BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Đức Trung Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống/dòng chè (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) ở Việt Nam bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học: TS. Lã Tuấn Nghĩa Hà Nội- 2009 Dànhtặngnhữngngườitôithươngyêunhất; …bốmẹ… …vợ… …giađình… …vàbéTrầnĐứcHoàngMinh…. viii   Lờicảmơn Trước hết, tôi xin gửi lời cảmơn chân thành và sâu sắc tới  TS. Lã Tuấn Nghĩa, ngườiđãtậntìnhhướngdẫn,giúpđỡvàhỗtrợtôi trongsuốtquátrìnhcôngtáccũ ngnhưtrongthờigianhọctập,nghiêncứu vàhoànthànhluậnvănnày. TôixinbàytỏlòngbiếtơntớicácthầycôvàcánbộcôngtáctạiViện CôngnghệSinhhọcthực phẩm,Việnđàotạosauđạihọc‐TrườngĐạihọc BáchkhoaHàNộiđãdạydỗvàtạomọiđiềukiệnthuậnlợi chotôitrongsuốt quátrìnhhọctậptạ itrường. Nhândịpnày,tôicũngxingửilờicảmơnchânthànhtớicáccánbộ công tác tại Viện Khoa học kỹ thu ật Nông‐Lâm nghiệp miền núi phía Bắc (NOMAFSI)đãnhiệt tìnhgiúpđỡtôitrongthờigianthuthậpsốliệuvàvật liệunghiêncứutạiViện. Tôixinchânthànhcảmơncáccánbộ,anhchịemtrongNhómnghiên cứuĐad ạngditruyền vàCôngnghệsinhhọcNôngnghiệp,ViệnDitruyền Nôngnghiệp,đãgiúpđỡvàđộngviêntôitrong quátrìnhcôngtácvànghiên cứukhoahọcvừaqua. Cuốicùng,tôixinchânthànhcảmơngiađìnhvà bạnbèđãnhiệttình độngviên,giúpđỡtôitrongquátrìnhhọctập,nghiêncứukhoahọccũng nhưtrongcuộcsống. LuậnvănnàyđượcthựchiệnvớinguồnkinhphítừCh ươngtrìnhCông nghệsinhhọcNôngnghiệp. Xinchânthànhcảmơn! HàNội,tháng10năm2009   TrầnĐứcTrung i  Lờicamđoan  Tôixincamđoanđãtrựctiếpthựchiệncácnghiêncứutrongluậnvăn này.Mọikếtquảthuđượcnguyên bản,khôngchỉnhsửahoặcsaochéptừcác nghiêncứukhác;cácsốli ệu,sơđồkếtquảcủaluận vănnàych ưatừngđược côngbố. Mọidữliệu,hìnhảnh,biểuđồvàtríchdẫnthamkhảotrongluậnvăn đềuđược thuthậpvàsửdụng từnguồndữliệumởhoặcvớisựđồngýcủa tácgiả.Cácphầnm ềmphântíchTotalLabv2009,QuantityOne,NYSYSpc 2.11X, TreeCon, POPGENE32, Dendroscopes, PHYLIP v3.69đều có bản quyềnhoặcsửdụngvới sựđồngýcủa(nhóm)tácgiảxâydựngphầnmềm. Tôixinhoàntoànchịutráchnhiệmvớinhữnglờicamđoantrên!  TrầnĐứcTrung ii  Mục lục Trang Lời cam đoan i Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục bảng v Danh mục hình ảnh minh họa vi Mở đầu 1 Chương 1: Tổng quan 4 1.1. Khái quát chung về cây chè Camellia sinensis (L.) O. Kuntze 4 1.1.1. Lược sử ngành sản xuất- chế biến chè trên thế giới và Việt Nam 4 1.1.2. Nguồn gốc và phân bố của cây chè 5 1.1.3. Phân loại thực vật và đặc điểm hình thái của cây chè 8 1.1.4. Đặc điểm di truyền của cây chè Camellia sinensis (L.) O. Kuntze 14 1.1.5. Ngành sản xuất, chế biến chè trên thế giới và Việt Nam 17 1.1.6. Công tác lai tạo giống chè 19 1.1.6.1. Phương pháp truyền thống 19 1.1.6.2. Áp dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống chè 21 1.2. Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền 22 1.2.1. Chỉ thị hình thái 23 1.2.2. Chỉ thị hóa sinh 24 1.2.3. Chỉ thị DNA 25 1.2.3.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA- chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 29 1.2.3.2. Chỉ thị DNA ngẫu nhiên 30 1.2.3.3. Chỉ thị DNA dựa trên đa hình các vị trí nhận biết giới hạn 31 1.2.3.4. Chỉ thị DNA dựa trên các trình tự lặp 33 1.2.3.5. Chỉ thị DNA dựa trên trình tự DNA 41 1.2.3.6. Một số loại chỉ thị DNA khác 42 1.3. Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền chè (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) 43 iii  1.3.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hình thái 43 1.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hóa sinh 44 1.3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị DNA 45 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 50 2.1. Vật liệu nghiên cứu 50 2.2. Phương pháp nghiên cứu 55 2.