kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 Sự ĐA DạNG DI TRUYềN MộT Số CHủNG VI KHUẩN Xanthomonas oryzae GÂY BệNH BạC Lá LúA ở MIềN BắC VIệT NAM Genetic pathogenicity of the strain of Xanthomonas oryzae caused bacterial leaf blight in northern Vietnam Nguyễn Văn Viết Đặng Thị Phương Lan Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam Abstract Bacterial leaf blight cause by Xanthomonas oryzae is a destructive disease of rice in Vietnam. Breeding for resistance to disease has become one of the important issue. Therefore, research on strains of Xanthomonas oryzae is required to generate information on the pathogen. Seventy infected leaf samples were collected from different rice varieties grown in different ecological region of Northern Vietnam. 60 isolate of Xanthomonas oryzae were isolate by isolation and PCR method, there are 13 different strains groups of Xanthomonas oryzae were identified. Groups of strain 2 and 3 were recorded with highest frequency of occurrence (14,89%). Key words: Genetic pathogenicity, bacterial leaf blight, rice. I. Đặt vấn đề Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra là bệnh nhiệt đới điển hình của các vùng trồng lúa. Bạc lá lúa trở thành đối tượng gây hại nghiêm trọng đối với cây lúa, đặc biệt là trong vụ mùa ở miền Bắc Việt Nam. Mặc dù số lượng các giống lúa thuần, lúa lai gieo cấy trong sản xuất khá lớn nhưng tỷ lệ các giống có khả năng kháng bệnh rất thấp. Với xu thế ngày càng mở rộng các giống có thời gian sinh trưởng ngắn và các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc không có khả năng kháng bệnh, khả năng phát sinh các dịch bệnh nặng rất dễ xảy ra. Nghiên cứu chọn tạo giống lúa vừa đáp ứng được các yêu cầu về thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao, chất lượng tốt và có khả năng kháng bệnh trở thành nhu cầu bức xúc. Để chọn giống kháng bệnh bạc lá cần, xác định các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá và các gen kháng bệnh. Cho đến nay trên thế giới đã phát hiện được nhiều gen kháng bệnh bạc lá khác nhau. ở mỗi vùng, thậm chí trong cùng một vết bệnh cùng tồn tại một số chủng gây bệnh. ở Việt Nam, thường xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá có độc tính cao và có sự đa dạng về chủng rất lớn. Sau đây là kết quả nghiên cứu xác định nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam. II. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu: Mẫu bệnh bạc lá được thu thập trên các giống lúa ở các vùng sinh thái khác nhau. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh: Phân lập vi khuẩn gây bệnh trên môi trường Wakimoto. Sau khi xuất hiện khuẩn lạc, chọn các khuẩn lạc có hình dạng tròn, nhẵn bóng, lồi lên, kích thước 1 – 2 mm, màu vàng chanh, là đặc trưng khuẩn lạc của vi khuẩn Xanthomonnas oryzae để cấy truyền. Bảo quản Isolate đã phân lập trên môi trường Skim milk. Phương pháp xác định vi khuẩn bạc lá bằng kỹ thuật PCR: tiến hành chiết xuất AND của vi khuẩn. Nhân gen PCR bằng mồi đặc hiệu để nhận biết đoạn trình tự 16S – 13S rDNA có mặt đặc thù trong DNA vi khuẩn bạc lá với trình tự mồi đặc hiệu. XOR-F:5’- CATGACGTCATCGTCCTGT-3’ XOR-R2:5’-CTCGGAGCTATATGCCGTGC-3’ STT Tên m Trật tự mồi 1 XPC15 5’GACGGATCA3’ kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 2 XPC9 5’CTCACCGTCC3’ 3 OPAF-3 5’GAAGGAGGCA3’ 4 OPC8 5’TGGACCGGTG3’ 5 OPC10 5’TGTCTGGGTG3’ 6 PAG01 5’CTACGCCTTC3’ 7 OPB01 5’GTTTCGCTCC3’ 8 OPB02 5’TGATCCCTGG3’ 9 OPB10 5’CTGTGGGAC3’ 10 OPB14 5’TCCGCTCTGG3’ 11 OPB18 5’CCACCGCAGT3’ Điện di sản phẩm trên gel agarose 2% ở 65V, 150mA trong vòng 20 phút; Nhuộm bản gel bằng Ethilium bromide rồi chụp ảnh để xác định các Isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae. Xác định nhóm chủng tương đồng của vi khuẩn Xanthomonas oryzae nhờ kỹ thuật PCR (RAPD): sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để nhân các đoạn AND ngẫu nhiên trong bộ gennom vi khuẩn Xanthomonas oryzae Sau khi có kết quả điện di tiến hành xử lý số liệu bằng phần mềm NTSY spc2.0 III. