem lại lợi ích cho sức khỏe của con người, đó là không gây các b ệnh răng miệng cho 3 người sử dụng do vi khuẩn răng miệng không phân giải được; có độ ngọt thấp, phần lớn không được tiêu hóa trong ruột non nên thích hợp để sử dụng làm chất tạo ngọt có hàm lượng calori thấp và rất phù hợp với những người mắc bệnh tiểu đường, tim mạch… Oligosaccarit được hình thành trong quá trình thủy phân lactoza nhờ phản ứng transgalactozyl, còn gọi là galactooligosaccarit (GOS). Hiện nay GOS đang là một trong các loại đường chức năng được ưa chuộng trên thế giới và được sử dụng làm phụ gia để chế biến các loại thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe. Đường GOS được nghiên cứu và sản xuất trên qui mô công nghiệp ở rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt tại các nước Nhật Bản, Trung Quốc Tại Việt Nam việc nghiên cứu về vấn đề này mới bắt đầu. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Chủng vi sinh vật - 29 chủng nấm mốc thuộc loài Aspergillus - Chủng vi khuẩn E.coli DH5α (Invitrogen) 2.1.2. Hóa chất Các hoá chất tinh khiết (oNPG, β-Mertacapton ethanol, EDTA, Tris- HCl, Acrylamide, Bromophenol blue, methanol, đường chuẩn glucoza, galactoza, lactoza, galactotetraoza), hóa chất thông dụng dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử (Tris-base, EDTA.Na 2 , agaroza, SDS, CTAB, NaCl ) có nguồn gốc từ Sigma (Mỹ), Merk (Đức), Pharmacia và một số hoá chất thông dụng khác của Trung Quốc. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp vi sinh - Tuyển chọn chủng nấm mốc trên đĩa thạch theo phương pháp thủy phân X-gal - Phương pháp lên men dịch thể - Xác định vi sinh vật tổng số theo TCVN 4882:2001; E. coli theo TCVN 6846:2001; Cl. pefrigens theo TCVN 4991:2001; S. aureus theo TCVN 4830:1989; Salmonella theo TCVN 4829:2001 2.2.2. Phương pháp hóa sinh - Xác định hoạt độ β-galactosidaza dự a trên sự thuỷ phân oNPG của β- galactosidaza để sinh ra oNP. Một đơn vị hoạt độ β-galactosidaza được xác định là lượng enzym xúc tác thuỷ phân 1 μmol oNPG trong 1 phút ở 55 o C. - Thu enzym β-galactosidaza bằng phương pháp kết tủa phân đoạn (NH 4 ) 2 SO 4 và kết tủa bằng axeton. 4 - Tinh chế enzym bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên hệ thống FPLC - Điện di protein trên gel polyacrylamit - Xác định thành phần GOS và aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng - Phân tích thành phần GOS bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp 2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử - Phương pháp thiết kế mồi - Tách chiết ARN tổng số - Phương pháp thực hiện phản ứng RT-PCR - Phương pháp ghép nối các đoạn ADN - Biến nạp ADN plasmit vào tế bào E. coli DH5α, phân tích trình tự gen sử dụng một số phần mềm tin sinh học… CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp β- galactosidaza Từ 29 chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus thu thập từ phòng thí nghiệm Hóa sinh, Viện CNSH-CNTP, ĐH Bách khoa Hà nội, được khảo sát khả năng sinh β-galactosidaza trên môi trường có X-gal, đã chọn được 03 chủng bắt màu chỉ thị X-gal mạnh nhất. Đó là các chủng có ký hiệu Aspergillus oryzae 1, Aspergillus oryzae 2, Aspergillus oryzae 3. Hình 3.1. Khả năng thủy phân chỉ thị X-gal của nấm mốc A. oryzae Chú thích: - 1: Mẫu đối chứng, 2: A. oryzae 1, 3: A. oryzae 3, 4: A. oryzae 2 4 3 2 1 5 3.2. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của các chủng nấm mốc Aspergillus oryzae bằng phương pháp xác định hoạt độ với cơ chất oNPG Ba chủng A. oryzae 1, 2 và 3 được nuôi cấy trên môi trường lactoza cơ bản với tốc độ lắc 200 vòng/phút, 30 o C, pH 7, 48 giờ. Sau đó thu và xác định thu enzym nội bào, ngoại bào. So sánh kết quả chúng tôi thấy chủng A. oryzae 3 có hoạt tính β-galactosidaza nội bào cao nhất , do vậy chủng A. oryzae 3 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 3.1.Hoạt độ β-galactosidaza của 3 chủng A. oryzae sau 48 giờ nuôi cấy Hoạt độ tổng của β-galactosidaza (MU) Chủng VSV Ngoại bào Nội bào A. oryzae 1 788,48 1272,43 A. oryzae 2 865,92 1481,84 A. oryzae 3 1869,12 5529,55 3.3. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp β-galactosidaza từ chủng A. oryzae 3 3.3.1. Khảo sát khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau Sau khi khảo sát nuôi lắc chủng A. oryzae 3 trên các môi trường khác nhau: MT1. MT2. MT3 và MT4 chúng tôi nhận thấy sau 72 giờ nuôi cấy, hoạt tính β-galactosidaza trên MT1, MT2 và MT3 thấp còn trên MT4 cho hoạt tính β-galactosidaza cao nhất (738,80 MU/g) nên môi trường MT4 được chọn làm môi trường nuôi cấy cho các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.2. Kết quả đo pH dịch nuôi cấy và hoạt độ β-galactosidaza của chủng A. oryzae 3 trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau pH dịch nuôi cấy và hoạt độ β-galactosidaza (MU/g) 24 36 48 60 72 T (giờ) Môi trường pH MU/g pH MU/g pH MU/g pH MU/g pH MU/g MT1 6,76 0 7,62 111,61 8,22 367,01 8,20 529,47 8,45 128,58 MT2 6,15 0 6,01 120,88 6,17 194,44 5,72 285,34 5,98 169,02 MT3 6,79 0 6,88 45,32 7,05 165,00 6,76 180,01 6,88 277,40 MT4 6,20 43,57 6,53 264,13 6,79 398,61 6,78 507,00 6,78 738,80 6 3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon Chủng A. oryzae 3 được nuôi cấy trên môi trường MT4 với nguồn cacbon khác nhau: lactoza, saccaroza, maltoza, glucoza, galactoza với tốc độ lắc 200 v/phút, 30 o C, pH 7 và chọn được nguồn cacbon phù hợp là lactoza . Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ lactoza đến khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3 Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g) T(giờ) (h) Nồng độ lactoza (g/l) 24 36 48 60 72 0-1 , 06 9 , 45 15 , 17 25 , 80 527 , 32 108 , 64 189 , 96 223 , 65 254 , 41 10 41 , 76 172 , 73 232 , 80 451 , 19 562 , 35 15 44 , 36 248 , 52 398 , 35 456 , 34 612 , 54 20 56 , 72 210 , 57 379 , 24 558 , 41 797 , 07 25 96 , 14 293 , 19 411 , 39 686 , 04 829 , 43 30 89 , 71 354 , 89 517 , 13 691 , 05 976 , 74 35 77 , 00 226 , 31 417 , 88 518 , 16 787 , 75 Kết quả khảo sát nồng độ lactoza cho thấy với nồng độ đường tăng hoạt tính β-galactosidaza của A. oryzae 3 cũng tăng. Tại nồng độ là 30g/l β-galactosidaza có hoạt tính cao nhất bằng 976,74 MU/g sau 72h nuôi cấy, tuy nhiên nồng độ đường tăng đến 35g/l hoạt tính enzym giảm (đạt 787,75 MU/g sau 72 giờ). Do vậy chúng tôi chọn nồng độ đường lactoza bằng 30g/l để tiếp tục nghiên cứu. 3.3.3. Khảo sát ảnh hưở ng của nguồn nitơ Chủng A. oryzae 3 được nuôi cấy trên môi trường MT4 có hàm lượng lactoza là 30g/l và thay đổi nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau và chọn được nguồn nitơ phù hợp là pepton và NH 4 NO 3 cho hoạt độ enzym cao nhất là 1017,6 MU/g ở 72 giờ. Sau khi khảo sát với các nồng độ pepton lần lượt là (0,5; 1; 2; 3; 4; 5) g/l và NH 4 NO 3 (0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5)g/l chúng tôi nhận thấy hoạt tính enzym