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái chè 55 2.1.2. Thu thập mẫu lá chè 55 2.1.3. Trích ly DNA tổng số từ mẫu lá chè 57 2.1.4. Nhận d ạng di truyền các giống chè bằng chỉ thị SSR 58 2.1.5. Phân tích kết quả 60 2.1.5.1. Phân tích số liệu kiểu hình 60 2.1.5.2. Phân tích số liệu kiểu gen 61 2.1.5.3. Phân loại thứ chè theo tỷ lệ nguồn gen 63 Chương 3: Kết quả và bàn luận 64 3.1. Phân tích đa dạng di truyền chè dựa trên đặc điểm hình thái 64 3.1.1. Đánh giá đặc điểm hình thái 64 3.1.2. Phân tích đa dạng di truyền dựa trên đặc điểm hình thái của các giống/dòng chè 67 3.2. Phân tích đa dạng di truy ền chè bằng chỉ thị SSR 73 3.2.1. Trích ly DNA tổng số 73 3.2.2. Nhận dạng di truyền chè bằng chỉ thị SSR 75 3.2.3. Phân tích tính đa dạng di truyền của các locus SSR 81 3.2.4. Phân tích đa dạng di truyền giữa 9 quần thể chè bằng chỉ thị SSR 84 3.2.5. Phân tích đa dạng di truyền 96 giống/dòng chè bằng chỉ thị SSR 91 3.2.5.1. Phân nhóm di truyền dựa trên mức độ tương đồng Jaccard 92 3.2.5.2. Phân nhóm di truyền dựa trên khoảng cách di truyền Nei72 98 3.3. Kết hợ p chỉ thị hình thái và chỉ thị SSR trong phân tích đa dạng di truyền các giống/dòng chè 106 Kết luận và kiến nghị 109 Tài liệu tham khảo 111 Phụ lục 122 iv  Bảng chữ viết tắt AFLP Amplification Fragment Length Polymorphism APS Amonium persulfate CAPs Cleaved Amplification Polymorphism Sequence cs Cộng sự CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EST Expressed sequence tag EthBr Ethidium bromide IPGRI International Plant Genetic Resource Institute ISSR Inter-simple sequence repeat MAS Molecular Assisted Selection PCA Principles Component Analysis PCR Polymerase Chain Reaction PIC Polymorphism Information Content RAPD Random Aplification Polymorhism DNA RFLP Restriction Fragment length Polymorphism SSR Simple sequence repeat STS Sequence- tagged site TAE Tris-Acetic acid- EDTA TEMED N,N,N’,N’- Tetraethyl methylendiamine v  Danh mục bảng Trang Bảng 1.1: So sánh đánh giá đặc điểm của một số loại chỉ thị được ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 28 Bảng 1.2: So sánh ưu/nhược điểm của các phương pháp phân lập và phát triển chỉ thị SSR 40 Bảng 2.1: Danh sách 96 giống/dòng chè thu thập từ NOMAFSI 50 Bảng 2.2: 9 quần thể chè nghiên cứu 52 Bảng 2.3: Danh sách các cặp mồi SSR sử dụ ng trong nghiên cứu 53 Bảng 2.4: 12 đặc điểm hình thái được sử dụng để đánh giá các giống/dòng chè 56 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng SSR-PCR 59 Bảng 2.6: Thành phần gel polyacrylamide 12% 60 Bảng 3.1: Giá trị đặc trưng của 90 thành phần trong phân tích PCA (khoảng cách di truyền Euclidean của 90 giống/dòng chè) 71 Bảng 3.2: Tần số alen của 21 locus SSR 82 Bảng 3.3: Thống kê các chỉ số đa dạng di truyền của 21 locus SSR 83 Bảng 3.4: Kết quả đánh giá đa dạng di truyền giữa 9 quần thể chè 85 Bảng 3.5: Khoảng cách di truyền giữa 9 quần thể chè nghiên cứu 87 Bảng 3.6: Giá trị đặc trưng của 96 thành phần trong phân tích PCA (khoảng cách di truyền Nei72 của 96 giống/dòng chè) 102 vi  Danh mục hình ảnh minh họa Trang Hình 1.1: Các nước trồng chè dựa vào sản lượng được thống kê năm 2007 7 Hình 1.2: Phân bố tự nhiên các thứ chè theo Stuart (A) và Barua (B) 10 Hình 1.3: Cây chè Trung Quốc (C.sinensis var. sinnensis) 12 Hình 1.4: Cây chè Assam (C. sinensis var. assamica) 13 Hình 1.5: Cây chè Cambod (C. sinensis var. assamica sub sp. lasiocalyx) 13 Hình 1.6: Tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của