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh, phân lập vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae trên môi trường và xác địnhvi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR Kết quả bảng 1 cho thấy, 70 mẫu bệnh bạc lá đã được thu thập trên nhiều giống lúa khác nhau từ nhiều địa phương khác nhau ở 3 vùng sinh thái chính của miền Bắc Việt Nam là miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng và Bắc Trung Bộ. Kết quả phân lập trên môi trường và căn cứ và hình thái khuẩn lạc cho thấy có 65 mẫu bệnh khi phân lập đã xác định có vi khuẩn Xanthomonas oryzae là nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa. Có 5 mẫu khi phân lập không thấy sự hiện diện của vi khuẩn Xanthomonas oryzae. Bằng kỹ thuật PCR đã xác định được 60 mẫu có vi khuẩn tương đồng với bộ genom của vi khuẩn Xanthomonas oryzae. 60 mẫu xác định có Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật PCR hoàn toàn trùng lặp với kết quả phân lập trên môi trường nhân tạo. Bảng 1. Kết quả thu thập mẫu bệnh, phân lập trên môi trường và xác định vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật PCR TT Mã số Vùng sinh thái Địa điểm thu thập Tên giống thu thập Kết quả phân lập trên môi trường Kết quả xác định bằng PCR 1 H16 Mi ền núi phía Bắc Kim Sơn, Đông Triều, Quảng Ninh Nếp + + 2 H17 Kim Sơn, Đông Triều, Quảng Ninh Khang dân + + 3 H18 Kim Sơn, Đông Triều, Quảng Ninh Khang dân + + 4 H25 Hập Hải, Lâm Thao, Phú Thọ Việt lai 20 + + 5 H26 Cao Mại, Lâm Thao, Phú Thọ Bắc thơm 7 + + 6 H32 Cao Mại, Lâm Thao, Phú Thọ Thục hưng + + 7 H33 Cao Mại, Lâm Thao, Phú Thọ Việt lai 20 + + 8 H37 TT. Lâm Thao, Phú Thọ Việt lai 20 + + 9 H27 TT. Lâm Thao, Phú Thọ Khang dân + + 10 H29 Việt Trì, Phú Thọ Bắc thơm 7 + - 11 H34 Việt Trì, Phú Thọ Khang dân + + 12 H31 Việt Trì, Phú Thọ Q5 + + 13 H28 Mê Linh, Vĩnh Phúc Bắc thơm 7 + + 14 H30 Yên Lập, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc Bắc thơm 7 + + 15 H35 Nghĩa Hưng, Vĩnh Tường, Vĩnh Phúc Q5 + + 16 H36 Vĩnh Yên, Vĩnh Phúc Q5 + + kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 TT Mã số Vùng sinh thái Địa điểm thu thập Tên giống thu thập Kết quả phân lập trên môi trường Kết quả xác định bằng PCR 17 H1 Đồng bằng sông Hồng Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Bắc thơm 7 + + 18 H2 Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Khang dân + + 19 H10 Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Khang dân + - 20 H11 Cổ Loa, Đông Anh, Hà Nội Bắc thơm 7 + + 21 H6 Xuân Nộn, Đông Anh, Hà Nội Khang dân + + 22 H7 Xuân Canh, Đông Anh, Hà Nội Bắc thơm 7 + + 23 H9 Đông Anh, Hà Nội Khang dân + - 24 H8 Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội Bắc thơm 7 + + 25 H4 Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội Khang dân + - 26 H5 Tiên Dược, Sóc Sơn, Hà Nội Bắc thơm 7 + + 27 H3 Trung Rã, Sóc Sơn, Hà Nội Khang dân + + 28 H19 Anh Dũng, Kiến Thụy, Hải Phòng Nếp + + 29 H20 Anh Dũng, Kiến Thụy, Hải Phòng HT1 - + 30 H23 Anh Dũng, Kiến Thụy, Hải Phòng Bắc thơm 7 + + 31 H24 Kiến Thụy, Hải Phòng Bắc thơm 7 + + 32 H21 Đông Tiến, Quỳnh Phụ, Thái Bình Q5 + + 33 H22 Đông Tiến, Quỳnh Phụ, Thái Bình Nếp 87 + + 34 H38 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Q5 + + 35 H44 Phố Tăng, Đông Hưng, Thái Bình Q5 + - 36 H45 Phố Tăng, Đông Hưng, Thái Bình Nếp 87 + + 37 H46 Phố Tăng, Đông Hưng, Thái