Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin Mở đầu Ngay từ xuất sống, đấu tranh lồi sinh vật bệnh tật xuất Đặc biệt ký sinh loài vi sinh vật tới động vật bậc cao gây bệnh tật hiểm nghèo tạo nạn dịch thảm khốc cướp nhiều sinh mạng Để giành giật sống người tìm biện pháp nhằm hạn chế tác động có hại đối tượng gây bệnh Vacxin coi tiến y học quan trọng kỷ XX Ngày với phát triển không ngừng công nghệ sinh học người tìm vũ khí hữu hiệu để bảo vệ với số lượng nhiều, an tồn nhanh chóng Để hiểu rõ vấn đề này, chúng em tiến hành tìm hiểu đề tài: “Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin” II Nội dung Lịch sử vacxin Antoni van Leeuwenhock phát minh kính hiển vi nhìn thấy vi khuẩn vào năm 1684 Hơn 100 năm sau Edward Jenner người trở thành phương pháp chủng đậu để phòng ngừa bệnh đậu mùa Trong giai đoạn từ 1857 đến 1885 Louis Pasteur trở thành “Ông tổ” ngành Vi sinh vật người chế tạo vacxin phịng bệnh than bệnh dại I Hình: Edward Jenner Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin Năm Mầm bệnh 1863 Vi khuẩn than L.Pasteur 1873 Vi khuẩn hủi (phong) H.Hansen Vi khuẩn sốt hồi quy O.Obermeier 1878 Vi khuẩn tụ cầu L.Pasteur 1879 Vi khuẩn lậu A.Neisser 1880 Vi khuẩn thương hàn K.Eberth G.Gaffky 1882 Vi khuẩn lao R.Koch 1883 Vi khuẩn tả R.Koch Vi khuẩn liên cầu T.Bilroth , L.Pasteur 1884 Vi khuẩn bạch hầu, uốn ván E.Klebs, F.Loffler,A.Nicolaev 1885 Vi khuẩn E.coli T.Escherichi 1886 Vi khuẩn Bruccela D.Bruce,B.Bang, G.Traum 1887 Vi khuẩn não mô cầu A.Weichselbaum 1891 Vi khuẩn lỵ K.Shiga 1894 Vi khuẩn dịch hạch A.Yersin Vi khuẩn gây ngộ độc thịt E.Van Ermengen Virut sốt vàng W.Reed Vi khuẩn giang mai E.Schaudina, E.Holiman Vi khuẩn ho gà Bordet-Gengou Virut gây ung thư Ellerman-Bang 1896 1901 1905 1906 1908 1909 1911 1933 1934 1938 1940 1953 Người phát Virut bại liệt Virut Thủy đậu Aragao-E.Paschen Virut cúm U.Smith-H.ADNewes Virut quai bị virut viêm C.Johnson-E.Goodpasture não Nhật Bản Virut sởi H.Plotz Virut sốt xuất huyết Dengue A.Smorodissev-A.Chumacov 1964 Virut Adeno W.Row 1967 Virut viêm gan B Blumberg 1969 Marburg Fill 1970 Lazza 1973 Dengue 1976 Virut viêm gan A 1977 Virut Ebola 1983 Virut viêm gan D Rizzetto 1989 Virut HIV Montag 1990 Virut Viêm gan C nier 1884 Virut viêm gan E Choo Virut viêm gan G Reyes Frinston Simons Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin Khái niệm vắc-xin 2.1 Định nghĩa vacxin: Vắc-xin chế phẩm có tính kháng ngun dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng thể (số) tác nhân gây bệnh cụ thể Các nghiên cứu mở hướng dùng vắc-xin để điều trị số bệnh (vắc-xin liệu pháp, hướng miễn dịch liệu pháp) Thuật ngữ vắc-xin xuất phát từ vaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò đem chủng cho người lại giúp ngừa bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa "con bò cái") Việc dùng vắc-xin để phòng bệnh gọi chung chủng ngừa hay tiêm phịng tiêm chủng, vắcxin khơng cấy (chủng), tiêm mà cịn đưa vào thể qua đường miệng II.2 Sự phát triển vacxin Vacxin học (Vacxinology) mở đầu thành công vào cuối kỷ 18 bác sĩ thú y E.Jenner (Anh) với vacxin làm từ chủng gây bệnh đậu bò, tiêm cho cậu bé 13 tuổi J.Philip Hiện nay, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) công nhận tiêm vacxin