cây chè (C. sinensis var. sinensis) 15 Hình 1.7: Kích thước biến thiên của lá chè 16 Hình 1.8: Biểu đồ sản lượng chè khô của một số nước nă m 2005, 2006 và 2007 18 Hình 1.9: Biểu đồ khối lượng sản xuất và xuất khẩu chè khô của một số nước năm 2007 18 Hình 1.10: Nguyên lý phản ứng PCR 26 Hình 1.11: Nguyên lý kỹ thuật kỹ thuật AFLP 32 Hình 1.12: Phân loại trình tự lặp SSR 35 Hình 1.13: Đa hình DNA SSR giữa hai cá thể có motif (AT) n 37 Hình 1.14: Quy trình phát triển chỉ thị SSR từ thư viện hệ gen 39 Hình 2.1: Phân loại chè Cambod dựa trên tỷ lệ nguồn gen 63 Hình 3.1: Màu sắc lá chè non 65 Hình 3.2: Búp chè non 65 Hình 3.3: Thế lá chè 66 Hình 3.4: Cây chè dạng thân gỗ 66 Hình 3.5: Cây chè dạng thân bụi 67 Hình 3.6: Sơ đồ cây phân nhóm 90 giống/dòng chè dựa trên đặc điểm hình thái bằng phương pháp UPGMA 69 Hình 3.7: Phân tích PCA 90 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè dựa trên ma trận khoảng cách di truyền Euclidean (đặc điểm hình thái) 72 vii  Hình 3.8: Kết quả trích ly DNA tổng số chè (dựa trên quy trình Porebski) 74 Hình 3.9: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho mồi CamsinM6 (SSR-6) 75 Hình 3.10: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho mồi MSCjaH46 (SSR-17) và MSCjaF37 (SSR-20) 76 Hình 3.11: Kết quả nhận dạng di truyền 96 giống/dòng chè bằng chỉ thị SSR CamsinM1và CamsinM4 77 Hình 3.12: Kết quả nhận dạng di truyền 96 giống/dòng chè bằ ng chỉ thị SSR CamsinM8 và CamsinM13 78 Hình 3.13: Kết quả phản ứng PCR của 96 giống/dòng chè với 21 cặp mồi SSR 80 Hình 3.14: Sơ đồ phân nhóm di truyền 9 quần thể chè dựa trên khoảng cách di truyền Nei72 88 Hình 3.15: Phân tích PCA biểu diễn quan hệ nhóm của 9 quần thể chè trong không gian ba chiều 88 Hình 3.16: Sơ đồ cây phân loại 96 giống/dòng chè bằng phương pháp UPGMA 94 Hình 3.17: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè dựa trên mức độ tương đồng di truyền Jaccard 97 Hình 3.18: Sơ đồ cây phân nhóm 96 giống/dòng chè bằng phương pháp Weighted- Neighbor Joining 99 Hình 3.19: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè dựa trên khoảng cách di truyền Nei72 103 Hình 3.20: Cây phân nhóm 96 giống/dòng chè dựa trên khoảng cách di truyền Nei72 (xây dựng bằng phần mềm PHYLIP 3.69 và Dendroscopes) 105 [...]... chính, đánh giá đặc điểm hình thái của các giống/ dòng chè thuộc các quần thể chè được b o tồn ở vườn quỹ gen chèViện Khoa học Kỹ thuật Nông-Lâm nghiệp miền núi phía Bắc (NOMAFSI) 2 Nhận dạng di truyền các giống/ dòng chè bằng chỉ thị phân tử 3 Phân tính đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống/ dòng chè SSR dựa trên kết quả đánh giá hình thái 4 Phân tích đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể chè; ... năng đánh giá mức độ đa dạng di truyền khác nhau Trong đó, chỉ thị hình thái được sử dụng sớm nhất và là cơ sở ban đầu trong đánh giá phân loại sinh vật, còn chỉ thị hóa sinh và đặc biệt chỉ thị DNA hiện nay được sử dụng rộng rãi nhất không chỉ trong đánh giá đa dạng di truyền mà còn là công cụ hữu hiệu hỗ trợ công tác chọn t o giống 1.2.1 Chỉ thị hình thái Trước đây, sự đa dạng giữa các cá thể trong... (L .) O Kuntze) ở Việt Nam bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR) với mong muốn có Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội 3  Luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học  được cái nhìn tổng quan về sự đa dạng di truyền của các giống/ dòng chè ở Việt Nam Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau: 1 Dựa trên một số chỉ. .. di n từng các thể và đánh giá được sự đa dạng trong quần