NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH PHÒNG TRỪ BỆNH HÉO LẠC VÀ VỪNG Lê Th Thanh Thy, Lê Như Kiu, Nguyn Văn Huân, Trn Th La, Trn Quang Minh SUMMARY Study on the construction of process for production of microbial preparation to control of wilt disease of groundnut and sesame Isolation, selection, assessment of biological activities and the ability to against bacterial wilt disease caused by Ralstonia solanacearum and Fusarium oxysporum of bacterial strains have been done. 2 groups of microorganisms used to make microbial preparation for groundnut (PS1, TS6, Pb8, Ba51, T15) and sesame (HS10, CRT, HS8, M, CX1) were selected. In the mixed condition, all of selected bacterial strains can be existed well together and had positive effects to growth, development and inhibition of disease caused by R. solanacearum and F. oxysporum. These selected bacterial strains have potential to produce microbial preparation to control of wilt disease of groundnut and sesame. We constructed of process for production of microbial preparation VSV1 used for groundnut and VSV2 used for sesame. Both of microbial preparations contained multi- antagonistic strains have density of microorganism is about 10 9 cfu/g. Quality of microbial preparation was insured in 3 months keeping time in room temperature. Keywords: Disease of groundnut, disease of sesame, bacterial wilt, R. solanacearum, F. oxysporum, antagonistic bacteria. I. M U  nưc ta, cây lc và cây vng là nhng cây có giá tr kinh t cao trên mt ơn v din tích gieo trng. Do vy phát trin trng lc và vng không ch thúc Ny chuyn dch cơ cu cây trng trong nông nghip mà còn nâng cao thu nhp cho ngưi nông dân. Tuy nhiên, thc t trng lc và vng  các nưc trên th gii nói chung và  Vit Nam nói riêng gp rt nhiu khó khăn, c bit là bnh héo xanh do vi khuNn R. solanacearum gây ra trên lc và vng [3].  nưc ta bnh héo xanh do vi khuNn ã phát sinh  hu ht các a phương có trng các cây như: cà chua, vng, lc, thuc lá, khoai tây,  rt nhiu tnh thành như: Hà Ni, Vĩnh Phúc, Bc Ninh, Thái Nguyên, Thanh Hoá, Ngh An có nơi, có lúc bnh ã gây thit hi nng ti mc gây cht 100% cây trng. Cho ti nay nhng nghiên cu v bnh héo xanh vi khuNn  lc và vng ch yu ch gii hn trong phm vi xác nh mc  thit hi, s phân b ca bnh và bưc u xác nh ngun gen kháng trong tp oàn các ging lc và vng hin có. Tuy nhiên do kh năng có th bin i tính c ca các chng vi khuNn R. solanacearum gây bnh và hn ch ca thuc bo v thc vt i vi loi vi khuNn này, nên các bin pháp phòng tr sinh hc bnh héo xanh vi khuNn bng các vi sinh vt i kháng ã cho thy nhiu ha hn kh quan và là bin pháp rt cn thit  thay th các loi thuc hóa hc bo v thc vt [1, 3]. Bài báo này s ưa ra nhng kt qu trong nghiên cu xây dng qui trình sn xut ch phNm vi sinh phòng tr bnh héo lc và vng. II. VT LIU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CU 1. Vật liệu - Vi khuNn R.solanacearum và nm F.oxysporum gây bnh héo ưc phân lp t các cây lc và vng có biu hin triu chng nhim bnh in hình [5]  mt s tnh như: Hà Ni, Thanh Hoá, Ngh An và Vĩnh Phúc. Các mu t trng cây h cà (t, cà chua), cây lc và vng. 2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp Koch s dng  xác nh mt  vi sinh vt: Mt  vi sinh vt ưc xác nh da trên