Bình Bắc thơm 7 + + 38 H50 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Hương cốm + + 39 H53 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Bắc thơm 7 + + 40 H54 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Nếp + + 41 H59 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình Bắc thơm 7 + + 42 H61 Đông Mỹ, Đông Hưng, Thái Bình NR11 + + 43 H48 Hồng Lĩnh, Hưng Hà, Thái Bình Q5 + + 44 H60 Vũ Hội, Vũ Thư ,Thái Bình Tạp giao + + 45 H49 Hồng Lĩnh, Hưng Hà, Thái Bình Bắc thơm 7 + + 46 H39 Xuân Thượng, Xuân Trường, Nam Định Tạp giao + + 47 H47 Xuân Thượng, Xuân Trường, Nam Định Tám thơm + + 48 H51 Xuân Thượng, Xuân Trường, Nam Định Nếp 87 + + 49 H40 Liêm Hải, Trực Ninh, Nam Định Tạp giao + + 50 H43 Nam Hồng, Trực Ninh, Nam Định Bắc thơm 7 + + 51 H52 Cổ Lễ, Trực Ninh, Nam Định Tám + + 52 H55 Nam Hồng, Trực Ninh, Nam Định Tạp giao + + 53 H62 Nam Hồng, Trực Ninh, Nam Định Nếp 87 + + 54 H63 Nam Xá, Trực Ninh, Nam Định Nhị ưu 838 + + 55 H41 Nam Xá, Trực Ninh, Nam Định Tạp giao + - 56 H64 Việt Hùng, Trực Ninh, Nam Định Tạp giao + + 57 H56 Cầu Thọ, Bình Lục, Nam Định C71 + + kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 TT Mã số Vùng sinh thái Địa điểm thu thập Tên giống thu thập Kết quả phân lập trên môi trường Kết quả xác định bằng PCR 58 H57 Mĩ Thuận, Bình Lục, Nam Định CR203 + + 59 H58 Mĩ Thuận, Bình Lục, Nam Định Nếp + + 60 H12 An Bình, Nam Sách, Hải Dương Q5 + + 61 H13 An Bình, Nam Sách, Hải Dương N46 + + 62 H14 Quốc Tuấn, Nam Sách, Hải Dương Q5 + + 63 H15 Cộng Hòa, Chí Linh, Hải Dương Bắc thơm 7 + + 64 H42 TT. Nhương Bằng, Hưng Yên Nếp + + 65 H65 Bắc Trung Bộ Quảng Sương, Thanh hóa Việt lai20 + + 66 H67 Quảng Sương, Thanh Hóa HT1 - - 67 H68 Đại Khối, Đông Sơn, Thanh Hóa HT1 - - 68 H69 Đại Khối, Đông Sơn, Thanh Hóa Khang dân - - 69 H70 Thành phố Thanh Hóa TH3-3 - - Ghi chú: + Phân lập thành công, kiểm tra PCR đúng là vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa - Phân lập không thành công, kiểm tra PCR không phải là vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Ghi chú: Những giếng có vệt sáng là AND được nhân lên của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae Hình 1: Hình ảnh chạy điện di phát hiện vi khuẩn gây bệnh bạc lá 3.2. Xác định các nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa Để xác định các nhóm chủng, đã chọn 47 isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae có độc tính cao trong số 60 isolate đã được xác định là Xanthomonas oryzae. Qua phân tích bằng 10 đoạn mồi khác nhau để nhân các đoạn AND trong bộ genom của vi khuẩn Xanthomonas oryzae cho thấy có 4 mồi cho các băng đa hình là XPC15, PAG01, XPC9 và OPEF3. Các mồi còn lại hoặc là không nhân lên được đoạn AND nào hoặc là chỉ có 1 đoạn, không có ý nghĩa trong việc xác định đa hình AND. Những mồi đa hình được ghi lại số băng, trong đó có vệt băng là 1 và không có vệt băng là 0. Mồi XPC9 va XPC15 nhân được 3 đoạn AND trong bộ genom vi khuẩn; mồi OPAF3 nhân được 4 đoạn, còn mồi PAG1 nhân được 5 đoạn. Sử dụng phần mềm NTSYS 2.0 đã cho cây phân loại của 47 isolate. Từ cây phân loại 1 và 2 và ở mức tương đồng 0,7 47 isolate vi khuẩn được chia thành 13 nhóm đại diện cho 13 nhóm chủng trong 47 isolate phân tích (Hình 1 và 2). Số liệu phân tích trên bảng 2 cho thấy trong số kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 13 nhóm chủng, nhóm 2 và 3 phổ biến nhất (mỗi nhóm chiếm 14,89%); Nhóm chủng 1, 4, 5. 