PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG NẤM Fusarium oxysporum GÂY BỆNH HÉO RŨ TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG CẠN Vũ Thuý Nga Summary Isolation and selection of Bacillus antagonistic to wilt caused by Fusarium oxysporum The result of study showed that some Bacillus strains can antagonistic wilt caused Fusarium oxysporum. The result of identification by sequence rARN 16S method showed that the sequence rARN 16S of 5.1 strain has 100% base similar Bacillus subtilis strain, the sequence rARN 16S of M strain has 99% base similar Bacillus velezensis and the sequence rARN 16S of B17 has 99,1% base similar Bacillus polyfermenticus. According to European Comunity, species are selected have high biosafety and it is promissing to apply in common. All of them can grow very good in MT1, King and PDA medium at pH 6,5-7 and temperate 25-30 0 C. Keywords: Bacillus, strain, wilt, antagonistic, Bacillus polyfermenticus, Bacillus velezensis, Bacillus subtilis. I. T VN  Bacillus thuộc nhóm vi khuNn sống phổ biến trong đất. Một số chủng Bacillus đã được sử dụng để sản xuất các chế phNm sinh học trừ côn trùng gây hại cây trồng như Bacillus thuringiensis var Kurstaki trừ sâu tơ, Bacillus thuringiensis var Bralensis trừ muỗi, các chế phNm này đã được sản xuất với khối lượng lớn phục vụ sản xuất. Một số chủng Bacillus khác còn có khả năng ức chế một số loại nấm gây bệnh cây trồng cũng đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhằm khai thác có hiệu quả khả năng này. Công trình nghiên cứu được thực hiện theo hướng phân lập tuyển chọn một số chủng Bacillus có khả năng ức chế loại nấm gây bệnh héo rũ cây trồng cạn Fusarium oxysporum, là loại ký sinh gây hại nghiêm trọng nhiều loại cây trồng, rất khó phòng trừ bằng thuốc hoá học. Bài báo trình bày kết quả nghiên cứu bước đầu phân lập, tuyển chọn nhằm bổ sung vào quỹ gen vi sinh vật một số chủng Bacillus có khả năng ức chế nấm Fusarium oxysporum gây bệnh cây trồng cạn có thể ứng dụng sản xuất phân bón sinh học phục vụ sản xuất. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 1. Vật liệu nghiên cứu - Các mu t, phân chung hoai mc, mu cây trng thuc h cà, h bu bí, h u ưc thu thp t mt s nơi như: Hà Ni, Bc Giang, Thanh Hóa, Hà Tây, Hòa Bình và Vĩnh Phúc. - Chng nm bnh Fusarium oxysporum gây bnh cho t, dưa hu, lc ưc lưu gi trong b ging qu gen vi sinh vt nông nghip ti B môn Vi sinh vt - Vin Th nhưng Nông hóa. - Ging lc L50 do Trung tâm u  - Vin Cây lương thc và Cây thc phNm cung cp. Ging dưa hu Hc M Nhân 224, t cay F1 nhp ni t Hàn Quc do Trung tâm Ging cây trng Trung ương 1 cung cp. - Môi trưng phân lp, nuôi cy, nhân ging vi sinh vt (VSV) như: King, MT1, PDA, Czapeck, Ashby, Pikovskaya). 