phương pháp nuôi cy trên môi trưng thch ĩa, tính s lưng vi sinh vt trên mililit hoc trên gam mu thông qua s khuNn lc phát trin trong các ĩa môi trưng. - Phương pháp xác nh hot tính i kháng vi khuNn, nm gây bnh: ưc xác nh bng cách o ưng kính vòng c ch; ó là vòng tròn trong sut bao quanh khuNn lc (i vi trưng hp cy im) hoc l thch (i vi trưng hp khoan l thch), nơi mà vi sinh vt gây bnh không sinh trưng ưc [4]. - Phương pháp Salkowsky ci tin (Misra và cs., 1989) s dng  xác nh kh năng sinh tng hp IAA thô: Các chng vi sinh vt ưc nuôi cy trong môi trưng có b sung 0,1% Triptophan. Sau thi gian nuôi cy, ly tâm, thu ưc dch trong. Cho 2 ml dch trong vào ng nghim cha 8 ml thuc th Salkowsky ci tin. Lc u,  yên trong 20 phút, sau ó so màu trên máy vi bưc sóng 530 nm. Hàm lưng IAA to ra trong môi trưng ưc tính toán trên cơ s  th IAA chuNn. Thuc th Salkowsky ci tin: FeCl 3 0,5M 15 ml; H 2 SO 4 98% 300 ml; nưc ct 500 ml. - Phương pháp ánh giá tính c ca các chng vi khuNn s dng theo 10TCN: 216- 1995 (216-2003) [2]. Thí nghim chia thành 6 công thc: CT1: Công thc i chng là t không nhim sinh khi vi khuNn; CT2: t nhim R. solanacearum (10 4 -10 5 cfu/g); CT3: t nhim F. oxysporum (10 4 -10 5 bt/g); CT4: t nhim hn hp các chng vi khuNn; CT5: Là CT2+hn hp vi khuNn; CT6: Là CT3+hn hp vi khuNn. III. KT QU VÀ THO LUN 1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng để sản xuất chế phm vi sinh T các mu t, mu thân cây vng và cây lc khe  các tnh Vĩnh Phúc, Hà Tĩnh, Hà Ni và Thanh Hóa ã phân lp ưc 24 chng vi khuNn i kháng, ây là ngun nguyên liu quý cho vic tuyn chn chng có tim năng cao trong sn xut ch phNm vi sinh phòng tr bnh héo xanh lc, vng. Tiêu chuNn chn la các chng vi khuNn i kháng là phi có hot lc i kháng mnh, tác dng trên nhiu chng vi sinh vt gây bnh, n nh lâu dài trong ch phNm và không gây bnh cho ng vt máu nóng. T 24 chng vi khuNn i kháng trên chúng tôi la chn ưc 2 t hp, bao gm 10 chng vi khuNn in hình làm vt liu trong nghiên cu sn xut ch phNm vi sinh s dng trong phòng tr bnh héo xanh lc và vng. Trong ó có 8 chng i kháng c R. solanacearum và F. oxysporum vi kích thưc vòng c ch t 10-20 mm. Bảng 1. Tổ hợp các chủng vi khun sử dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng (tháng 10-2008, tại Viện Thổ nhưỡng ông hóa) Chế phẩm Chủng vi khuẩn Ký hiệu chủng Hoạt tính sinh học Đơn vi đo hoạt lực Hoạt lực Cây lạc Pseudomonas fluorescens Pseudomonas sp. Bacillus sp. Bacillus subtilis Bacillus megaterium Ps1 TS6 Pb8 Ba5.1 T15 ĐKVK & N héo xanh ĐKVK & N héo xanh ĐKVK & N héo xanh ĐKVK & N héo xanh, KTSTTV, PG kitin ĐKVK héo xanh Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) IAA: µg/ml Đường kính VPGKT (mm) Đường kính VƯC (mm) 12; 12 12; 10 16; 16 15; 15,5 182 32 20 Cây vừng Pseudomonas sp. Pseudomonas putida Bacillus sp. Bacillus velezensis Bacillus polyfermenticus HS10 CRT HS8 M CX1 ĐKVK & N héo xanh ĐKVK héo xanh ĐKVK & N héo xanh, ĐKVK & N héo xanh, KTSTTV PG kitin ĐKVK & N héo xanh Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) Đường kính VƯC (mm) IAA: µg/ml Đường kính VPGKT (mm) Đường kính VƯC (mm) 16; 16 20 12; 12 15; 15,5 160 37 15; 15 KVK & N: i kháng vi khuNn và nm. IAA: Indol Acetic Acid. VƯC: Vòng c ch vi khuNn/nm gây bnh. KTSTTV: Kích thích sinh trưng thc vt. PG: Phân gii. VPGKT: Vòng phân gii kitin. Các chng vi khuNn la chn thuc các chi Pseudomonas và Bacillus u có hot tính i kháng cao vi vi khuNn R. solanacearum và nm F. oxysporum gây héo lc, vng và n nh hot tính trong nhiu ln thí nghim. Kt qu minh ha trên hình 1. Tin hành xác nh nh tính tác ng tương h gia các chng bng phương pháp cy vch tip xúc gia các chng vi khuNn trên môi trưng thch. Kt qu cho thy, các chng vi khuNn tuyn chn u phát trin tt trên cùng mt môi trưng dinh dưng, không có biu hin kìm hãm sinh trưng gia các chng nghiên cu. Kt qu minh ha trên hình 2. Hình 1. ánh giá hot lc i kháng vi khuNn R. solanacearum và nm F. oxysporum gây héo xanh lc và vng Hình 2. N uôi cy vch các chng vi khuNn tuyn chn trên cùng môi trưng dinh dưng Bảng 2. Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khun đối kháng đến sinh trưởng, phát triển và khả năng hạn chế bệnh héo xanh giống lạc MD7 (thí nghiệm nhà lưới, Viện Thổ nhưỡng ông hóa 2008) Công thức Cao cây (cm) Trọng lượng khô thân lá (g) Tỷ lệ cây chết (%) do R. solanacearum F. oxysporum CT1: Đối chứng 20,8 1,41 - - CT2: Nhiễm R. solanacearum 19,3 1,46 87,5 - CT3: Nhiễm F. oxysporum 17,8 1,39 - 75,0 CT4: Nhiễm hỗn hợp vi khuẩn 21,7 1,53 - - CT5: Nhiễm R. solanacearum + hỗn hợp vi khuẩn 21,0 1,55 25,0 - CT6: Nhiễm F. oxysporum + hỗn hợp vi khuẩn 20,1 1,58 - 37,5 LSD (0,05) 4,03 4,80 CV (%) 7,50 3,90 Kt qu bng 2 cho thy khi nhim bnh nhân to t l cây cht héo do R. solanacearum là 87,5%, do F. oxysporum là 75%. Nhim ng thi t hp các chng vi khuNn i kháng và vi khuNn R. solanacearum t l cây cht ch còn 25%, t hp các chng vi khuNn i kháng và nm F. oxysporum t l cây cht ch còn 37,5%. Trong khi ó công thc nhim hn hp vi khuNn, cây lc sinh trưng, phát trin bình thưng, cây không b cht héo. Bảng 3. Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khun đối kháng đến sinh trưởng, phát triển và khả năng hạn chế bệnh héo xanh giống vừng V6 (thí nghiệm nhà lưới, Viện Thổ nhưỡng ông hóa, 2008) Công thức Cao cây (cm) Khối lượng khô thân lá (g) Tỷ lệ cây chết (%) do R. solanacearum F. oxysporum CT1: Đối chứng 50,76 105,84 - - CT2: Nhiễm R. solanacearum 48,12 98,28 80,0 - CT3: Nhiễm F. oxysporum 46,67 95,76 - 72,0 CT4: Nhiễm hỗn hợp vi khuẩn 56,16 123,48 - - CT5: Nhiễm R. solanacearum + hỗn hợp vi khuẩn 55,06 120,96 25,0 - CT6: Nhiễm F. oxysporum + hỗn hợp vi khuẩn 58,15 119,07 - 40,5 LSD (0,05) 3,05 5,35 CV (%) 5,10 3,10 i vi vng khi nhim bnh nhân to t l cây cht héo xanh do R. solanacearum là 80%. Nhim ng thi t hp các chng vi khuNn i kháng và vi khuNn R. solanacearum t l cây cht ch còn 25%, t l cây cht ch còn 40,5%  t hp các chng vi khuNn i kháng và nm F. oxysporum. Công thc nhim hn hp chng vi khuNn i kháng, cây vng sinh trưng, phát trin tt, cây không b cht héo, minh ha  bng 3. N hư vy, các chng vi khuNn i kháng nghiên cu có  iu kin  sn xut ch phNm vi sinh s dng trong phòng chng bnh héo lc và vng. 2. ghiên cứu qui trình sản xuất chế phm vi sinh vật đối kháng bệnh héo cây lạc và vừng trong phòng thí nghiệm Thí nghim s dng các ngun dinh dưng tng hp và ngun dinh dưng t nhiên d kim, r tin trong nuôi cy nhân sinh khi các chng vi khuNn. Kt qu so sánh mt  các chng vi khuNn và hot tính ca chúng