7,8,9 chiếm tỷ lệ trung bình (từ 6,38 – 8,51%); Nhóm chủng 10, 11, 12 và 13 chiếm tỷ lệ ít nhất (2,12 – 4,25%). Sự phân bố của các nhóm chủng ở các địa phương khá đa dạng, thường đan xen. Một chủng phân bố ở nhiều địa phương, một địa phương có sự hiện diện của nhiều nhóm chủng. Do đặc điểm này cần bố trí cơ cấu giống lúa đa dạng với đặc điểm di truyền, đa dạng về tính kháng để hạn chế tác hại của bệnh. Bảng 2. Các nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae và sự phân bố của chúng ở các địa phương Nhóm chủng Các isolate Tỷ lệ (%) Địa điểm phân bố 1 H1, H19, H39, H49 8,51 Hà Nội, Hải Phòng, Nam Định, Thái Bình 2 H12, H32, H34, H21, H26, H40, H59 14,89 Hải Dương, Phú Thọ, Thái Bình, Nam Định 3 H2, H3, H5, H42, H52, H61, H65 14,89 Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Thái B ình, Thanh Hóa 4 H27, H63, H64 6,38 Phú Thọ, Nam Định 5 H22, H41, H55 6,38 Thái Bình, Nam Định 6 H7, H8, H18, H47, H53 10,63 Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định, Thái Bình 7 H14, H23, H38, H50 8,51 Hải Dương, Hải Phòng, Thái Bình 8 H16, H36, H60 6,38 Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Thái Bình 9 H24, H28, H54 6,38 Hải Phòng, Vĩnh Phúc, Thái Bình 10 H17, H35 4,25 Quảng Ninh, Vĩnh Phúc 11 H25 2,12 Phú Thọ 12 H11, H13, H15, H30 8,51 Hà Nội, Hải Dương, Vĩnh Phúc 13 H31 2,12 Nam Định kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 Coefficient 0.5 0.6 0.7 0.8 1.0 1 19 12 32 34 21 26 2 3 5 27 22 7 8 18 14 23 38 16 36 24 28 17 35 25 11 13 15 30 31 Hình 1. Cây phân loại 30 isolate vi khuẩn bạc lá Coefficient 0.52 0.62 0.72 0.83 0.93 39 49 40 59 42 52 61 65 63 64 41 55 47 53 350 60 54 Hình 2. Cây phân loại 17 isolate vi khuẩn gây bệnh bạc lá kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 Hình 3. Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi XOP15 Hình 4. Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi APG01 Hình 5. Điện di sản phẩm RAPD sử dụng mồi XPC9 kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 4/2008 IV. Kết luận - Dựa vào đặc điểm hình thái của khuẩn lạc trên môi trường nhân tạo và phân tích bằng ký thuật PCR đã xác định được 60 isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae trong số 69 mẫu bệnh bạc lá lúa thu thập từ một số vùng trồng lúa. - Phân tích 47 isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae thu thập từ địa phương ở miền Bắc Việt nam đã xác định được 13 nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá lúa. Trong số 13 nhóm, nhóm 2 và 3 phổ biến nhất (mỗi nhóm chiếm 14,89%). - Các nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá phân bố đan xen, 1 nhóm chủng có thể xuất hiện ở nhiều địa phương, 1 địa phương có thể có nhiều nhóm chủng. Để hạn chế tác hại của bệnh cần đa dạng nguồn gen lúa và bố trí đa dạng các giống kháng trong một vùng. Tài LIệU THAM KHảO 1. Phan Hữu Tôn, Bùi Trọng Thuỷ. Khả năng gây nhiễm của các chủng bệnh bạc lá lúa miềm Bắc Việt Nam. Hội thảo Quốc gia bệnh cây và sinh học phân tử. ĐH Nông nghiệp 1, 23-25/10/2003. NXB NN, 2003. 78-86. 2. Nguyễn Văn Viết và CTV. Một số kết quả nghiên cứu thành phần nhóm nòi sinh lý vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae ở miền Bắc hiện nay và xác định nguồn gen kháng bệnh giai đoạn 199-2001. Kỷ yếu hội thảo Quốc gia về khoa học công nghệ bảo vệ thực vật. NXB NN, 2002.104-110. . học BVTV - Số 4/2008 Sự ĐA DạNG DI TRUYềN MộT Số CHủNG VI KHUẩN Xanthomonas oryzae GÂY BệNH BạC Lá LúA ở MIềN BắC VI T NAM Genetic pathogenicity of the strain of Xanthomonas oryzae caused. nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá có độc tính cao và có sự đa dạng về chủng rất lớn. Sau đây là kết quả nghiên cứu xác định nhóm chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Vi t Nam. . vi khuẩn Xanthomonas oryzae trong số 69 mẫu bệnh bạc lá lúa thu thập từ một số vùng trồng lúa. - Phân tích 47 isolate vi khuẩn Xanthomonas oryzae thu thập từ địa phương ở miền Bắc Vi t nam