1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG LÊ TH THU TRANG NGHIÊN C U KH NĂNG T NG H P PECTINESTERASE VÀ POLYGALACTURONASE C A ASPERGILLUS NIGER Chuyên ngành: Công ngh Th c ph m Đ u ng Mã s : 60 54 02 TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ K THU T Đà N ng - Năm 2011 Cơng trình đư c hồn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG Ngư i hư ng d n khoa h c: PGS TS Tr n Th Xô Ph n bi n 1: TS Huỳnh Ng c Th ch Ph n bi n 2: PGS.TS Lê T H i Lu n văn ñư c b o v t i H i ñ ng ch m Lu n văn t t nghi p th c sĩ k thu t h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 03 tháng 12 năm 2011 Có th tìm hi u lu n văn t i: - Trung tâm Thông tin - H c li u, Đ i h c Đà N ng - Trung tâm H c li u, Đ i h c Đà N ng 3 M Đ U Tính c p thi t c a ñ tài Enzyme pectinase bao g m nhi u lo i enzyme khác polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tác th y phân phân t pectin t o s n ph m khác Trong đó, hai enzyme polygalacturonase (PG) pectinesterase (PE) đư c nghiên c u nhi u PE xúc tác th y phân liên k t ester c a acid pectic v i nhóm methyl gi i phóng pectate methanol Các pectate d k t l ng, ñ c bi t u ki n có ion Ca2+, làm s n ph m n ñ nh ñ ng th i rư u methanol thành ph n không mong mu n s n ph m, c n h n ch ho t đ ng c a PE PG xúc tác th y phân liên k t α-(1,4)–D–galacturonic phân t pectin ñ t o thành acid galacturonic có phân t lư ng nh khó k t l ng hơn, giúp s n ph m n đ nh Vì v y, m t h enzyme có ho t đ enzyme PG cao PE th p m t yêu c u c n thi t cho s n xu t V i ưu m d ni c y, sinh trư ng phát tri n nhanh cho nhi u enzyme m t th i gian ng n, vi sinh v t, ñ c bi t n m m c ñư c s d ng ph bi n đ ni c y thu enzyme pectinase thương m i, đó, A niger ch ng sinh enzyme pectinase nhi u Xu t phát t nh ng v n đ trên, chúng tơi ti n hành nghiên c u, xây d ng ñ tài: “Nghiên c u kh t ng h p pectinesterase polygalacturonase c a Aspergillus niger” M c đích nghiên c u - Phân l p ch ng n m m c A niger t ngu n trái giàu pectin 4 - Xác ñ nh ñi u ki n t i ưu ñ ch ng n m m c Aspergillus niger có kh sinh t ng h p enzyme polygalacturonase v i ho t ñ cao enzyme pectinesterase có ho t đ th p - Xác đ nh ñ c ñi m c a enzyme Ph m vi nghiên c u Phân l p ch ng n m m c Aspergillus niger t t nhiên Đánh giá ho t ñ enzyme pectinase t ch ng n m m c ñã phân l p ñư c Nghiên c u nh hư ng c a s thay ñ i hàm lư ng pectin, pH ban ñ u th i gian ni c y đ n kh sinh t ng h p enzyme polygalacturonase pectinesterase c a ch ng A.niger T i ưu hoá kh sinh t ng h p enzyme polygalacturonase pectinesterase c a A niger Phương pháp nghiên c u - Phương pháp hóa h c: Phương pháp chu n ñ xác ñ nh ho t ñ enzyme - Phương pháp hóa lý: S d ng pH k đ ño pH c a môi trư ng trư c lên men; Phương pháp so màu ñ xác ñ nh ho t ñ enzyme - Phương pháp vi sinh v t: Phương pháp c y mơi trư ng đ c ñ phân l p n m m c; Phương pháp quan sát đ c tính sinh lý c a vi sinh v t; Phương pháp nuôi c y b m t ñ lên men t ng h p enzyme - Phương pháp toán h c: S d ng quy ho ch th c nghi m toàn ph n y u t ñ kh o sát nh hư ng c a y u t ñ n ho t ñ enzyme PG PE; S d ng công c Solver tìm u ki n lên men t i ưu cho sinh t ng h p polygalacturonase pectinesterase - Phương pháp tinh s ch enzyme qua c t s c kí n di SDSPAGE Ý nghĩa khoa h c c a ñ tài Xác ñ nh ñư c ñi u ki n nuôi c y t i ưu ñ ch ng n m m c A.niger t ng h p enzyme PG PE có ho t đ thích h p b ng phương pháp quy ho ch th c nghi m t i ưu hố Xác đ nh đư c đ c ñi m c a enzyme polygalacturonase c a ch ng A.niger Ý nghĩa th c ti n c a ñ tài Đ t ñư c s cho vi c xác ñ nh ñi u ki n s n xu t enzyme pectinase có ho t ñ thích h p, phù h p v i yêu c u s n xu t, góp ph n phát tri n ngành công nghi p vi sinh nư c ta C u trúc c a lu n văn Ngồi ph n m đ u, k t lu n tài li u tham kh o, lu n văn bao g m chương, m c sau: + Chương 1: T ng quan; + Chương 2: Đ i tư ng phương pháp nghiên c u; + Chương 3: K t qu th o lu n 6 CHƯƠNG 1: T NG QUAN 1.1 ENZYME PECTINASE 1.1.1 Đ c ñi m ch t 1.1.1.1 Gi i thi u v pectin 1.1.1.2 C u t o pectin Pectin nh ng polygalacturonic polysaccharide ch a acid α-(1-4) m ch chính, có th b methyl hóa ho c acetyl hóa m t cách ng u nhiên Có ba lo i pectin khác ñư c chi t tách t thành t bào th c v t *Homogalacturonan * Rhamnogalacturonan I (RG I) * Rhamnogalacturonan II (RG II) 1.1.1.3 Phân lo i pectin * Acid pectic * Acid pectinic * Pectin (Polygalacturonate) 1.1.2 Phân lo i ch ph n ng c a enzym pectinase 1.1.2.1 Enzyme pectinesterase (PE) (EC.3.1.11.1) Pectinesterase hay cịn đư c g i v i m t s pectinmethylesterase, pectase, pectin tên khác methoxylase, pectin demethoxylase pectolipase, thu c nhóm enzyme th y phân 7 Enzyme PE xúc tác trình th y phân liên k t ester phân t pectin, gi i phóng methanol acid pectic ho c acid pectinic 1.1.2.2 Enzyme polygalacturonase (PG) PG enzyme xúc tác s th y phân liên k t α-(1-4) glycoside phân t pectin Polygalacturonase m t ph c h enzyme g m nhi u enzyme thư ng có tính đ c hi u cao đ i v i ch t * Polymethylgalacturonase tác d ng ch y u lên ester methylic c a acid polygalacturonic Các enzyme đư c chia làm hai nhóm nh tùy theo liên k t glycoside b c t ñ t: - Endo–glucosidase–polymethylgalacturonase ki u I - Exo–glucosidase–polymethylgalacturonase ki u III * Polygalacturonase enzyme tác ñ ng ch y u lên acid pectinic acid pectic