1 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương 2 - 2009 - 3 Giới thiệu môn học Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương pháp phân lập, khảo sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công nghệ lên men . Các vi sinh ứng dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên, chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên. Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực vật hay thực phẩm. Phân lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng. Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối với sự phát triển của các loại vi sinh vật khác nhau. Số lượng vi sinh trong 1 g đất có tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt động sống của vi sinh vật đất có liên quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các vòng tuần hoàn của vật chất trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu huỳnh. Các bước chung của bài thực hành là 1. Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số nhóm phân loại 2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các đại diện thuộc vi sinh vật phân lập được. NỘI DUNG THỰC HÀNH BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE 4 BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA I. Lý thuyết Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có chứa nitơ tạo thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Tuy vậy, những vi sinh vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều. Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy phân thành các amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và đổng hóa. Các sản phẩm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH 3 và H 2 S. Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các loài trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae, các xạ khuẩn và nấm khuẩn ty. Trong đó, vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống Clostridium tham gia quá trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình amôn hóa được thực hiện bới các loài vi khuẩn và trực khuẩn kỵ khí tùy nghi. II. Thực hành Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng cách cấy các mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone. Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng Pasteur nhằm tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện thuộc giống Bacillus – giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa. Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính khác nhau của khuẩn lạc các vi khuẩn khác nhau này. 1. Môi trường - hóa chất Môi trường canh thịt- peptone: Cao thịt 5g Peptone 10g Nước 1000ml Môi trường thạch: Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch. 5 Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng. Giấy lọc loại thấm acetate chì Giấy quỳ đỏ Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm bào tử, Thuốc thử Nessler 2. Dụng cụ Các dụng cụ pha chế môi trường Các dụng cụ cấy, khử trùng Kinh hiển vi 3. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị môi trường: Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm, khử trùng ở 1 atm, 15 min. Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử trùng ở 0,5 atm. Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các đĩa petri, giữ ở 30 O C Chuẩn bị mẫu: Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù  Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng: Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10 5 – 10 10 Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-peptone đã khử trùng ở trên Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetatechì gài vào giữa nút bông và ống nghiệm Ủ ở nhiệt độ 28-30 O C trong 3 ngày đêm.  Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch: Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 10 2 – 10 5 Lấy 0,5ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử trùng ở trên Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch Ủ ở nhiệt độ 28-30 O C trong 3 ngày đêm. Mỗi môi trường tiến hành thêm 1 mẫu đối chứng 6 4. Quan sát và ghi nhận kết quả Đối với môi trường lỏng, quan sát: Sự đục môi trường Sự tạo bông, kết cạn Nổi váng trên bề mặt Phản ứng sinh hóa: Màu kết tủa với thuốc thử Nessler: Nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng, thêm một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa: Màu vàng nhạt – ít ammoniac Vàng sậm – nhiều ammoniac Nâu – rất nhiều ammoniac Sự sinh NH 3 làm giấy quỳ hóa xanh Sự sinh H 2 S làm giấy lọc thấm acetate chì hóa đen. So sánh đối chứng và thí nghiệm. Độ pha loãng Đục môi trường Tạo bông Tạo cặn Sinh NH 3 Sinh H 2 S Nhận xét mức độ, tỷ lệ xuất hiện cao nhất trong 1g mẫu Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi Trên môi trường thạch, ghi nhận: Số lượng khuẩn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng Số khuẩn lạc đặc trưng Quan sát hình thái khuẩn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng Độ pha loãng Số khuẩn lạc Số khuẩn lạc đặc trưng Hình thái khuẩn lạc Xuất hiện bào tử Khả năng di động Chọn một đĩa có nhiều khuẩn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản và soi kính hiển vi So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi trường thạch 7 BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA I. Lý thuyết Nitrat hóa là quá trình oxi hóa NH 3 thành HNO 3 , cung cấp năng lượng cho vi sinh vật hoạt động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO 2 . Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có khả năng thực hiện quá trình này. Nitrat hóa qua 2 giai đoạn: Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH 3 thành nitrit bởi một số đại diện thuộc nhóm vi khuẩn nitrit hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Tất cả chúng đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào. Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục. Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc một số điều kiện. Hai pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn keo-các tế bào không di động. Giai đoạn 2 của quá trình nitrat hóa oxi hóa nitrit thành nitrat bởi một số vi khuẩn: Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis. Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện không thuận lợi chúng có thể hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrospina gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn keo. Nitrococcus mobilis thì có dạng hình tròn, có tiên mao. Vi khuẩn nitrat hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với việc oxi hóa cơ chất-NH 3 và nitrit II. Thực hành Việc phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn nitrat hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch huyền phù cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong môi trường này là CO 2 có trong không khí và trong thành phần của CaCO 3 . Nguyên liệu năng lượng và nguồn N cho các vi khuẩn gây ra giai đoạn đầu của quá trình nitrat hóa là NH 3 và muối amon, còn đối với vi khuẩn gây ra giai đoạn hai là nitrit. Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuẩn nitrat hóa là việc thông khí đầy đủ vào môi trường nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn nitrat hóa được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn. 8 1. Môi trường- hóa chất Thành phần môi trường Winogradski: (NH4) 2 SO 4 2 g/l K 2 HPO4 1 g/l MgSO4 0,5 g/l FeSO4 0,4 g/l NaCl 2 g/l Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO 3 . Hấp khử trùng ở 1 atm Dung dịch pha loãng mẫu Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật Tinh thể diphenylamin H 2 SO 4 đậm đặc 2. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các ống nghiệm Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng: Pha loãng mẫu 10 2 - 10 5 Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường đả khử trùng ở trên Ủ ở 28-30 O C trong 2-3 tuần Làm 1 ống nghiệm đối chứng 3. Quan sát và ghi nhận kết quả: Ở mỗi độ pha loãng, ghi nhận sự thay đổi môi trường trong ống nghiệm Những ống nghiệm nào ghi nhận có vi khuẩn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm định tính. Phản ứng định tính nitrat: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan trong 1 giọt H 2 SO 4 đậm đặc. Sau đó thêm 1 giọt dịch cần kiểm tra. Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ thấy xuất hiện màu xanh thẩm. Ghi nhận kết quả vào bảng Ống nghiệm số Độ pha loãng 10 2 10 3 10 4 10 5 NO 2- NO 3- NO 2- NO 3- NO 2- NO 3- NO 2- NO 3- 9 Chọn ống nghiệm có kết quả dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi. Cần lưu ý chọn được cả những hạt CaCO 3 , vì xung quanh hạt này, tỷ lệ vi khuẩn là cao nhất. Miêu tả, so sánh hình thái các tế bào vi khuẩn quan sát được (hình dạng, khả năng di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn keo). Nhận xét loài nào chiếm ưu thế nhất. 10 BÀI 3. VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA I. Lý thuyết Phản nitrat hóa là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrat thành nitrogen phân tử, đồng thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu co thành CO 2 và H 2 O với chất nhận điện tử cuối cùng là NO 3 . Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong quá trình hoạt động sống của mình. Quá trình phản nitrat hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện kỵ khí. Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn chúng thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus … II. Thực hành Việc phát hiện vi khuẩn phản nitrat hóa và xác định số lượng của chúng được thực hiện bằng phương pháp cấy mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrat và các hợp chất khác cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Khi đó, đáng chú ý là một số vi khuẩn nitrat sử dụng nitrat như nguồn năng lượng chủ yếu hoặc duy nhất, tức dùng chúng làm chất nhận electron nhưng không dùng làm nguồn N trong trao đổi kiến tạo, vì không thể khử NH3 thành NH4 + . Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn phản nitrat hóa, người ta cho thêm peptone, asparagin hoặc muối amon và hạn chế lưu khí trong quá trình nuôi cấy. Số lượng vi khuẩn được xác định bằng phương pháp pha loãng tới hạn. 1. Môi trường- hóa chất Môi trường Giltay: Dung dịch A: Asparagine: 1g KNO 3 : 1g Nước máy: 0.25l Dung dịch B: KNO 3 : 8,5g K 2 HPO 4 : 1g MgSO 4 : 1g CaCl 2 : 0,2g [...]... loài Poliovirus Virus cúm gà H5N1 Virus HIV/AIDS Trong thực tế, số loài vi sinh vật phải tới hàng triệu loài Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc TT Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà Nội hợp tác với các nhà khoa học Nhật bản và dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử đã bước đầu phát hiện được khá nhiều loài vi sinh vật mới được thế giới công nhận 2-Các đặc điểm chung của vi sinh vật : Vi sinh vật... (1822-1895) Kính hiển vi của Leeuwenhoek Bút tích miêu tả vi sinh vật của Leeuwenhoek Robert Koch (18431910) Thí nghiệm bình cổ cong để phản đối thuyết tự sinh (Pasteur) Vi khuẩn lao chụp qua kính hiển vi Alexander Fleming (1881-1955) Elie Metchnikoff (1845-1916) Nấm Penicillium sản sinh penicillin Bài 2 Những đặc điểm chung của Vi Sinh Vật 1 -Vi sinh vật thuộc giới sinh vật nào? Vi sinh vật không phải... dạng tế bào sinh dưỡng và vi kén hoặc bào tử nấm mốc Khuẩn lạc loại Tế bào sinh dưỡng Vi kén Hình vẽ tế bào Hình vẽ vi kén (nếu có) Loại 1 Loại 2 17 Cùng bạn đọc Vi sinh vật (microorganisms) là những sinh vật nhỏ bé đến mức chỉ có thể thấy được chúng dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử Vi sinh vật gây ra rất nhiều bệnh hiểm nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm Tuy nhiên số vi sinh vật... củ cải, tôm, cá ) Sau vi c Leeuwenhoek phát hiện ra vi sinh vật và vi c Louis Pasteur phát hiện ra bản chất của các vi sinh vật- từ đó khai sinh ra ngành Vi sinh vật học (Microbiology)- thì nhân loại bắt đầu quan tâm rất nhiều đến lĩnh vực khoa học mới mẻ này Vi sinh vật học trở thành nền tảng cho sự phát triển của Công nghệ sinh học(CNSH) Người ta chia sự phát triển của CNSH ra thành 3 giai đoạn: *... triệu loài sinh vật có khoảng 200 000 loài vi sinh vật (100 000 loài động vật nguyên sinh và tảo, 90 000 loài nấm, 2500 loài vi khuẩn lam và 1500 loài vi khuẩn) Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật Virus là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể cho nên chưa được kể đến trong số 200 000 loài vi sinh vật nói trên Số virus đã... nhóm phân loại trong sinh giới mà là bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước hiển vi, không thấy rõ được bằng mắt thường, do đó phải sử dụng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi điện tử Ngoài ra muốn nghiên cứu vi sinh vật người ta phải sử dụng tới phương pháp nuôi cấy vô khuẩn Từ trước đến nay có rất nhiều hệ thống phân loại sinh vật Các đơn vị phân loại sinh vật nói chung và vi sinh vật nói riêng... (Saccharomyces cerevisiae) là 120 phút Với nhiều vi sinh vật khác còn dài hơn nữa, ví dụ với tảo Tiểu cầu ( Chlorella ) là 7 giờ, với vi khuẩn lam Nostoc là 23 giờ Có thể nói không có sinh vật nào có tốc độ sinh sôi nảy nở nhanh như vi sinh vật Nấm men Vi kuẩn Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Nấm sợi Alternaria Vi tảo Chlorella 4) Có năng lực thích ứng mạnh và dễ dàng phát sinh biến dị : Trong... bảng nói trên giáo vi n cần giải thích cho sinh vi n những kiến thức cơ bản thuộc giáo trình Tế bào học và Di truyền học Phần lớn vi sinh vật thuộc về ba nhóm Cổ khuẩn, Vi khuẩn và Nguyên sinh Trong giới Nấm, thì nấm men (yeast), nấm sợi (filamentous Fungi) và dạng sợi (mycelia) của mọi nấm lớn đều được coi là vi sinh vật Như vậy là vi sinh vật không có mặt trong hai giới Động vật và Thực vật Người ta... hiển vi vật kính 40X đề kiểm tra hình thái vi khuẩn: kích thước lớn, thường ứng thành đôi và có bao nhầy Ghi nhận các đặc điểm này vào bảng Hình dạng tế bào Bào tử Kích Sự sắp Bao Hình thước xếp tế nhầy vẽ tế bào bào Loại 1 Loại 2 BÀI 5 :VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE 14 I Lý thuyết Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật Vi c tổng hợp cellulose có quy mô phức tạp hơn hẳn vi c... nay đã đạt đến 150g/ml dịch lên men (VEDAN -Vi t Nam) Nhà máy Vedan -Vi t Nam 5) Phân bố rộng, chủng loại nhiều : Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật Vi sinh vật tham gia tích cực vào vi c thực hiện các vòng tuần hoàn sinh- địahoá học (biogeochemical cycles) như . thuộc vi sinh vật phân lập được. NỘI DUNG THỰC HÀNH BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA BÀI 2: VI KHUẨN NITRAT HÓA BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRAT HÓA BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ BÀI 5: VI SINH VẬT. chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng. Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh vi n phân lập vi sinh vật chủ yếu từ môi trường đất. Đất là một trong. NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH VI SINH ỨNG DỤNG Biên soạn: TS. Nguyễn Hoài Hương 2 - 2009 - 3 Giới thiệu môn học Môn thực hành vi sinh ứng dụng