NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG SP25 (Dianthus caryophyllus Make up) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Lê c Tho, Hoàng Ngc Thun, Nguyn Th Kim Lý, Trn Hoài Hương Summary Study on multiplication technology for SP25 Carnation variety (Dianthus caryophyllus Make up) by tissue culture The SP25 variety has been imported, evaluated and selected by Agricultural Genetics Institute. It is being interested by producers and consumers at present. So it is necessary to study on technique for multiplication by tissue culture. The result showed that, to sterilize by HgCl 2 0.1% at 6 minutes is the best choice. The suitable culture medium for shoot formation and multiplication of SP25 was mixed in MS medium supplement with vitamins, 10% coconuts milk, 8.0 g/l agar, 2% sugar, BAP 0.7 mg/l and Kinetin 0.1 mg/l. The coefficient of multiplication rate was 3.71 times. The culture medium for root formation is MS medium supplemented with vitamins, 8.0 g/l agar, 2% sugar, IBA 0,05 mg/l and NAA 0.2 mg/l. The best substrate for plantlets were mix substrate includes: 30% perlite and 70% rice husk burning. Keywords: Carnation, tissue culture, culture medium, sterilize, multiplication, root formation, plantlets, substrates. I. T VN  Hin nay, trong các loi hoa ct ưc trng, cNm chưng ang dn tr nên ph bin. Cây cNm chưng ngày càng ưc ngưi tiêu dùng bit n bi s a dng v màu sc, hoa rt bn, thun li cho vic bo qun và vn chuyn i xa.  ng bng Bc b, hoa cNm chưng mi ch ưc trng mt v trong năm, do ó, vic gi ging qua mùa hè trong iu kin khí hu không thun li và nhân ging cho v sau rt khó thc hin. V k thut nhân ging, sn xut hin nay vn nhân ging ch yu bng phương pháp giâm cành qua nhiu th h, cây con cht lưng kém, h s nhân thp. Thi gian qua, Vin Di truyn N ông nghip ã nhp ni và tuyn chn ưc mt s ging cNm chưng có cht lưng cao, phù hp vi iu kin sn xut, trong ó có ging SP25 chùm (Dianthus caryophyllus Make up), có kh năng thích ng cao, k c iu kin ng bng Bc b và ưc ngưi sn xut cũng như th trưng chp nhn. Vic nghiên cu các bin pháp k thut nhân nhanh vi s lưng ln cây ging nhm ưa ging này phát trin ra sn xut là yêu cu cp thit ca sn xut. Vì vy, chúng tôi ã tin hành nghiên cu quy trình nhân ging hoa cNm chưng SP25 bng phương pháp nuôi cy mô t bào. II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CU 1. Vật liệu nghiên cứu - Mu nuôi cy là chi nh và chi nách ca ging cNm chưng SP25 (Dianthus caryophyllus Make up). S dng hai hóa cht kh trùng là HgCl 2 0,1% và H 2 O 2 10%, 15%, 20%. - iu kin nuôi cy: Nhit  nuôi cy 25-28 0 C, ánh sáng 1500-2000 Lux, thi gian 8 gi/ngày. 2. Phương pháp nghiên cứu Mu ly v ưc ra sch dưi vòi nưc, ct ta, bóc ht lp lá bao tránh không  gip, ngâm trong xà phòng loãng 5 phút, ra sch dưi vòi nưc và nưc ct, tip tc kh trùng bng cn 70 0 trong vòng 30 giây. Sau ó s dng hai cht kh trùng H 2 O 2 và HgCl 2  kh trùng  các thi gian khác nhau. Ra li 3 ln bng nưc ct vô trùng và ct tng on mang mt ng cho vào môi trưng nuôi cy. Mu cho vào sau vài tun s xut hin các chi non t các mt ng, tách các chi non cho vào môi trưng tái sinh chi  nhân nhanh. Sau các ln cy chuyn, chn các chi  tiêu chuNn cy vào môi trưng ra r, to cây hoàn chnh. Cây con sau khi ưa ra khi bình nuôi cy mô ưc ra sch môi trưng bám dính  r bng nưc sch, sau ó giâm vào khay bng xp vi các giá th khác nhau. Thí nghim ưc b trí ngu nhiên, 3 ln nhc li. S liu ưc x lý thng kê trên chương trình IRRISTAT. III. KT QU VÀ THO LUN 1. ghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu - Thí nghim bao gm: + HgCl 2 0,1% trong thi gian là: 4 phút, 6 phút, 8 phút tương ng vi các công thc t 1 n 3. + H 2 O 2  các nng  khác nhau trong cùng mt thi gian 10 phút tương ng vi các công thc t 1 n 3: 10%, 15%, 20%. - Kt qu thu ưc  bng sau: Bảng 1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng HgCl 2 0,1% đến tỷ lệ mẫu sống ở giống cm chướng SP25 CT Thời gian khử trùng (phút) Số mẫu đưa vào Số mẫu sống sau 3 tuần Tỉ lệ mẫu sống (%) CT1 4 50 28,67 57,34 CT2 6 50 38,33 76,66 CT3 8 50 35,67 71,34 CV (%) 1,7 LSD (0,05) 1,15 Nhn xét: + T ngày th 7, mu bt u có hin tưng b nhim nm và nhim khuNn. Sau ngày th 19, các mu ã tương i n nh, không có hin tưng nhim mi. + Sau 3 tun, s mu sng  mi công thc cho thy  công thc 3 khi kh trùng bng HgCl 2 0,1% trong thi gian 8 phút thì t l mu không b nhim cao nhưng có mt s mu b cht, vì vy s mu sng sót sau 3 tun là không cao. + V kh năng bt mm  mi công thc: Công thc 1 và 2, sau 10 ngày ã xut hin mm. Công thc 3, sau 2 tun xut hin mm. + V c im hình thái: Mm  công thc 1 và 2 xanh và mp hơn so vi công thc 3. N hư vy, kh trùng  8 phút thì s mu b nhim thp, nhưng kh năng bt mm chm và mu xu. Kh trùng  6 phút cho kt qu tt nht, t l nhim thp và kh năng bt mm sm. Bảng 2. Ảnh hưởng của nồng độ H 2 O 2 đến tỷ lệ mẫu sống ở giống cm chướng SP25 CT Nồng độ (%) Số mẫu Số mẫu sống sau 3 tuần Tỉ lệ mẫu sống (%) CT1 10 50 8,67 17,34 CT2 15 50 11,33 22,66 CT3 20 50 15,67 31,34 CV (%) 4,9 LSD (0,05) 1,15 Kt qu cho thy, sau 3 tun, toàn b mu ưc kh trùng bng H 2 O 2 10%, 15% u b nhim. Ch  công thc 3 là còn mu không b nhim và ã bt mm. Khi kh trùng bng H 2 O 2 thì nng  20% trong 10 phút cho kt qu tt nht. Kết luận: i vi cNm chưng SP25, kh trùng bng HgCl 2 0,1% cho kt qu tt hơn so vi dùng H 2 O 2 . Kh trùng bng HgCl 2 0,1% trong khong thi gian 6 phút cho kt qu tt nht. 2. Ảnh hưởng của phytohormon lên khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi Chúng tôi tin hành 3 thí nghim  nghiên cu s nh hưng riêng r ca KIN và BAP, ng thi tác dng ca t hp BAP và KIN lên s tái sinh và nhân nhanh chi. 2.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi Các công thc thí nghim: + CT1: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar (i chng). + CT2: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,5 mg/l BAP. + CT3: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,7 mg/l BAP. + CT4: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 1 mg/l BAP. Kt qu thu ưc  bng sau: Bảng 3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi ở cm chướng SP25 (sau 3 tuần) BAP (mg/l) Số mẫu ban đầu Số chồi tạo thành Hệ số nhân (lần) Đặc điểm mẫu 0,0 (ĐC) 30 57,67 1,92 Cây cao, gầy 0,5 30 86,0 2,87 Cây cao, hơi gầy 0,7 30 104,33 3,48 Cây mập, xanh 1 30 83,67 2,79 Cây mập, xanh CV (%) 0,9 LSD (0,05) 1,33 Qua bng kt qu trên cho thy BAP có nh hưng tích cc n s to chi mi.  công thc i chng, không có b sung BAP thì h s nhân rt thp (1,96 ln), mu xu, cao và gy. Khi nng  BAP tăng dn thì h s nhân cũng tăng lên. Kt qu tt nht là môi trưng ưc b sung BAP nng  0,7 mg/l, mu xanh, thân mp, u cây và t h s nhân là 3,38. Nhưng khi nng  BAP tăng dn t 0,7 n 1 thì h s nhân li gim dn, vì nng  BAP cao ã c ch quá trình to chi mi. 2.2. Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi - Công thc thí nghim: + CT1: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar (i chng). + CT2: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,1 mg/l Kinetin. + CT3: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,3 mg/l Kinetin. + CT4: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,5 mg/l Kinetin. - Kt qu thu ưc  bng 4: Bảng 4. Ảnh hưởng của nồng độ KI tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi ở cm chướng SP25 (sau 3 tuần) KIN (mg/l) Số mẫu ban đầu Số chồi tạo thành Hệ số nhân (lần) Đặc điểm mẫu 0,0 (ĐC) 30 58,33 1,95 Cây cao, gầy 0,1 30 69,67 2,32 Cây cao, gầy 0,3 30 64,0 2,13 Cây cao, gầy 0,5 30 61,67 2,06 Cây cao, gầy CV (%) 1,1 LSD (0,05) 1,33 Sau 3 tun theo dõi, KIN cũng có tác dng tích cc n quá trình to chi. Khi nng  KIN tăng thì h s nhân chi cũng tăng, tuy nhiên chi mi to thành cao và rt gy. Nng  KIN  0,1 mg/l thì h s nhân là cao nht. Khi nng  KIN tip tc tăng thì h s nhân li gim. 2.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và Kinetin tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi - Công thc thí nghim: + i chng (C): MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar. + CT1: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin. + CT2: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin. + CT3: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,7 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin. + CT4: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,7 mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin. + CT5: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin. + CT 6: MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 1mg/l BAP + 0,3 mg/l Kinetin. Kt qu thu ưc  bng 5: Bảng 5. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và các nồng độ Kinetin tới sự tái sinh và nhân nhanh chồi ở cm chướng SP25 (sau 3 tuần) CT Số mẫu ban đầu Số chồi tạo thành Hệ số nhân (lần) Đặc điểm mẫu ĐC 30 58,67 1,96 Cây cao, gầy CT1 30 81,33 2,71 Cây cao, gầy, không đều CT2 30 97,67 3,26 Cây mập, xanh, đều cây CT3 30 111,33 3,71 Thân mập, xanh CT4 30 89,33 2,98 Cây cao, gầy CT5 30 85,33 2,84 Cây cao, gầy CT6 30 84,0 2,8 Thân gầy CV (%) 0,7 LSD (0,05) 1,18 BAP và KIN u là nhng cytokinin tng hp. BAP kích thích s to chi mnh, KIN có tác dng kích thích s phát sinh chi mi, làm t bào kéo dài, tăng kh năng tng hp dip lc nên làm chi tăng kích thưc, khe hơn và sinh trưng tt hơn. Như vy khi dùng t hp BAP và KIN va kích thích s to chi mnh, va to chi khe và sinh trưng tt.  các công thc có b sung t hp BAP và KIN, h s nhân cao hơn so vi công thc ch b sung BAP hoc KIN. Môi trưng ưc b sung 0,7 mg/l BAP + 0,1 mg/l KIN t h s nhân cao nht (3,71 ln), chi xanh, mp và khe. 2.4. Ảnh hưởng của phytohoormon đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh Chn nhng chi c lp, cao khong t 2,5-3 cm, thân lá phát trin tt cy vào môi trưng ra r ã chuNn b. Công thc thí nghim: + CT1: MS + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,15 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA. + CT2: MS + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,2 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA. + CT3: MS + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,25 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA. Bảng 6. Ảnh hưởng của nồng độ AA và IBA tới tỷ lệ ra rễ trong ống nghiệm của giống cm chướng SP25 Công thức Số mẫu cấy (cây) Số cây ra rễ sau 3 tuần (cây) Tỷ lệ (%) CT1 30 18,67 62,23 CT2 30 30,0 100,0 CT3 30 12,67 42,23 CV (%) 2,3 LSD (0,05) 0,94 Kt qu cho thy,  CT2 (môi trưng MS + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,2 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA) cho t l ra r sau 3 tun t n 100%. 