Các enzyme đư c chia làm hai nhóm d a vào v trí liên k t glycoside b th y phân - Endo–glucosidase-polygalacturonase ki u II - Exo–glucosidase–polygalacturonase ki u IV 1.1.2.3 Pectin lyase (PEL) Hình 1.7: Mơ hình ho t ñ ng c a h enzyme pectinase 1.1.3 ng d ng c a enzym pectinase 1.1.3.1 ng d ng công nghi p th c ph m * S n xu t nư c qu * S n xu t rư u vang ñ * Lên men trà cà phê * S n xu t tinh d u 1.1.3.2 ng d ng ngành công nghi p khác * Trong công nghi p d t x lý sinh h c cotton * Trong x lý nư c th i * Trong s n xu t th c ăn chăn nuôi 1.1.4 Vi sinh v t t ng h p pectinase * Pectinesterase * Polygalacturonase 1.2 N M M C ASPERGILLUS NIGER 1.2.1 Gi i thi u chung v n m m c 1.2.1.1 Hình thái c u t o 1.2.1.2 Sinh s n c a n m m c *Sinh s n vô tính * Sinh s n h u tính 1.2.2 N m m c Aspergillus niger 1.2.2.1 Hình d ng, kích thư c, c u t o c a ch ng Aspergillus niger 1.2.2.2 Dinh dư ng tăng trư ng c a Aspergillus niger 1.2.3 Sinh s n c a ch ng Aspergillus niger 1.2.4 V trí vai trị c a Aspergillus niger 1.3 QUÁ TRÌNH THU NH N ENZYME PECTINASE T VI SINH V T 1.3.1 Tuy n ch n c i t o gi ng 1.3.2 Nuôi c y vi sinh v t 1.3.3 Thu nh n ch ph m enzyme 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U TRONG NƯ C VÀ TRÊN TH GI I V ENZYM PECTINASE 1.4.1 Nh ng nghiên c u nư c 1.4.2.Nh ng nghiên c u nư c 10 CHƯƠNG 2: Đ I TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Đ I TƯ NG NGHIÊN C U 2.1.1 Đ i tư ng Các lo i qu giàu pectin chanh, cam, bư i ñ a bàn thành ph Đà N ng Ch ng A niger phòng thí nghi m vi sinh, khoa hóa trư ng Đ i h c Bách Khoa 2.1.2 Hoá ch t 2.1.3 D ng c - Thi t b 2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1.Phương pháp c y môi trư ng ñ c ñ phân l p n m m c 2.2.2 Phương pháp nuôi c y n m m c mơi trư ng th ch Czapek đ quan sát ñ c ñi m sinh lý xác ñ nh ho t ñ enzyme * Quan sát ñ i th * Quan sát vi th * Th ho t tính enzyme pectinase 2.2.3 Phương pháp nuôi c y b m t ñ lên men sinh enzyme 2.2.4 Phương pháp xác ñ nh ho t ñ enzyme 2.2.4.1 Phương pháp khu ch tán ñĩa th ch 2.2.4.2 Phương pháp xác ñ nh ho t ñ polygalacturonase 2.2.4.3 Phương pháp xác ñ nh ho t ñ pectinesterase 2.2.5 Phương pháp chi t tách tinh s ch enzyme 2.2.6 Phương pháp xác ñ nh hàm lư ng protein 2.2.7 Phương pháp ñi n di gel polyacrylamide 2.2.8 Phương pháp toán h c 11 CHƯƠNG 3: K T QU VÀ TH O LU N 3.1.PHÂN L P N M M C T CÁC NGU N T NHIÊN B ng 3.1 Đ c m hình thái c a ch ng n m m c Đ c Ch ng n m m c A.niger Ch ng n m m c PL ñi m PTN S i S i n m có màu tr ng đ c, S i n m có màu tr ng ñ c, h n m h s i ch t r chùm s i ch t môi trư ng c a th c v t r Khu n Khu n l c ch y u có hình Khu n l c có hình trịn, x