phương cách bảo vệ hiệu quả, giúp nhân loại tránh bệnh truyền nhiễm Từ 1880, Louis Pasteur (Pháp) sáng chế thành công vacxin chống bệnh Than nhiều loại Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin vacxin khác ý tưởng Jenner, tạo trường phái riêng tồn ngày Sang nửa kỷ 20, cơng nghệ vacxin có bước tiến vượt bậc đạt nhiều thành tích đáng kể, nảy sinh nhiều thách thức, nhiều bệnh dịch nguy hiểm tái phát xuất Tình trạng miễn dịch mà thể có sau sử dụng vacxin kết đáp ứng miễn dịch thành phần kháng nguyên có vacxin Tùy loại vacxin, hiệu lực bảo vệ miễn dịch dịch thể, miễn dịch qua trung gian tế bào phối hợp hai loại Ngoài miễn dịch đặc hiệu, vacxin cịn có khả tăng cường miễn dịch không đặc hiệu làm tăng trình thực bào nhờ kháng thể đóng vai trị yếu tố opsonin đặc hiệu nhờ lymphokin hoạt hóa đại thực bào… PHÂN LOẠI VACXIN 3.1 Vacxin giải độc tố Loại vacxin sản xuất từ ngoại độc tố vi khuẩn làm tính độc giữ tính kháng nguyên Vacxin giải độc tố kích thích thể sản xuất kháng độc tố, loại kháng thể có khả trung hòa ngoại độc tố Vacxin nhằm phòng chống bệnh nhiễm trung vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ngoại độc tố 3.2 Vacxin chết toàn thể kháng nguyên tinh chế Loại vacxin sản xuất từ vi sinh vật gây bệnh Sau vi sinh vật bị giết chết lấy tồn huyền dịch làm vacxin (vacxin toàn thể), tinh chế lấy thành phần kháng nguyên quan trọng, “kháng nguyên bảo vệ” (protective antigens) Các kháng nguyên chủ yếu kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể Các kháng thể hình thành trực tiếp giết chết vi sinh vật, ngăn cản bám dính chúng vào tế bào thể vật chủ, làm tăng khả thực bào…, phối hợp chế Thí dụ: vắc-xin chống cúm, tả, dịch hạch viêm gan siêu vi A 3.3 Vacxin sống giảm độc lực Loại vacxin sản xuất từ vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật giống vi sinh vật gây bệnh cấu trúc kháng nguyên, làm giảm độc lực khơng cịn khả gây bệnh Vacxin sống tạo thể Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin q trình nhiễm khuẩn tự nhiên, kích thích thể đáp ứng miễn dịch toàn thể miễn dịch chỗ, miễn dịch dịch thể miễn dịch qua trung gian tế bào Ví dụ: Các vắc-xin ngừa bệnh sốt vàng, sởi, bệnh ban đào quai bị Tuy nhiên điều phải quan tâm đặc biệt tính an tồn vacxin sống, phải đảm bảo khơng khả gây bệnh gây bệnh nhẹ, vi sinh vật phải có tính di truyền ổn định không trở lại độc lực ban đầu 3.4 Vaccine đơn vị hay vaccin thành phần Là loại vacxin khơng dùng tồn tế bào vi khuẩn hay tồn virus mà dùng thành phần có tính kháng nguyên chúng 3.5 Vaccine kháng kháng thể idityp Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin Là kháng thể tạo từ cách dùng kháng thể kháng kháng nguyên làm kháng nguyên dể làm vắc xin cho tác nhân gây bệnh CƠNG NGHÊ MỚI TRONG SẢN XUẤT VACXIN 4.1) Vacxin sống Một vài vacxin sống đáp ứng tiêu chuẩn cho vacxin lý tưởng Đó là: Có khả tạo bảo vệ suốt đời với phản ứng tối thiểu gần toàn thể người nhận hai liều vacxin Những vacxin loại chứa vi sinh vật thường virut; chúng gây nhiễm tế bào nhân lên túc chủ, giống nhân lên vi sinh vật hoang dại gây nhiễm khuẩn tự nhiên Như vậy, vi sinh vật có vacxin gây đáp ứng miễn dịch thể giống đáp ứng với vi sinh vật hoang dại Vacxin sống giảm độc lực, tức khả gây bệnh vi sinh vật loại