trên các môi trưng có thành phn dinh dưng khác nhau ưc th hin trong các bng 4 và 5. Bảng 4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của các chủng vi khun TT Kí hiệu chủng Mật độ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường King B Pseu SX1 SX2 SX3 SX4 1 Ps1 2,2 x 10 8 1,6 x10 9 2,4 x 10 8 2,9 x 10 8 4,2 x 10 9 9,8 x 10 7 2 TS6 3,1 x10 8 1,3 x10 9 2,0 x 10 8 5,2 x 10 8 3,4 x 10 9 7,8 x 10 7 3 Pb8 4,4 x 10 8 2,5 x 10 8 1,2 x 10 7 2,6 x 10 7 6,0 x 10 8 4,0 x 10 7 4 Ba5.1 6,0 x10 8 1,1 x10 8 1,8 x10 8 8,3 x10 8 6,9 x10 8 1,1 x10 8 5 T15 2,1 x 10 9 1,4 x10 8 8,5 x10 7 4,2 x10 9 3,8 x10 9 1,4 x10 8 6 HS10 2,5 x 10 8 2,5 x 10 9 2,5 x10 9 2,6 x10 9 4,6 x10 9 2,9 x10 8 7 CRT 2,0 x10 8 1,5 x10 9 1,4 x10 8 2,0 x10 8 1,4 x10 9 2,7 x10 8 8 HS8 3,4 x10 8 2,5 x10 8 1,3 x10 8 4,5 x10 8 3,2 x10 8 2,5 x10 8 9 M 5,6 x 10 8 2,0 x10 8 4,6 x10 8 5,4 x10 8 5,0 x10 8 1,8 x10 8 10 CX1 2,6 x 10 8 1,2 x10 8 1,0 x 10 7 2,4 x 10 7 4,6 x 10 8 5,0 x 10 7 Chú thích: * SX1, SX2, SX3, SX4: Là các môi trưng cha g ưng mía, dch nưc chit u, có b sung mt s cht dinh dưng và khoáng cht. * KingB, Pseu: Là hai môi trưng c hiu cho nuôi cy các chng thuc chi Bacillus và Pseudomonas. Bảng 5. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính đối kháng của các chủng vi khun TT Kí hiệu chủng Đường kính vòng ức chế vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc, vừng (D-d)(mm) King B Pseu SX1 SX2 SX3 SX4 1 Ps1 11 12 11 11 12 10 2 TS6 12 12 11 12 12 10 3 Pb8 16 14 14 14 16 14 4 Ba5.1 15 14 15 15 15 14 5 T15 18 20 18 18 19 18 6 HS10 16 16 16 16 16 16 7 CRT 18 20 18 19 20 18 8 HS8 12 10 11 11 11 10 9 M 15 14 14 14 14 14 10 CX1 15 14 13 14 15 13 Kt qu bng 4 và 5 cho thy, các chng vi khuNn nghiên cu u phát trin tt trong môi trưng c hiu có ngun gc t nhiên (nưc chit u, g ưng) cho tng chng trên các môi trưng. Trên môi trưng sn xut SX3 tt c các chng u có mt  t bào cao hoc tương ương khi nuôi cy trên môi trưng c hiu. Kt qu tương t khi so sánh hot tính sinh hc ca các chng vi khuNn nghiên cu trên các môi trưng nuôi cy khác nhau. Như vy có th la chn môi trưng SX3 cho nhân sinh khi các chng vi khuNn la chn  sn xut ch phNm cho cây lc vng, vì môi trưng này va m bo mt  t bào cao (t 10 8 -10 9 /ml), va m bo hot tính i kháng cao nht (kích thưc vòng phân gii t 15-20 mm) so vi các môi trưng khác. Cht mang là giá th mà  ó vi sinh vt trú ng, m bo t mt  theo yêu cu trong quá trình t khi sn xut n lúc s dng. ã tin hành nghiên cu so sánh kh năng tn ti ca các chng vi khuNn tuyn chn trên các nn cht mang khác nhau như than bùn, than bùn b sung xơ da, phân giun, phân compost, mai cua, t x him. Trên cơ s ó ã la chn loi cht mang phù hp cho nghiên cu sn xut ch phNm vi sinh cho cây lc, vng là cht mang than bùn b sung g ưng và t x him. Cht mang s dng làm ch phNm ưc x lý vi các công on: Nghin nh → Trung hòa pH → Phi trn g ưng, t x him → iu chnh  Nm → óng gói → Kh trùng Trên cơ s tng hp các kt qu nghiên cu v công ngh sn xut ch phNm vi sinh như: Tuyn chn b chng ging vi sinh vt s dng cho sn xut ch phNm, la chn môi trưng nhân sinh khi VSV, xác nh iu kin lên men nhân sinh khi, la chn, x lý cht mang. Kt qu ã xây dng ưc 2 quy trình công ngh sn xut ch phNm vi sinh vt phòng tr bnh héo cây lc và vng và ưc tóm tt trong sơ  1 và 2. SƠ ĐỒ 1. QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY LẠC SƠ ĐỒ 2. QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY VỪNG Ch phNm VSV1 s dng cho cây lc; Ch phNm VSV2 s dng cho cây vng, là sn phNm lên men cp hai nhân sinh khi vi sinh vt và phi trn vi cht mang. Mt  t bào mi loi vi khuNn t 10 9 cfu/g và ưc bo qun  iu kin nhit  phòng trong iu kin râm mát, sch s, không  gn nơi cha cht c hóa hc, thuc tr sâu. S dng tt trong vòng 3 tháng. IV. KT LUN Phân lp, tuyn chn, nghiên cu và ánh giá hot tính sinh hc, kh năng i kháng bnh héo xanh vi khuNn do R. solanacearum và bnh héo do nm F. oxysporum. Trong iu kin t hp các chng vi khuNn cho thy, hn hp các chng vi khuNn s dng sn xut ch phNm vi sinh cho lc (PS1, TS6, Pb8, Ba51, T15) và ch phNm cho vng (HS10, CRT, HS8, M, CX1) u có th tn ti tt cùng nhau Chất mang Trung hòa pH Trộn gỉ đường, đ ất xạ hiếm, phụ gia Kiểm tra tạp nhiễm Đóng gói, khử trùng Xử lý thô (nghiền, sàng, loại bỏ tạp chất) Bảo quản sử dụng Chủng giống VSV Lên men cấp 1 Lên men cấp 2 Thu sinh khối Phối trộn Chế phẩm VSV1 Ki ểm tra mật độ t ế bào VSV, tạp nhiễm Chất mang Trung hòa pH Trộn gỉ đường, đ ất xạ hiếm, phụ gia Kiểm tra tạp nhiễm Đóng gói, khử trùng Xử lý thô (nghiền, sàng, loại bỏ tạp chất) Bảo quản sử dụng Chủng giống VSV Lên men cấp 1 Lên men cấp 2 Thu sinh khối Phối trộn Chế phẩm VSV2 Kiểm tra mật độ tế bào VSV, t ạp nhiễm và có th s dng trong sn xut ch phNm vi sinh cho cây lc và vng. Xây dng ưc qui trình sn xut ch phNm VSV1 i kháng s dng cho cây lc và VSV2 i kháng s dng cho cây vng. Các ch phNm vi sinh cha hn hp chng VSV i kháng bnh do R. solanacearum và F. oxysporum có mt  t bào mi chng t 10 9 cfu/g, thi gian bo qun 3 tháng  nhit  phòng. TÀI LIU THAM KHO 1 Lê hư Kiểu, Phạm Công Minh, Trần Quang Minh và guyễn gọc Cường, 2005. Quy trình sn xut ch phNm vi khuNn i kháng VK58 phòng chng bnh héo xanh cà chua, Tp chí Khoa hc và Công ngh, tp 43, s 5, tr. 47-54. 2 10TCN: 216-1995 (216-2003): Kho nghim hiu lc phân bón trên ng rung i vi cây trng. 3 guyễn Văn Viết và cs., 2003. Kt qu nghiên cu phòng tr bnh héo xanh vi khuNn hi lc bng ging kháng bnh  vùng t cn và t dc, 2001-2002. Tuyn tp các Công trình Khoa hc K thut Nông nghip, Nhà xut bn Nông nghip, 74-79. 4 10TCN 714-2006: Phương pháp ánh giá hot tính i kháng ca vi sinh vt có kh năng i kháng vi khuNn Ralstonia solanacearum gây bnh héo xanh cây trng cn. 5 Black L.L., Green S.K., Hartman G.L., Poulos J.M., 1991. Pepper Diseases: A Field Guide. Asian Vegetable Research & Development Center, AVRDC Publication No.31-347, 98pp. gười phản biện: guyễn Văn Viết T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 . NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH PHÒNG TRỪ BỆNH HÉO LẠC VÀ VỪNG Lê Th Thanh Thy, Lê Như Kiu, Nguyn Văn Huân,. hợp các chủng vi khun sử dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phm vi sinh phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng (tháng 10-2008, tại Vi n Thổ nhưỡng ông hóa) Chế phẩm Chủng vi khuẩn Ký hiệu. sn xut ch phNm vi sinh s dng trong phòng chng bnh héo lc và vng. 2. ghiên cứu qui trình sản xuất chế phm vi sinh vật đối kháng bệnh héo cây lạc và vừng trong phòng thí nghiệm Thí