p, l c trịn, b m t l i, x p, mép mép dày, ñ u khu n l c d ng dày đ u Khóm n m m c có đư ng Khóm n m m c có đư ng kính cm sau ngày ni kính 5,2 cm sau ngày ni c y môi trư ng th ch c y mơi trư ng th ch Czapek Czapek Khóm n m m c có màu Khóm n m m c có màu nâu ñen, l m t m bã cà ñen, l m t m bã cà phê phê 12 Bào t Đính bào t t a đ u Bơng hình c u, có màu đen đính hư ng th bình có hình Cu ng bào t có vách trơn H t đính g n c u ñ n hình chai, hai l p Cu ng bào t có vách trơn H t đính có c u hình c u D a vào nh ng đ c ñi m tương ñ ng v hình nh c a khu n l c cu ng bào t , ñính bào t c a ch ng n m m c này, có th k t lu n sơ b ch ng n m m c phân l p ñư c thu c ch ng A niger kí hi u ch ng A niger PL 3.2 ĐÁNH GIÁ KH NĂNG SINH TRƯ NG PHÁT TRI N C A CH NG A.NIGER 3.2.1 Đánh giá kh sinh trư ng c a ch ng n m m c phân Đư ng kính khu n l c, mm l p 60 50 40 A.niger PTN 30 A.niger PL 20 10 24 36 48 60 72 Th i gian, gi Hình 3.3: T c đ sinh trư ng c a ch ng n m m c A.niger Sau nh ng kho ng th i gian nhau, ñư ng kính khu n l c c a ch ng A niger PL đ t đư c ln l n khu n l c c a ch ng A niger PTN M c ñ chênh l ch l n th i gian nuôi c y dài, 13 sau ngày, đư ng kính khu n l c c a ch ng PL cao ch ng PTN 1,24 l n Như v y, kh sinh trư ng c a ch ng A niger PL cao so v i ch ng A niger PTN 3.2.2 Đánh giá kh sinh t ng h p pectinase c a hai ch ng n mm c B ng 3.2 Ho t tính enzyme c a hai ch ng A niger PL A niger PTN: A.niger PL A.niger PTN 3,5 17/6 16,5/6 Ho t ñ PG, U/ml 1,237 0,876 Ho t ñ PE, U/ml 0,086 0,093 T l PG/PE 14,38 9,41 Vòng th y phân xung quanh khu n l c, mm Đư ng kính vịng th y phân (D/d), mm D a vào b ng 3.2 ta th y, ch ng n m m c A niger PL có kh sinh t ng h p pectinase cao t l ho t ñ PG PE đư c tìm th y cao h n so v i ch ng A niger PTN Do đó, ch ng n m m c A.niger PL ñư c ch n ñ kh o sát nh hư ng c a u ki n ni c y ñ n kh sinh enzyme pectinesternase polygalacturonase 3.3 NGHIÊN C U C Y Đ N KH PECTINESTERASE A.NIGER NH HƯ NG C A ĐI U KI N NUÔI NĂNG SINH T NG H P ENZYME VÀ POLYGALACTURONASE C A 14 3.3.1 Nghiên c u nh hư ng c a hàm lư ng pectin 1,500 1,242 Ho t ñ enzyme, U/ml 1,200 0,854 0,900 0,776 PG PE 0,600 0,300 0,252 0,136 0,175 0,151 0,070 0,219 0,182 0,000 10 15 20 0,073 0,107 25 30 Hàm lư ng pectin, g/l Hình 3.5: nh hư ng c a hàm lư ng pectin ñ n kh t ng h p polygalacturonase pectinesterase c a ch ng A niger PL Khi hàm lư ng pectin tăng t 5–15 g/l, ho t đ enzyme PG tăng khơng đáng k , t 0,136 U/ml lên 0,252 U/ml Tuy nhiên, hàm lư ng pectin môi trư ng tăng t 15–25 g/l ho t đ PG l i tăng m nh ñ t c c ñ i 1,242 U/ml hàm lư ng pectin 25 g/l V i hàm lư ng pectin l n 25g/l, ho t ñ enzyme PG gi m Ngư