bỏ thủ thuật sinh học hay kỹ thuật Các vacxin sống thường tạo hai loại miễn dịch, miễn dịch dịch thể (kháng thể) miễn dịch tế bào (tế bào Limpho T) Vacxin sống gồm có loại sau: 4.1.1/ Vacxin cổ điển Thuật ngữ “cổ điển” đề cập tới chiến lược vacxin không dùng tới công nghệ rADN Chiến lược vacxin cổ điển làm giảm độc lực nuôi tế bào trở nên thực thập kỷ 40 50 với nuôi tế bào đại invitro (trong phịng thí nghiệm) khả ni virut ni tế bào đó, tạo vacxin uống poliovirut, vacxin tiêm sởi, quai bị, thuỷ đậu, rubella Một cách chế tạo vacxin cổ điển thứ hai phân lập nuôi virut động vật, gây bệnh động vật tương tự bệnh người Virut động vật tạo miễn dịch người khơng gây bệnh cho người Đó trường hợp Jenner dùng virut Vacxina (đậu bò) để làm vacxin phòng bệnh đậu mùa người (Variola virut) 200 năm trước Chính vacxin dẫn đến việc toán bệnh đậu mùa phạm vi toàn giới vào thập kỷ 70, bệnh tốn vacxin Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin 4.1.2/ Vacxin tái tổ hợp Có hướng cơng nghệ rADN ứng dụng để phát triển vacxin virut sống mới: Ứng dụng thứ tạo biến đổi đặc hiệu xố bỏ gen virut, điều làm cho virut giảm độc lực cách vững bền Như vậy, chúng khơng cịn có khả quay trở lại độc lực Đây hướng tạo vacxin H5N1 Viện Vệ sinh dịch tễ TƯ (Hà Nội) Ứng dụng thứ hai công nghệ ADN cho việc phát triển vacxin sống làm cho virut trở thành vecto Polypeptit “ngoại lai” hay Epitop peptit từ tác nhân gây bệnh khác người Mục đích tạo vecto để giới thiệu Polypeptit hay peptit ngoại lai cho hệ thống miễn dịch, khuôn khổ virut sống, cho hệ thống miễn dịch đáp ứng với Polypeptit ngoại lai kháng nguyên miễn dịch “sống” Như Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin phát triển miễn dịch rộng rãi (dịch thể, tế bào hay hai) Là phần virut sống, Polypeptit ngoại lai biểu thị bên bào tương tế bào bị nhiễm, làm gẫy thành đoạn peptit, chuyển vận tới bề mặt tế bào Từ đó, chúng kích thích đáp ứng tế bào Limpho T độc với tế bào Vector virut mẫu thường dùng rộng rãi việc tạo vacxin sống virut đậu mùa Để làm cho virut trở thành vecto, phải tạo plasmid có chứa gen cho polypeptit ngoại lai, với trình tự nối tiếp hướng biểu thị vào tế bào, kết hợp gọi “một cát xét biểu thị” Virut Vaccinia cát xét biểu thị đưa vào ni tế bào, tế bào tiếp nhận hai lúc vào bào tương Ở xảy q trình tái tổ hợp, sản xuất virut Vaccinia tái tổ hợp biểu thị Polypeptit ngoại lai Hình : Sản xuất vacxin ADN 4.2 Vacxin bất hoạt So với vacxin sống vacxin bất hoạt dễ sản xuất Theo định nghĩa, vacxin bất hoạt nhân lên lan tỏa để gây bệnh Nói chung, chúng dung nạp tốt hơn, đặc biệt Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin phần lớn vacxin bất hoạt qua xử lý tinh khiết để loại bỏ đại phân tử khác Ngoài ra, cơng nghệ phát triển nay, dễ thực việc sản xuất vacxin bất hoạt Khả tạo miễn dịch vacxin bất hoạt thường nâng cao nhờ thêm tá dược Tá dược cấp giấy phép dùng cho người muối nhôm hydroxit hay photphat, dùng tiêm cho tỷ người toàn cầu Kháng nguyên vacxin gắn cách vững bền vào muối nhôm nhờ tác động tương hỗ iôn làm thành hỗn dịch Các vacxin chết thường có chức kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể, khởi động cho miễn dịch tế bào 4.2.1 Vacxin bất hoạt nguyên tế bào Sản xuất vacxin bất hoạt nguyên tế bào