2. Phương pháp nghiên cứu - Phân lp vi khuNn Bacillus: Các mu t, cây và phân  ưc thu thp, bo qun  nhit  phòng. Sau ó ly 10 gram mu nghin mn cho vào bình tam giác cha 90 ml nưc ct kh trùng, x lý  nhit  cao 80 - 100 0 C trong thi gian 5 - 10 phút. Cy trên môi trưng King, thu nhn khuNn lc ln u, tip tc làm sch nhiu ln  ưc khuNn lc thun khit, th hot tính i kháng và gi li các khuNn lc có hot tính cao  làm các thí nghim tip theo. - c im sinh hc ca các chng VSV ưc xác nh theo các phương pháp nghiên cu vi sinh vt hc thông thưng. - Phân loi theo phương pháp truyn thng, h thng BIOLOG và phương pháp PCR. - Phương pháp ánh giá hot tính i kháng nm bnh theo 10TCN 867:2006. - Phương pháp ánh giá trên cây trong iu kin phòng thí nghim và nhà lưi. Tin hành thí nghim trng cây trong nhà lưi i vi ging lc L50, ging dưa hu Hc M Nhân 224, ging t cay F1 trên nn t kh trùng. Công thc thí nghim ưc lp li 5 ln vi khay hoc r cha 8 - 10 kg t. Các chng vi khuNn Bacillus và nm bnh Fusarium oxysporum ưc nhim vào t, r cây con hoc ht ã ny mm vi mt  tương ương nhau t 10 8 CFU/g t. Tin hành theo dõi trong thi gian thí nghim 45 - 60 ngày, ánh giá ch tiêu trng lưng khô thân lá và xác nh t l cây bnh. - S liu thí nghim ưc x lý theo chương trình phn mm IRRISTAT 4.0. III. KT QU VÀ THO LUN Thu thp, phân lp, tuyn chn và ánh giá hot tính sinh hc ca các chng Bacillus i kháng nm bnh Fusarium oxysporum. ã thu thp ưc 103 mu t. Tin hành phân lp, tuyn chn và xác nh ưc mt s chng Bacillus có hot tính i kháng nm bnh Fusarium oxysporum tương i cao và n nh (Bng 1). Bảng 1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus có hoạt tính đối kháng TT Ký hiệu chủng Khả năng tạo màng Vòng đối kháng nấm Fusarium oxysporum (mm) Gây bệnh trên ớt Gây bệnh trên lạc Gây bệnh trên dưa hấu 1 B17 + 20,5 18,0 21,0 2 M + 21,5 19,5 22,0 3 5.1 + 20,0 15,5 19,0 +: Có khả năng tạo màng Số liệu Bảng 1 cho thấy các chủng được lựa chọn đều có vòng đối kháng nấm bệnh ở mức độ cao, đạt từ 15,5 đến 22 mm và ổn định qua các lần đánh giá. Hình 1. Vòng đối kháng nấm Fusarium oxysporum của các chủng Bacillus 2. Đặc điểm sinh học, phân loại các chủng vi khun Bacillus phân lập và tuyển chọn Đã xác định được các đặc điểm sinh học của các chủng vi khuNn Bacillus đã được phân lập và tuyển chọn. Kết quả được trình bày trong Bảng 2 cho thấy đây là các chủng có khả năng tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy. Bảng 2. Đặc điểm sinh học của các chủng vi khun Bacillus Đặc điểm sinh hoc Chủng vi khuẩn Bacillus phân lập và tuyển chọn B17 M 5.1 Hình dạng tế bào Hình que Hình que Hình que Hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc màu vàng nhạt, bề mặt nhăn, có vòng tròn đồng tâm ở giữa Khuẩn lạc khô, màu trắng vàng, mép không đều, nhân có vòng tròn Khuẩn lạc màu trắng hơi vàng, bề mặt khô, hơi nhăn, mép không đều Bào tử Xuất hiện nhiều sau 48 giờ nuôi cấy Xuất hiện nhiều sau 48 giờ nuôi cấy Xuất hiện nhiều sau 48 giờ nuôi cấy Phản ứng gram + + + Nhiệt độ thích hợp 25 - 35 0 C 25 - 35 0 C 25 - 35 0 C pH 6 - 8 6 - 8 6 - 8 Quan hệ với ôxy Hiếu khí Hiếu khí Hiếu khí Khả năng phân giải casein Yếu Không Yếu Khả năng phân giải kitin sau 48 giờ nuôi cấy (mm) 38 37 32 Phản ứng catalaza + + + +: Có phản ứng Trên cơ sở phương pháp định tên VSV bằng kỹ thuật phân tử (16S ARN riboxom), h thng nh danh BIOLOG và h thng phân loi Bergey’s ã xác nh ưc tên của các vi khuNn Bacillus phân lập, tuyển chọn trong nghiên cứu (Bảng 3) Bảng 3. Kết quả xác định tên và độ an toàn sinh học của các chủng vi khun Bacillus STT Ký hiệu chủng Tên vi sinh vật Mức độ an toàn