2.5. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây in vitro giai đoạn ngoài vườn ươm (sau 2 tuần) Chn cây hoàn chnh, trng trên các giá th khác nhau. Theo dõi kt qu da trên các tiêu chí: c im ca thân, lá, màu sc. Bảng 7. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống và sự sinh trưởng phát triển của cây cm chướng SP25 Giá thể Số mẫu đưa vào (cây) Số mẫu sống (cây) Tỷ lệ sống (%) Đặc điểm cây Cát 50 46,0 86,66 Thân gầy, ít rễ mới Đất màu 50 37,67 75,34 Cây còi cọc, ít rễ mới Trấu hun + Hạt perlite (7:3) 50 50,0 100,0 Xanh, rễ mới nhiều, khoẻ Trấu hun 50 43,33 92,0 Cây xanh, rễ khoẻ. CV (%) 0,9 LSD (0,05) 0,77 Khi cây mi ưa ra t phòng thí nghim, cn phi ưa ra giá th thích hp nht  cây thích nghi vi iu kin ngoài phòng thí nghim, ng thi to thêm r mi trưc khi ưa ra t. i vi cNm chưng SP25 giá th cát cho t l cây sng cao nhưng cây gy và ít to r mi, t màu cho t l cây sng thp nht. Giá th tru hun cho t l cây sng và hình thái cây tương i tt. Giá th hn hp tru hun + Ht perlite (t l 7:3) là thích hp nht, t l cây sng t 100%, cây xanh, khe. IV. KT LUN 1. i vi ging SP25 mu ưc kh trùng vi HgCl 2 0,1% trong thi gian 6 phút cho t l sng sau 3 tun cao nht (76,66%). 2. Môi trưng MS + 10% nưc da + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,7 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin t h s nhân cao nht 3,71 ln. 3. Môi trưng to cây hoàn chnh MS + 2% ưng + 8 g/l agar + 0,2 mg/l NAA + 0,05 mg/l IBA cho t l cây ra r cao nht t 100% sau 3 tun. 4. T l cây sng sau khi ưa ra vưn ươm vi giá th tru hun + ht perlite (7:3) cho t l sng và hình thái cây tt nht (100%) sau 2 tun. TÀI LIU THAM KHO 1 guyễn Xuân Linh-Chủ biên, 1998. Hoa và k thut trng hoa, NXB. Nông nghip, Hà Ni. 2 Lê Trần Bình, Hồ Hữu hị, Lê Thị Muội, 1997. Công ngh sinh hc thc vt trong ci tin ging cây trng, NXB. Nông nghip, Hà Ni. 3 Aamir Ali, Humera Afrasiab, Shagufta az, Mamoona Rauf, Javed Iqbal, 2008. “An efficient protocol for in vitro propagation of carnation (Dianthus caryophyllus)”. Pakistan Journal of Botany, Vol. 40, No. 1, pp. 111-121, 21 ref. 4 4. Bora, A., Singh, S., Talukdar, M. C., Hazarika, B. ., 2007. “An efficient method for in vitro plant regeneration in carnation”. Indian Journal of Horticulture, Vol. 64, No. 4, pp. 439- 443, 22 ref. 5 Meena Wankhade, Shanti Patil, Nitin Solao, Renuka Naik, Pinki Kumari., 2006. “In vitro propagation of carnation (Dianthus caryophyllus L.)”. Annals of Plant Physiology, Vol. 20, No. 1, pp. 29-34, 7 ref. 6 Seo JinWook, Kim SukWeon, Min SungRan, Liu, J. R., 2007. “High frequency somatic embryogenesis and plant regeneration in root explant cultures of carnation”. Plant Biotechnology Reports, 2007, Vol. 1, No. 2, pp. 67-70 gười phản biện: Trần Duy Quý T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 . NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG SP25 (Dianthus caryophyllus Make up) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Lê c Tho, Hoàng Ngc Thun, Nguyn. SP25 bng phương pháp nuôi cy mô t bào. II. VT LIU VÀ PHƯƠN G PHÁP N GHIÊN CU 1. Vật liệu nghiên cứu - Mu nuôi cy là chi nh và chi nách ca ging cNm chưng SP25 (Dianthus caryophyllus. ging SP25 chùm (Dianthus caryophyllus Make up), có kh năng thích ng cao, k c iu kin ng bng Bc b và ưc ngưi sn xut cũng như th trưng chp nhn. Vic nghiên cu các bin pháp