cao nhất trên môi trường có nồng độ 1g pepton và 0.5g NH 4 NO 3 (1311.8 MU/g sau 72 giờ nuôi cấy). Vì vậy, nồng độ nitơ thích hợp để A. oryzae 3 lên men sinh tổng hợp β-galactosidaza được đề xuất áp dụng trong nội dung tiếp theo là pepton 1g/l, NH 4 NO 3 0.5 g/l. 7 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3 Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g) Thời gian lên men (giờ) Nồng độ nitơ (g/l) 24 36 48 60 72 0,5g Pepton + 0g NH 4 NO 3 67,02 136,73 332,01 451,74 674,61 1g Pepton + 0,5g NH 4 NO 3 182,02 481,26 627,96 994,83 1311,80 2g Pepton + 1g NH 4 NO 3 119,22 328,70 548,10 781,26 1008,71 3 g Pe p ton + 1,5 g NH 4 NO 3 103,33 304,66 490,68 692,08 969,25 4g Pepton + 2g NH 4 NO 3 90,62 176,24 390,42 683,93 828,38 5g Pepton + 2,5g NH 4 NO 3 73,90 129,12 262,58 462,74 597,00 3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH Chủng nấm mốc A. oryzae 3 được lên men trên môi trường có nguồn dinh dưỡng đã được chọn với các pH đầu: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0. Kết quả thí nghiệm trên đã cho thấy pH đầu của môi trường có ảnh hưởng đáng kể tới hoạt độ enzym. Với pH đầu bằng 7,0 và 7,5 thì hoạt độ enzym cao, đạt tối đa ở giờ thứ 72, cao nhất là 1237,40 MU/g với pH đầu là 7 và 1325,16 MU/g với pH đầu bằng 7,5. Từ kết quả này đã cho phép lựa chọn pH đầu là 7,5 làm pH thích hợp cho quá trình lên men sinh tổng hợp β- galactosidaza từ nấm mốc A. oryzae 3 trên môi trường MT4. Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp β-galactosidaza của A. oryzae 3 Hoạt độ β-galactosidaza (MU/g) Th ờ i gian lên men (giờ) pH 24 36 48 60 72 5 , 0 42,26 138,75 424,38 381,84 254,48 5 , 5 68,86 131,49 252,58 450,88 538,53 6 , 0 89,80 261,57 404,65 589,71 695,52 6 , 5 79, 99 253,72 415,40 643,13 781,41 7 , 0 206,71 438,36 786,33 958,38 1237,40 7 , 5 221,69 541,26 814,31 1011,45 1325,16 8 , 0 140,57 267,58 475,44 653,01 723,73 [...]... nghệ chế biến các sản phẩm từ sữa Để có thể lưu giữ dòng gen mã hóa β -galactosidaza từ A oryzae 3 và xác định một số tính chất của β -galactosidaza từ A oryzae 3 bằng phương pháp tin sinh học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen lacA mã hóa sinh tổng hợp β -galactosidaza từ nấm mốc A oryzae 3 15 3.7 Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa β -galactosidaza từ A oryzae 3 3.7.1.Tách... XM_001727409 của chủng Aspergillus oryzae RIB40 tới 99% Mối quan hệ giữa các trình tự axit amin của β -galactosidaza từ chủng A oryzae 3 và một số các β -galactosidaza từ các chủng Aspergillus spp khác trên hình 3.17 cho thấy axit amin của β -galactosidaza từ chủng A oryzae 3 có độ tương đồng cao đạt 99% so với axit amin của galactosidaza từ lacA A oryzae RIB 40 và lacB A candidus và khác xa so với axit amin của. .. mạnh chỉ còn 23,5%, như vậy có thể nhận thấy trong trung tâm hoạt động của β -galactosidaza có thể chứa nhóm -OH Qua các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi kết luận đã xác định được một số đặc tính quan trọng của β -galactosidaza từ A oryzae 3 như ảnh hưởng nhiệt độ, pH, pI, các chất ức chế và hoạt hóa… và đánh giá đó là những đặc tính rất cần thiết khi ứng dụng β -galactosidaza trong lĩnh vực công nghiệp... kỹ thu t Enzym thô Sắc ký trao đổi ion cột DEAE Sepharose Fast Flow Tủa bằng axeton 0°C, tỉ lệ 1:1 (v/v ), 2giờ Enzym tinh sạch Sơ đồ 1 Quy trình tách tinh sạch β -galactosidaza từ A oryzae 3 11 3.5 Xác định một số đặc tính của β -galactosidaza