thể nghiên cứu So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị hóa sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein là sản phẩm của một gen, do đó sự đa hình các protein cũng phản ánh gián tiếp sự đa hình trong kiểu gen của sinh vật Tuy nhiên, đối với các cá thể có quan hệ di truyền gần gũi (đặc biệt là giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen (protein,... pháp truyền thống, công nghệ sinh học đã hỗ trợ hoặc thay thế một số công o n trong chiến lược chọn t o giống, phổ biến nhất là hai mảng công nghệ chỉ thị phân tử và nuôi cấy mô phôi tế b o [46, 47]: • Áp dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền các giống chè, hỗ trợ chọn lựa cặp lai phù hợp; nhận dạng di truyền các giống chè và đặc biệt đóng vai trò quan trọng trong chọn giống phân tử. .. và giữa các quần thể được xác định thông qua đánh giá các đặc điểm hình thái nổi trội (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận ) Với ưu điểm như dễ dàng tiếp cận và nghiên cứu, không đòi hỏi thiết bị đặc biệt cũng như quy trình thực hiện phức tạp, chỉ thị hình thái được sử dụng khá rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật Trong đánh giá và chọn t o giống truyền thống, chỉ thị hình thái. .. để đánh giá tính đa dạng di truyền giữa các cá thể, nhất là khi không phải toàn bộ các gen đều thể hiện ra kiểu hình có thể o đếm được Hiện nay, tuy có nhiều nhược điểm và trong bối cảnh chỉ thị DNA được sử dụng phổ biến hơn, nhưng chỉ thị hình thái vẫn được áp dụng khá hiệu quả trong đánh giá đa dạng di truyền (đặc biệt đối với các đối tượng mà chỉ thị phân tử chưa có nhiều) hoặc trong nghiên cứu. .. sinh thái, là sự đa dạng giữa các loài trong quần xã hay sự đa dạng ở cấp độ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài Mặc dù là cấp độ thấp nhất, nhưng đa dạng di truyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hóa và thích nghi của các sinh vật; mọi biến động ở cấp độ đa dạng di truyền đều có những tác động đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa dạng sinh học [61] Đa dạng di. .. chế biến các loại chè làm đồ uống Do có quá trình phân tán lâu dài giữa các vùng địa lý khác nhau cùng với những tác động của con người (lai t o, chọn lọc) nên cây chè có sự đa dạng cả về hình thái và đặc điểm di truyền Vì vậy mà hệ thống phân loại các giống chè còn nhiều điểm chưa được thống nhất Các giống chè ở Việt Nam được kh o sát và phân loại từ khá sớm (những năm 30 của thế kỷ 2 0) Theo Nguyễn... đời và được biết đến là loại chỉ thị mới -chỉ thị DNA thế hệ đầu tiên- với những ưu điểm vượt trội so với những chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh đang được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền lúc đó (Botstein, 198 0) Tuy nhiên mốc đánh dấu quan trọng nhất của công nghệ chỉ thị phân tử nói riêng và sinh học phân tử nói chung chính là phát minh phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chains Reaction- . GI O DỤC VÀ Đ O T O TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Đức Trung Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống/dòng chè (Camellia sinensis (L .) O. Kuntze) ở Việt Nam bằng. số loại chỉ thị DNA khác 42 1.3. Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền chè (Camellia sinensis (L .) O. Kuntze) 43 iii  1.3.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hình thái. 43 1.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hóa sinh 44 1.3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị DNA 45 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 50 2.1. Vật liệu nghiên cứu