CNSH 1 B17 Bacillus polyfermenticus 1 2 M Bacillus velezensis 1 3 5.1 Bacillus subtilis 1 Để xác định độ an toàn của các chủng Bacillus sau khi được phân lập và tuyển chọn, chúng tôi đã so sánh các chủng VSV nêu trên với danh mục vi khuNn trong phân nhóm các tác nhân sinh học theo Định hướng an toàn công nghệ sinh học của CHLB Đức và Cộng đồng châu Âu (Sichere Biotechnologie: Eingruppierung biologischer Agenzen: Bakterien- 1998). Kết quả (Bảng 3) cho thấy: 3 chủng vi khuNn Bacillus được phân lập và tuyển chọn thuộc nhóm các vi khuNn có độ an toàn cao (độ nguy hiểm cấp 1). Theo Hướng dẫn số 90/679/EWG ngày 26 tháng 11 năm 1990 của Cộng đồng châu Âu thì VSV thuộc độ nguy hiểm cấp 1 là các VSV không có khả năng gây bệnh đối với người và động vật. 3. Một số điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng Bacillus Tiến hành nuôi cấy các chủng phân lập được trên môi trường dinh dưỡng, kết quả cho thấy trên môi trường MT1, King, PDA các chủng vi khuNn Bacillus phát triển mạnh và hình thành các khuNn lạc điển hình, trên môi trường Pikovskaya và Ashby chúng không phát triển hoặc phát triển yếu (Bảng 4). Bảng 4. Khả năng phát triển của khun lạc vi khun Bacillus trên một số môi trường nghiên cứu Chủng vi khuẩn Khả năng phát triển trên môi trường MT1 PDA Ashby King Pikovskaya B17 ++ ++ - ++ +/- M ++ ++ - ++ +/- 5.1 ++ ++ - ++ - Ghi chú: ++: Phát triển mạnh, khuNn lạc điển hình. +/-: Phát triển yếu. +: Phát triển bình thường. -: Không phát triển, khuNn lạc không điển hình. Tiến hành xác định một số điều kiện nhiệt độ cũng như pH ảnh hưởng đến sự phát triển của các chủng vi khuNn phân lập được. Trên cơ sở các kết quả thu được có thể nhận thấy cả 3 chủng B17, M, 5.1 đều có thể phát triển mạnh trong điều kiện pH 6,5 - 7 và nhiệt độ 25 - 30 0 C, không phát triển hoặc phát triển yếu trong điều kiện pH thấp 4 - 4,5. Chúng đều phát triển được ở nhiệt độ cao 37 0 C, hoạt tính ức chế nấm bệnh Fusarium oxysporum tương đối ổn định trong các lần thí nghiệm (Bảng 5). Bảng 5. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến khả năng phát triển của các chủng vi khun Bacillus Chủng vi khuẩn pH Nhiệt độ ( 0 C) 4 - 4,5 6,5 - 7 8 - 8,5 25 30 37 B17 +/- ++ + ++ ++ + M +/- ++ + ++ ++ + 5.1 - ++ + ++ ++ + Ghi chú: ++: Phát triển mạnh, khuNn lạc điển hình. +/-: Phát triển yếu. +: Phát triển bình thường. -: Không phát triển, khuNn lạc không điển hình. 4. Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh Fusarium oxysporum của các chủng vi khun Bacillus đối với một số cây trồng Kết quả đánh giá hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus đối với nấm Fusarium oxysporum trên cây ớt, dưa hấu và lạc thể hiện trong Bảng 6. Bảng 6. Ảnh hưởng của các chủng Bacillus đến sinh trưởng của một số cây trồng TT Công thức thí nghiệm Cây lạc Cây ớt Cây dưa hấu Trọng lượng khô thân lá (g/cây) Tỉ lệ cây héo chết (%) Trọng lượng khô thân lá (g/cây) Tỉ lệ cây héo chết (%) Trọng lượng khô thân lá (g/cây) Tỉ lệ cây héo chết (%) 1 Đối chứng (không nhiễm VSV) 2,965 0 2,614 0 1,795 0 2 Nhiễm nấm bệnh F. oxysporum - 92,7 - 96,6 - 98,0 3 Nhiễm chủng B17 3,181 0 2,562 0 1,767 0 4 Nhiễm chủng M 3,223 