c l i v i PG, ho t ñ enzyme PE tăng nhanh kho ng hàm lư ng pectin 5-15 g/l t 0,070 U/ml lên ñ t c c ñ i 0,219 U/ml Khi hàm lư ng pectin tăng lên l n 15 g/l, ho t ñ c a PE l i gi m xu ng ch 0,073 U/ml tương ng v i hàm lư ng pectin 30 g/l sau kh o sát s nh hư ng c a n ng đ pectin mơi trư ng ni c y, chúng tơi xác đ nh đư c kho ng hàm lư ng pectin ñ ch ng A niger PL sinh t ng h p enzyme PG cao 20–30 g/l ñ t c c ñ i hàm lư ng pectin 25 g/l ho t ñ PE th p 15 3.3.2 Nghiên c u nh hư ng c a pH 1,500 Ho t ñ enzyme, U/ml 1,159 1,200 1,027 0,937 0,900 0,805 0,755 0,747 0,654 PG PE 0,600 0,300 0,130 0,141 0,177 3.5 4.0 4.5 0,211 0,130 0,112 0,099 5.5 6.0 6.5 0,000 5.0 pH Hình 3.7: nh hư ng c a pH ban đ u ñ n kh sinh t ng h p polygalacturonase pectinesterase c a ch ng A.niger PL T k t qu bi u di n hình 3.6 cho th y, ch ng A niger PL có kh sinh t ng h p PG t t kho ng pH 4,5–6,0 ñ t c c ñ i t i pH 5,5 (1,159 U/ml) kh sinh enzyme PE c a ch ng A niger PL cao kho ng pH 4,0 – 5,0 ñ t c c ñ i t i pH 5,0 (0,211 U/ml) Như v y, theo nghiên c u này, ch ng A.niger PL sinh t ng h p PG PE cao kho ng pH tương ng 4,5–6,0 4,0–5,0; đó, t i pH 5,5 ho t đ enzyme PG ñ t c c ñ i ho t ñ PE th p 16 3.3.3 Nghiên c u nh hư ng c a th i gian nuôi c y Ho t ñ enzyme, U/ml 1,500 1,447 1,200 0,923 0,813 0,900 0,725 0,586 0,600 PG PE 0,284 0,300 0,083 0,099 0,109 0,172 0,089 0,068 120 144 0,000 24 48 72 96 Th i gian, gi Hình 3.7: nh hư ng th i gian ni c y đ n kh sinh t ng h p polygalacturonase pectinesterase c a ch ng A niger PL Theo k t qu hình 3.7 ta th y th i gian nuôi c y tăng t 24 – 72 gi ho t đ c a enzyme PG tăng t 0,284 – 1,447 U/ml Ho t ñ enzyme PG ñ t giá tr cao nh t sau 72 gi 1,447 U/ml Sau th i gian 72 gi n u ti p t c kéo dài th i gian nuôi ta th y ho t đ enzyme PG gi m gi m r t m nh xu ng 0,586 U/ml t i 144 gi Th i gian ni c y khơng ch nh hư ng đ n ho t đ enzyme PG mà cịn nh hư ng ñ n ho t ñ enzyme PE thu ñư c Ta th y ho t ñ enzyme PE tăng t 0,083–0,172 U/ml th i gian nuôi tăng t 24 gi – 96 gi ñ t giá tr cao nh t 0,172 U/ml sau 96 gi nuôi Khi th i gian ni kéo dài 96 gi ho t đ enzyme PE khơng nh ng khơng tăng mà gi m gi m xu ng 0,068 U/ml 144 gi 17 Trong nghiên c u này, chúng tơi kh o sát đư c kho ng th i gian t i ưu ñ ch ng A.niger PL sinh t ng h p PG c c ñ i 72 gi , sau kho ng th i gian trình sinh t ng h p PE th p 3.4 T I ƯU HOÁ ĐI U KI N LÊN MEN SINH T NG H P ENZYME PG VÀ PE C A CH NG N M M C A.NIGER PL 3.4.1 Ch n y u t nh hư ng 3.4.2 Ch n u ki n thí nghi m yn = b0(n)+b1(n)x1 +b2(n)x2+b3(n)x3+b12(n)x1x2+b13(n)x1x3+b23(n)x2x3+b123(n)x1x2x3 B ng 3.3 Đi u ki n thí nghi m Y ut Z1 Z2 Z3 3.4.3 Các m c M c s M c dư i -1 25 20 5,5 4,5 96 72 M c +1 30 6,5 120 Kho ng bi n thiên (λ) 1,0 24 T ch c th c hi n thí nghi m B ng 3.4 Mơ hình k t qu thí nghi m quy ho ch nhân t toàn ph n 23 TT x1 x2 x3 x1x2 x1x3 x2x3 x1x2x3 y1 y2 + + + + + + + 1,046 0,172 - + + - - + - 0,989 0,201 + - + - + - - 1,469 0,135 - - + + - - + 1,126 0,130 + + - + - - - 1,475 0,122 - + - - + - + 1,116 0,135 + - - - - + + 1,424 0,070 - - - + + + - 1,239 0,156 T1 0 0 0 1,372 0,125 T2 0 0 0 1,292 0,138 T3 0 0 0 1,343 0,133 18 3.4.4 Tính h s h i quy B ng 3.5 Giá tr h s b phương trình h i quy Các h s b phương Các h s b phương trình y1 trình y2 H s Giá tr H s Giá tr b0(1) 1,235 b0(2) 0,140 b1(1) 0,118 b1(2) -0,015 b2(1) -0,079 b2(2) -0,017 b3(1) -0,078 b3(2) 0,019 b12(1) -0,014 b12(2) 0,005 b13(1) -0,018 b13(2) 0,009 b23(1) -0,061 b23(2) -0,009 b123(1) -0,058 b123(2) 0,002 3.4.5 Ki m đ nh tính ý nghĩa c a h s h i quy s tương thích c a phương trình B ng 3.6 Giá tr chu n Student th c nghi m ttn Chu n student c a h s b phương trình y1 Chu n student c a h s b phương trình y2 H s Giá tr H s Giá tr t0(1) 86,87 t0(1) 60,55 t1(1) 8,28 t1(1) 6,60 t2(1) 5,53 t2(1) 7,45 t3(1) 5,50 t3(1) 8,29 t12(1) 1,01 t12(1) 2,10 t13(1) 1,24 t13(1) 4,07 t23(1) 4,32 t23(1) 4,07 t123(3) 4,02 t123(3) 1,00 19 Giá tr c a b ng tiêu chu n Student ñ i v i m c ý nghĩa p = 0,05 b c t f = tp(f) = 4,3 *) So sánh v i giá tr t(p,f): - N u tj ≥ tp(f) h s bj có nghĩa đư c gi l i phương trình h i quy - N u tj< tp(f) h s bj b lo i kh i phương trình h i quy Do t12(1) , t13(1) , t123(1) < tp(f) nên h s b12(1), b13(1), b123(1) khơng có ý nghĩa, ta lo i kh i phương trình, lúc phương trình h i quy có d ng: y1 = 1,235 + 0,118x1 – 0,079x2 – 0,078x3 – 0,061x2x3 (3.9) Do t12(2), t13(2), t23(2), t123(2) < tp(f) nên h s b12(2) , b23(2) , b13(2), b123(2) khơng có ý nghĩa, ta lo i kh i phương trình, lúc phương trình h i quy có d ng: y2 = 0,140 - 0,015x1 + 0,017x2 + 0,019x3 (3.10) B ng 3.7 Các giá tr ñ tính ñ l ch dư y1 ŷ1 (y1-ŷ1)2 y2 ŷ2 (y2-ŷ2)2 1,046 1,197 0,0227 0,172 0,161 0,0001 0,989 0,961 0,0008 0,201 0,192 0,00007 1,469 1,354 0,0133 0,135 0,127 0,00007 1,126 1,118 0,00006 0,130 0,158 0,0007 1,475 1,353 0,0148 0,122 0,123 0,00001 1,118 1,117 0,00001 0,135 0,154 0,0003 1,424 1,510 0,0075 0,070 0,089 0,0003 1,239 1,275 0,0013 0,156 0,119 0,0014 20 F0,95 (4, 2) = 19,3, F0,95 (5; 2) = 19,3 Do F(1), F(2) < F1-p(f1,f2), phương trình phương trình thu đư c tương thích v i th c nghi m ñư c s d ng ñ tìm ki m t i ưu 3.4.6 T i ưu hố u ki n đ sinh t ng h p PG PE Đ t i ưu hóa u ki n lên men sinh t ng h p enzyme PG PE, s d ng công c Solver c a ph n m m excel Phương trình: y1=1,235 + 0,118x1 – 0,079x2 – 0,078x3 – 0,061x2x3; y2 = 0,140 – 0,015x1 + 0,017x2 + 0,019x3 Mi n gi i h n c a bi n: Các bi n đư c tìm ki m t i ưu mi n giá tr [-1; 1] Các giá tr kh i ñ ng t i ưu hóa: x1 = ; x2 = ; x3 = Sau ch y ph n m m Excel v i hai hàm m c tiêu, chúng tơi thu đư c k t qu sau : y1→ max v i k t qu : x1 =1; x2 = -1; x3 = -1, y1 = 1,449 y2 → v i k t qu : x1 =1; x2 = -1; x3 = -1, y2 = 0,088 V i giá tr bi n mã, suy giá tr th c sau: - Hàm lư ng pectin: 30 g/l; - pH: 4,5; - Th i gian lên men: 72 gi 3.4.7 Thí nghi m ki m ch ng Đ kh ng ñ nh l i k t qu c a trình t i ưu, chúng tơi ti n hành thí nghi m ki m ch ng t i ñi u ki n t i ưu thu ñư c K t qu thu ñư c ho t ñ enzyme PG 1,464 U/ml, ho t ñ PE 0,078 U/ml So v i k t qu t i ưu lý thuy t có th p 21 khơng ñáng k , t n t i sai s có th nhi u y u t nh hư ng q trình th c hi n thí nghi m Như v y, b ng phương pháp quy ho ch th c nghi m, chúng tơi xây d ng đư c phương trình tốn h c mơ t m i tương quan c a y u t q trình lên men đ n kh sinh t ng h p enzyme PG PE c a ch ng n m m c A niger PL Phương trình h i qui cho th y y u t : n ng ñ pectin, pH ban ñ u c a môi trư ng th i gian lên men ñ u nh hư ng ñ n ho t ñ PG PE c a ch ng A niger PL 3.5 TINH S CH ENZYME 4,5 1,2 3,5 0,8 2,5 0,6 1,5 0,4 0,2 Hàm lư ng protein, mg/ml Ho t tính enzyme, U/ml 0,5 0 11 16 21 26 31 36 Phân đo n Ho t tính PE Ho t tính PG Hàm lư ng protein Hình 3.8 Đ th bi u di n hàm lư ng protein ho t ñ enzyme PG PE c a d ch enzyme sau s c kí Sau qua c t silicagel, t d ch enzyme thơ tách đư c ñ nh protein, xác ñ nh ho t ñ enzyme có m t ñ nh có ho t ñ PG, ho t ñ c a PE khơng đáng k Ho t đ PG cao nh t ñ t 3,832 U/ml 22 phân ño n 18, tăng 2,6 l n so v i ho t ñ PG c a m u enzyme thô (1,464 U/ml) Hình 3.9 Hình nh n di m u enzyme A – Đi n di SDS, B – Đi n di ch t Trong đó, WM: protein chu n (14,4 – 97,4 kDa); SK: m u enzyme sau s c kí; T: m u enzyme thơ K t qu n di gel SDS-PAGE khơng có ch t cho th y v i m u enzyme thô sau k t t a, có băng protein xu t hi n Nhưng v i m u enzyme sau q trình s c kí t i phân đo n có ho t đ enzyme PG cao, ch thu đư c băng protein có kh i lư ng phân t 40 30 kDa Tuy nhiên, băng protein có kh i lư ng phân t 30 kDa m Khi ñi n di gel ch t acid polygalacturonic băng protein có kh i lư ng phân t 30 kDa khơng có ho t đ C m u enzyme thô m u s c kí đ u ch cho m t băng protein có ho t đ PG trùng v i băng 23 có kh i lư ng phân t 40 kDa Như v y, có th k t lu n, enzyme PG ch ng n m m c A niger PL t ng h p có kh i lư ng phân t 40 kDa 24 K T LU N VÀ KI N NGH K t lu n T k t qu ñ t ñư c c a nhi u thí nghi m th c hi n, chúng tơi rút ñư c k t lu n sau: - S d ng phương pháp nuôi c y môi trư ng ñ c th ch Czapek ñã phân l p ñư c ch ng n m m c thu n t t nh ng ngu n t nhiên có đ c m hình thái: khu n l c có màu nâu đen, l m t m bã cà phê; hình d ng khu n l c ch y u tròn, dày, b m t l i, x p, mép khu n l c d ng dày đ u; đ u s i n m phình to ra, cu ng bào t đính khơng phân nhánh, t bào hình chai bào t đính t a ñ u ñ u s i n m bơng V i nh ng đ c m này, so sánh v i ch ng n m m c A niger PTN, có th sơ b k t lu n ch ng n m m c phân l p đư c A niger đư c kí hi u A niger PL - So sánh v kh sinh trư ng phát tri n kh t ng h p pectinase c a ch ng A niger PL sau 72 gi nuôi c y cho th y ch ng có kh phát tri n m nh ho t ñ enzyme cao h n so v i ch ng A.niger gi gi ng t i phịng thí nghi m vi sinh Khoa hóa Đ i h c Bách Khoa - K t qu nghiên c u nh hư ng c a u ki n ni c y ñ ho t ñ enzyme PG cao PE th p: + Hàm lư ng pectin b sung vào mơi trư ng: 25 g/l đ t ho t đ PG + pH ban đ u c a mơi trư ng 5,5 +Th i gian nuôi c y 72 gi - B ng phương pháp qui ho ch th c nghi m ñ t i ưu hóa u ki n ni c y nh hư ng ñ n kh sinh t ng h p PG PE 25 c a ch ng A niger PL, chúng tơi tìm đư c u ki n t i ưu sinh t ng h p enzyme có ho t đ PG cao PE th p t ch ng n m m c A niger PL sau: hàm lư ng pectin 30g/l; pH ban đ u c a mơi trư ng 4,5; th i gian nuôi 72 gi v i ho t ñ enzyme PG PE thu ñư c 1,449 U/ml 0,087 U/ml - Bư c ñ u tinh s ch enzyme b ng phương pháp s c kí qua c t silicagel, ho t ñ c a enzyme PG sau tinh s ch ñã tăng lên 2,7 l n so v i m u enzyme thô - Đi n di SDS-PAGE xác ñ nh ñư c kh i lư ng phân t c a enzyme PG 40 kDa Ki n ngh - Nghiên c u nh hư ng c a s thay ñ i thành ph n môi trư ng ngu n carbon, ngu n nitrogen thay th b ng thành ph n t nhiên đ n q trình sinh t ng h p enzyme PG PE c a ch ng n m m c A niger PL - Nghiên c u nh hư ng c a ñi u ki n ph n ng pH, nhi t ñ , n ng đ ch t, s có m t c a ion kim lo i ñ n ho t ñ c a enzyme PG PE sinh t ng h p t A niger PL - Nghiên c u ng d ng enzyme PG PE c a ch ng A.niger PL vào trình s n xu t nư c qu bóc v cam, quýt, đ có th ph c v cho ngành cơng nghi p th c ph m  ... 1.1.3.2 ng d ng ngành công nghi p khác * Trong công nghi p d t x lý sinh h c cotton * Trong x lý nư c th i * Trong s n xu t th c ăn chăn nuôi 1.1.4 Vi sinh v t t ng h p pectinase * Pectinesterase *... (Polygalacturonate) 1.1.2 Phân lo i ch ph n ng c a enzym pectinase 1.1.2.1 Enzyme pectinesterase (PE) (EC.3.1.11.1) Pectinesterase hay cịn đư c g i v i m t s pectinmethylesterase, pectase, pectin tên khác... polygalacturonase, pectinesterase, pectolyase,… xúc tác th y phân phân t pectin t o s n ph m khác Trong đó, hai enzyme polygalacturonase (PG) pectinesterase (PE) ñư c nghiên c u nhi u PE xúc tác th y phân