vi khuẩn hay tồn hạt nhỏ virut, với mục đích kích thích việc hình thành kháng thể nhiều kháng ngun; vài vacxin cịn có tác dụng trung hoà tác nhân gây bệnh.Trong trường hợp vacxin viêm gan A chẳng hạn, tế bào bị nhiễm virut viêm gan A làm dung giải hạt virut tinh khiết phương pháp sinh hoá học, bất hoạt Formalin, sau hấp phụ vào muối nhôm.Chiến lược cổ điển dẫn đến việc sản xuất vacxin có hiệu lực, đến cịn cơng nghệ lựa chọn cho nhiều vacxin virut 10 Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin 4.2.2 Vacxin bất hoạt protein Đối với nhiều tác nhân gây bệnh việc phát triển vacxin dựa Protein chiến lược lựa chọn Phương pháp chế tạo vacxin dựa Protein kỹ thuật miễn dịch, di truyền sinh hố học xác định tính đặc hiệu kháng ngun Kỹ thuật nói cho phép biểu vị bảo vệ Polypeptit xác định đặc hiệu Vacxin viêm gan B làm từ nguồn huyết tương người vacxin thể loại Protein bề mặt virut viêm gan B (HBsAg), xác định Lipoprotein, kháng nguyên có biểu vị bảo vệ bề mặt HBsAg lấy từ huyết tương người mang virut viêm gan B mãn tinh khiết bất hoạt để làm vacxin Vacxin viêm gan B tái tổ hợp ứng dụng công nghệ rADN cho việc sản xuất vacxin dùng cho người PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VẮC-XIN: 5.1 Sản xuất vắc-xin theo phương pháp truyền thống (vắc-xin hệ thứ nhất): 5.1.1 Nguyên tắc chung: - Tạo sinh khối: Đây giai đoạn để sản xuất vắc-xin Vi sing vật ni cấy mơi trường thích hợp để đạt số lượng lớn sinh khối sản phẩm chúng (toxoid, antigen) Các chủng vi sinh vật trước nuôi cấy cần phải kiểm tra độ tinh khiết, không lẫn vi sinh vật lạ Q trình ni cấy thực nồi ni cấy đặc biệt, có thiết bị kiẻm sốt đến q trình tăng trưởng vi sinh vật - Làm bất hoạt: Yêu cầu sản xuất văc-xin phải an tồn cho người sử dụng Do vi khuẩn sử dụng để chế tạo văc-xin phải khơng cịn khả gây bệnh giữ tính kháng ngun, nghĩa có khả kích thích hệ thống miễn dịch thể Đối với văc-xin vi khuẩn chết: dùng tác nhân diệt khuẩn hóa chất (formalin, alcool, aceton), tia cực tím, siêu âm… Đối với vacxin từ vi khuẩn sống giảm độc: dùng phương pháp cấy chuyền vi khuẩn nhiều lần mơi trường ni cấy Ví dụ vacxin BCG (Bacille Calmette Guerin) vacxin chế tạo từ vi khuẩn lao bò cấy chuyền 11 Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin thời gian dài môi trường nuôi cấy - Sản xuất chế phẩm: Sau làm bất hoạt, tiếp tục tinh khết hóa đơng khơ để tạo sản phẩm, cuối đóng gói Tuỳ theo loại chế phẩm đóng gói dạng thuốc lỏng để uống, dạng thuốc viên, dạng thuốc tiêm - Kiểm tra sản phẩm Cần phải kiểm tra: Độ vô trùng: chế phẩm vacxin không lẫn vi sinh vật lạ Đảm bảo đủ nồng độ Kiểm tra khả gây miễn dịch 5.2 Qui trình sản xuất vacxin tái tổ hợp Quy trình tiến hành tái tổ hợp sau: Bước 1: Tiến hành xen đoạn thứ cấp gen virus vào plasmid vi khuẩn có mang gen kháng lại kháng sinh Bước 2: Tạo tổ hợp gồm ADN khảm có chứa đoạn khởi động (promoter) mạnh gắn với gen kháng nguyên đuôi poliA Sau xen vào vùng cắt hạn chế virus Bước 3: đưa (biến nạp) đồng thời plasmide virus vào tế bào chủ nhân chuẩn Tại virus ADN plasmide hợp tạo virus tái tổ hợp Bằng phương pháp tạo vacxin tái tổ hợp virus sống, người ta tạo vacxin đậu mùa tái tổ hợp cho người vật nuôi, tạo vacxin adenovirus tái tổ hợp chống số bệnh hô hấp dạng viên