0 0 1,815 0 5 Nhiễm chủng 5.1 3,160 0 2,574 0 1,810 0 6 Nhiễm chủng B17+ F. oxysporum 3,040 7,3 2.735 7,0 1,837 8,2 7 Nhiễm chủng M + F. oxysporum 3,045 6,7 2,641 7,1 1,793 7,5 8 Nhiễm chủng 5.1+ F. oxysporum 3,145 8,3 2,581 7,4 1,799 7,8 CV% 13,3 7,2 1,3 LSD0,05 0,5401 0,335 0,39 Tỉ lệ cây bị bệnh héo rũ ở các công thức nhiễm vi khuNn Bacillus B17, M, 5.1 đều thấp hơn so với đối chứng nhiễm nấm bệnh Fusarium oxysporum và chỉ đạt từ 6,7 đến 8,3. Trọng lượng khô thân lá ở các công thức nhiễm vi khuNn đối kháng đều không sai khác so với công thức đối chứng không nhiễm. Do vậy có thể nói nhiễm vi sinh vật đối kháng B17, M, 5.1 không ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây. IV. KT LUN VÀ  N GHN 1. Kết luận ã phân lp, tuyn chn ưc 3 chng vi khuNn Bacillus ó là chng B17, M và 5.1 có hot tính i kháng vi nm bnh Fusarium oxysporum. Trình t gen rARN 16S ca chng 5.1 ging 100% (1400/1400) vi on 16S ca vi khuNn Bacillus subtilis. Trình t gen rARN 16S ca chng M ging 99% (1333/1339) vi on 16S ca vi khuNn Bacillus velezensis. Chng B17 có 99,1% bazơ ging vi loài Bacillus polyfermenticus. ây là nhng chng có  an toàn cao thuc các vi sinh vt không có kh năng gây bnh i vi ngưi và ng vt. Các chng vi khuNn Bacillus B17, M, 5.1 u phát trin mnh và hình thành các khuNn lc in hình trên môi trưng: MT1, King, PDA trên môi trưng Pikovskaya và Ashby chúng không phát trin hoc phát trin yu. C 3 chng u có th phát trin mnh trong iu kin pH 6,5 - 7 và nhit  25 - 30 0 C. Chúng không phát trin hoc phát trin yu trong iu kin pH thp 4 - 4,5 nhưng phát trin ưc trong iu kin nhit  cao 37 0 C. Các chng vi khuNn Bacillus phân lp u không nh hưng n sinh trưng ca cây thí nghim. Trng lưng khô thân lá ca cây lc, t và dưa hu  công thc nhim vi khuNn Bacillus B17, M, 5.1 không sai khác so vi i chng vi mc tin cy cho phép. T l cây cht do ưc nhim vi sinh vt u gim hơn so vi i chng. 2. Đề nghị Vi khuNn Bacillus i kháng nm bnh Fusarium oxysporum có tim năng ln trong nghiên cu kim soát sinh hc các ngun bnh trên cây trng, do ó cn ưc tip tc nghiên cu thêm v cơ ch i kháng. TÀI LIU THAM KHO 1 guyễn Lân Dũng, 1976. Thực tập vi sinh vt. NXB. i hc và THCN, Hà Ni. 2 guyễn Lân Dũng, 1978. Mt s phương pháp nghiên cu vi sinh vt hc tp 1, 2, 3. Nhà xut bn Khoa hc K thut, Hà Ni. 3 Phạm Chí Thành, 1988. Phương pháp thí nghim ng rung. Giáo trình, Trưng i hc Nông nghip 1, Hà Ni. 4 10TC 867: 2006. Vi sinh vt - Phương pháp ánh giá hot tính i kháng nm gây bnh vùng r cây trng cn. gười phản biện: Bùi Huy Hiền T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 6 . PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG NẤM Fusarium oxysporum GÂY BỆNH HÉO RŨ TRÊN MỘT SỐ CÂY TRỒNG CẠN Vũ Thuý Nga Summary Isolation and selection of Bacillus antagonistic. tính đối kháng nấm gây bệnh Fusarium oxysporum của các chủng vi khun Bacillus đối với một số cây trồng Kết quả đánh giá hoạt tính đối kháng của các chủng Bacillus đối với nấm Fusarium oxysporum. theo hướng phân lập tuyển chọn một số chủng Bacillus có khả năng ức chế loại nấm gây bệnh héo rũ cây trồng cạn Fusarium oxysporum, là loại ký sinh gây hại nghiêm trọng nhiều loại cây trồng,