từ A oryzae 3 3.5.1 Xác định điểm đẳng điện (pI) của β -galactosidaza Điểm đẳng điện của một protein (pI) là điểm pH mà ở đó điện tích thực của nó bằng 0 Mỗi một. .. của chủng A orzyae 3 và thời điểm thu enzym thích hợp nhất là từ 72-96 giờ 3.4 Nghiên cứu tách tinh chế β -galactosidaza từ A oryzae 3 3.4.1 Khảo sát các tác nhân kết tủa β -galactosidaza từ A oryzae 3 Sau khi khảo sát thu chế phẩm β -galactosidaza kỹ thu t trên các hệ dung môi là axeton và (NH4)2SO4 và so sánh kết quả, chúng tôi nhận thấy khi kết tủa bằng dung môi axeton thu được β -galactosidaza kỹ thu t... quả xác định aflatoxin trong chế phẩm GOS Chú thích: - 1: Aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 - 2, 3, 4: Mẫu đường GOS - 5: Mẫu âm tính đối chứng 23 KẾT LUẬN 1 Tuyển chọn được 3 chủng A oryzae có khả năng sinh tổng hợp galactosidaza từ 29 chủng nấm mốc thu c chi Aspergillus và trong 3 chủng này chọn được chủng có hoạt tính cao nhất là A oryzae 3 2 Môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men được xác định. .. sát động thái của quá trình lên men sinh tổng hợp β -galactosidaza từ chủng nấm mốc A oryzae 3 Hoạt độ β -galactosidaza Sinh khối tế bào (g/l) pH dịch lên men Thời gian lên men Hình 3.3 Động thái quá trình sinh tổng hợp β -galactosidaza từ chủng nấm mốc A oryzae 3 Hoạt độ β -galactosidaza tăng mạnh từ 24 đến 72 giờ (pha tăng trưởng), duy trì ổn định từ giờ 72 đến giờ 96 và bắt đầu giảm dần từ khoảng sau... 1-5mM) của chúng tôi thu được phù hợp với các kết quả nghiên cứu đã công bố trên thế giới và chứng tỏ rằng β -galactosidaza A.oryzae 3 có ái lực cao với cơ chất oNPG 3.5.6 Xác định chất kìm hãm đặc hiệu trung tâm hoạt động của galactosidaza từ A oryzae 3 Bảng 3.14 Khảo sát tác nhân kìm hãm đặc hiệu trung tâm hoạt động β -galactosidaza Tác nhân kìm hãm (10-2 M) Hoạt độ β -galactosidaza tương đối (%) Đối chứng... từ A oryzae 3 Bảng 3.12 Kết quả xác định ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính β -galactosidaza từ A oryzae 3 Ion kim loại (2.10-3M) Đối chứng Zn2+ Fe2+ Mg2+ Ca2+ Ba2+ Mn2+ Hoạt độ β -galactosidaza tương đối (%) 100,00 68,80 72,68 124,24 127,59 132,07 139,40 Chúng tôi xác định hoạt tính β -galactosidaza bằng cách cho phản ứng với cơ chất oNPG trong môi trường dung dịch đệm photphat có bổ sung một số. .. protein có một pI riêng; nhưng nói chung, pI của β -galactosidaza từ vi sinh vật thường có tính acid Điểm đẳng điện của β -galactosidaza được xác định bằng ethanol 96% và đo độ đục của dịch trong các ống ở bước sóng 620 nm pI của enzym có giá trị bằng pH của dịch trong ống nghiệm cho độ đục cao nhất Độ đục của dịch lớn nhất ở pH 5,5 Như vậy cũng như các protein β -galactosidaza vi sinh vật khác, βgalactosidaza . BÙI THỊ HẢI HÒA NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA β -GALACTOSIDAZA TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS SP. VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ SẢN XUẤT GALACTOOLIGOSACCARIT Chuyên. tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu thu nhận, tinh chế và xác định đặc tính β -galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus sp. - Tách dòng gen mã hóa sinh tổng hợp β -galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus sp. . định một số đặc tính của β -galactosidaza từ Aspergillus sp . 5. Tách dòng, xác định và phân tích trình tự gen mã hóa sinh tổng hợp β- galactosidaza từ nấm mốc Aspergillus sp. 6. Nghiên cứu các