nhộng để uống 5.1.2 Các vacxin cổ điển sản xuất: 5.1.2.1 Vacxin vi khuẩn thương hàn: Nhân giống: Nuôi vi khuẩn thương hàn mơi trường thạch 18 h sau dùng NaCl đẳng trương để lấy vi khuẩn điều chỉnh để đạt độ đậm đặc 5.108 vi khuẩn/1ml Cấy vi khuẩn vào mơi trường cho thể tích ban đầu vi khuẩn chiếm 5% thể tích mơi trường Ni cấy: Mơi trường lỏng casein chưa 300-400 mg N tồn phần, 200250mg% N amin, 0,1-0,6% pepton Cấy chìm mơi trường ni cấy liên tục có hệ thống khuấy vân tốc 180-300v/ phút để tăng oxy cho thống, hệ thống lọc khí vơ trùng với lưu lượng 1lit/1phút Ni 10-12 để đạt nồng độ khoảng 6.1010 vi khuẩn 12 Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin Để tăng khả sinh sản vi khuẩn thêm dung dịch glucoza 40%, giữ pH= 7,6-7,8 suốt thời gian nuôi cấy Làm bất hoạt : Vacxin làm bất hoạt cồn: Lấy sinh khối trộn thận trọng bình đặc biệt với cồn ethyl theo tỉ lệ lân1:1:4, lần 1:10 Kiểm tra độ tinh khiết đáp ứng miễn dịch đưa dung dịch điểm đẳng điện NaCl có chứa 0,25% phenol tạo tủa 1ml vacxin cồn chưa 5.109 vi khuẩn Đổ vacxin vào ống đông khô 400C- 500C đơng gói thành phẩm Kết luận đề nghị  Sự đời vacxin có ý nghĩa vô to lớn nhân loại Nó giúp cho lồi người khỏi nhiều đại dịch hiểm nghèo (đậu mùa, bại liệt; sởi, uốn ván v.v  Tuy nhiên, nhiều bệnh thách thức người, chưa có vắc-xin đủ hiệu để ngăn ngừa Trong phải kể nhiều bệnh ký sinh trùng (thí dụ sốt rét, giun, sán), vi khuẩn (lao), virus (cúm, sốt xuất huyết, AIDS v.v.) Một số lý tác nhân gây bệnh biến đổi thường xuyên khiến cho miễn dịch không cịn hữu hiệu chí cơng vào hệ miễn dịch trường hợp HIV v.v  Các loại vắc-xin truyền thống dần tính phòng bệnh, đặc biệt gây phản ứng phụ chết người thời gian gần Tính ưu việt loại vacxin ngày khẳng định: tinh khiết, phản ứng phụ, hiệu lực tạo miễn dịch cao, sản xuất nhanh giá thành thấp  Có thể nói, thành tựu từ khoa học kỹ thuật ứng dụng công nghệ sinh học y học , đặc biệt ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin mở nhiều hướng nghiên cứu hiệu công tác điều trị bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO • • • • • Phạm Văn Ty.Vũ Nguyên Thành ,công nghệ sinh học_công nghệ vi sinh môi trường (tập 5) Nhà xuất giáo dục, 1997 Lương Đức Phẩm, Hồ xưởng vi sinh vật tổng hợp, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1978 Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ sinh học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Tp.HCM, 2000 Rene Scriban, Biotechnologie, Tocdoc Paris, 1993 Monique L G, Biotechnologie, Principles et methods, Doin editeurs, Paris, 1992 13 Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin 14 ... Loại vacxin sản xuất từ vi sinh vật gây bệnh vi sinh vật giống vi sinh vật gây bệnh cấu trúc kháng nguyên, làm giảm độc lực khơng cịn khả gây bệnh Vacxin sống tạo thể Ứng dụng công nghệ vi sinh sản. .. đến vi? ??c tốn bệnh đậu mùa phạm vi tồn giới vào thập kỷ 70, bệnh toán vacxin Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin 4.1.2/ Vacxin tái tổ hợp Có hướng cơng nghệ rADN ứng dụng để phát triển vacxin. .. lực, đến cịn công nghệ lựa chọn cho nhiều vacxin virut 10 Ứng dụng công nghệ vi sinh sản xuất vacxin 4.2.2 Vacxin bất hoạt protein Đối với nhiều tác nhân gây bệnh vi? ??c phát triển vacxin dựa Protein