BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BIỆN THỊ LAN THANH ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 (Pineapple mealybug wilt associated virus-1) GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 (Pineapple mealybug wilt associated virus-1) GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn TS TRẦN THỊ DUNG CN LƢU PHÚC LỢI Sinh viên thực BIỆN THỊ LAN THANH KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY  RT-PCR APPLICATION ON FINDING PMWaV-1 (Pineapple mealybug wilt associated virus-1) CAUSING WILT DISEASE OF CAYENNE PINEAPPLE PLANTS GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor PhD TRAN THI DUNG BA LUU PHUC LOI HCMC, 09/2006 Student BIEN THI LAN THANH TERM: 2002 - 2006 LỜI CẢM ƠN  Xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm Tp Hồ chí Minh tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập trường * TS Trần Thị Dung CN Lưu Phúc Lợi hết lịng hướng dẫn động viên tơi q trình thực khóa luận * Thầy Trần Ngọc Tống anh thuộc khu thực nghiệm khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp HCM * Các anh chị phụ trách phòng CNSH thực vật thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh Đại học Nơng Lâm Tp HCM * Chị Trương Bùi Nguyệt Hảo, anh Nguyễn Phú Dũng, chị Tôn Bảo Linh giúp đỡ góp ý cho tơi q trình làm đề tài * Các bạn bè thân yêu lớp CNSH28 bên tôi, giúp đỡ động viên thời gian thực khóa luận Thành kính ghi ơn ba mẹ người thân gia đình tạo điều kiện động viên suốt q trình học tập trường Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Biện Thị Lan Thanh i TÓM TẮT BIỆN THỊ LAN THANH – Lớp DH02SH, Đại học Nông Lâm Tp HCM Đề tài “Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne” hướng dẫn TS Trần Thị Dung CN Lưu Phúc Lợi thực Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh khu thực nghiệm khoa Nông học Đại học Nông Lâm Tp HCM Đối tượng nghiên cứu đề tài virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne Nội dung nghiên cứu gồm: * Kiểm tra virus PMWaV-1 dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng qua xử lý nhiệt 370C thời gian 40 ngày 50 ngày kỹ thuật RTPCR * Khảo sát tăng trưởng dứa in vitro virus PMWaV-1 chồi dứa nhân giống vơ tính khác vườn ươm * Kiểm tra virus PMWaV-1 dứa in vitro chồi dứa nhân giống vơ tính khác sau 70 ngày trồng vườn ươm Các kết thu được: * Tỉ lệ dứa in vitro virus PMWaV-1 thời gian xử lý nhiệt 40 ngày 77,78%; thời gian xử lý nhiệt 50 ngày 88,89% * Cây dứa in vitro tăng trưởng chiều cao chậm so với chồi dứa nhân giống vơ tính khác * Chồi dứa tạo từ thân chẻ có số nhiều nhất, chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh, dứa in vitro, cuối chồi dứa tạo cách giâm * Sau 70 ngày trồng vườn ươm, 100% dứa in vitro kiểm tra virus PMWaV-1, tỉ lệ nhiễm virus PMWaV-1 chồi dứa nhân giống đồng 14,81% ii MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Danh sách chữ viết tắt ix Phần GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu đề tài 1.3 Giới hạn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm thực vật học dứa 2.2 Các nhóm dứa 2.2.1 Nhóm Cayenne 2.2.2 Nhóm Queen 2.2.3 Nhóm Tây Ban Nha 2.3 Các giống dứa phổ biến Việt Nam 2.4 Bệnh héo virus 2.4.1 Tác hại 2.4.2 Nguyên nhân gây bệnh 2.4.3 Triệu chứng 2.4.4 Tác nhân lây truyền bệnh 2.4.5 Cách phòng trị 10 2.5 Phương pháp tạo virus 11 2.5.1 Cơ sở phương pháp tạo virus 11 2.5.2 Các phương pháp tạo virus 11 2.6 Các phương pháp nhân giống dứa 14 iii 2.6.1 Nhân giống phương pháp nuôi cấy mô 14 2.6.2 Nhân giống cách kích thích chồi ngủ phát triển 15 2.7 Gene hsp-70 PMWaV 16 2.8 Một số phương pháp giám định virus thực vật 17 2.8.1 Phương pháp dùng kính hiển vi điện tử 17 2.8.2 Các phương pháp sinh học phân tử 17 2.9 Các phương pháp phát PMWaV 20 2.10 Một số nghiên cứu bệnh héo đỏ đầu giới Việt Nam 20 Phần NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Nội dung, thời gian địa điểm 23 3.1.1 Nội dung 23 3.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 3.2 Nội dung 1: Kiểm tra virus PMWaV-1 dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng qua xử lý nhiệt 23 3.2.1 Vật liệu 23 3.2.2 Hóa chất 24 3.2.3 Cách tiến hành 25 3.2.3.1 Ly trích RNA tổng số 25 3.2.3.2 Phản ứng RT-PCR 27 3.2.3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR 28 3.2.3.4 Nhân giống dứa in vitro virus PMWaV-1 phịng thí nghiệm 29 3.3 Nội dung 2: Khảo sát tăng trưởng dứa in vitro virus PMWaV-1 dứa tạo phương pháp vô tính khác 30 3.3.1 Vật liệu 30 3.3.2 Cách tiến hành 30 3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi 33 3.4 Nội dung 3: Kiểm tra virus PMWaV-1 dứa Cayenne sau trồng 70 ngày vườn ươm 33 3.4.1 Mẫu kiểm tra 33 3.4.2 Thiết bị, dụng cụ cách tiến hành 33 Phần KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 34 iv 4.1 Kết kiểm tra virus PMWaV-1 dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng qua xử lý nhiệt 34 4.2 Khảo sát tăng trưởng dứa in vitro virus PMWaV-1 so với dứa tạo phương pháp nhân giống vơ tính khác 35 4.2.1 Chiều cao 35 4.2.2 Số 37 4.3 Kiểm tra virus PMWaV-1 dứa Cayenne sau 70 ngày trồng vườn ươm 39 Phần KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 41 5.1 Kết luận 41 5.2 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC v DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Các mẫu dứa in vitro tái sinh từ ĐST kiểm tra PMWaV-1 kỹ thuật RT-PCR 24 Bảng 3.2 Thành phần mix phản ứng RT-PCR 27 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 28 Bảng 4.1 Kết kiểm tra PMWaV-1 dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng qua xử lý nhiệt 34 Bảng 4.2 Chiều cao chồi dứa sau 20 ngày trồng 35 Bảng 4.3 Chiều cao chồi dứa sau 30 ngày trồng 36 Bảng 4.4 Chiều cao chồi dứa sau 40 ngày trồng 36 Bảng 4.5 Số chồi dứa sau 20 ngày trồng 37 Bảng 4.6 Số chồi dứa sau 30 ngày trồng 38 Bảng 4.7 Số chồi dứa sau 40 ngày trồng 38 Bảng 4.8 Kết kiểm tra PMWaV-1 chồi dứa sau 70 ngày trồng vườn ươm 39 vi DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây dứa Cayenne Hình 2.2 Cây dứa bị bệnh héo đỏ đầu Hình 2.3 Quả dứa bị héo đỏ đầu Hình 2.4 Rệp hồng (Dysmicoccus brevipes) rệp xám (D neobrepes) 10 Hình 2.5 Sự cộng sinh kiến đầu to (Pheidole megacephala) rệp sáp 10 Hình 2.6 Phản ứng PCR 18 Hình 2.7 Phản ứng RT-PCR 19 Hình 3.1 Hom thân chẻ dọc trước giâm 30 Hình 3.2 Hom thân cắt khoanh trước giâm 31 Hình 3.3 Hom trước giâm 31 Hình 3.4 Chồi dứa sau 40 ngày giâm 32 Hình 3.5 Chồi dứa tách từ hom thân chẻ 32 Hình 3.6 Chồi dứa tách từ hom thân cắt khoanh 32 Hình 3.7 Chồi dứa tách từ hom 32 Hình 3.8 Cây dứa in vitro 32 Hình 3.9 Chồi dứa trồng vườn ươm 33 Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm RT-PCR mẫu dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng qua xử lý nhiệt 34 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm RT-PCR mẫu dứa sau 70 ngày trồng vườn ươm 40 vii 34 Giếng 1, 2, 3: giống Trung Quốc, Thái Lan, Lâm Đồng thời gian xử lý nhiệt 40 ngày Giếng 4, 5, 6: giống Trung Quốc, Lâm Đồng, Thái Lan thời gian xử lý nhiệt 50 ngày Kết Bảng 4.1 cho thấy việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp với xử lý nhiệt 370C 40 ngày 50 ngày thấy diện virus PMWaV-1 Ở thời gian xử lý nhiệt 40 ngày, tỉ lệ virus PMWaV-1 77,78% (7/9); thời gian xử lý nhiệt 50 ngày, tỉ lệ virus PMWaV-1 88,89% (8/9) Tỉ lệ virus thời gian xử lý nhiệt 50 ngày cao 40 ngày 4.2 Khảo sát tăng trƣởng dứa in vitro virus PMWaV-1 dứa đƣợc tạo phƣơng pháp nhân giống vơ tính khác 4.2.1 Chiều cao Bảng 4.2 Chiều cao chồi dứa sau 20 ngày trồng Chiều cao (cm) Phƣơng pháp nhân giống Trung bình TQ TL LĐ In vitro 7.58 7.76 7.68 7.67 Thân chẻ 8.13 7.82 8.08 8.01 Thân cắt khoanh 8.45 7.93 8.73 8.37 Giâm 7.83 7.94 7.73 7.83 Trung bình 8.00 7.86 8.06 7.97 Kết Bảng 4.2 cho thấy chồi dứa có chiều cao nhìn chung biến động khoảng 7.58 – 8.73 cm Xét theo phương pháp nhân giống, chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh có chiều cao trung bình cao đạt 8.37 cm, chồi dứa tạo từ thân chẻ đạt 8.01 cm, chồi dứa tạo cách giâm đạt 7.83 cm cuối dứa in vitro đạt 7.67 cm Xét theo giống, chồi dứa giống Lâm Đồng có chiều cao trung bình cao đạt 8.06 cm, chồi dứa giống Trung Quốc, cuối chồi dứa giống Thái Lan 35 Bảng 4.3 Chiều cao chồi dứa sau 30 ngày trồng Chiều cao (cm) Phƣơng pháp nhân giống Trung bình TQ TL LĐ In vitro 7.86 8.06 7.95 7.96 Thân chẻ 8.88 8.26 8.48 8.54 Thân cắt khoanh 9.30 8.65 9.06 9.00 Giâm 8.45 8.52 8.43 8.47 Trung bình 8.62 8.37 8.48 8.49 Kết Bảng 4.3 cho thấy chồi dứa có chiều cao nhìn chung biến động khoảng 7.86 – 9.30 cm Xét theo phương pháp nhân giống, chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh có chiều cao trung bình cao đạt 9.00 cm, chồi dứa tạo từ thân chẻ đạt 8.54 cm, chồi dứa tạo cách giâm đạt 8.47 cm, cuối dứa in vitro đạt 7.67 cm Xét theo giống, chồi dứa giống Trung Quốc có chiều cao trung bình cao đạt 8.62 cm, chồi dứa giống Lâm Đồng đạt 8.48 cm, cuối chồi dứa giống Thái Lan đạt 8.37 cm Bảng 4.4 Chiều cao chồi dứa sau 40 ngày trồng Chiều cao (cm) Phƣơng pháp nhân giống Trung bình TQ TL LĐ In vitro 8.52 8.75 8.61 8.63 Thân chẻ 9.72 8.95 9.12 9.26 Thân cắt khoanh 9.98 8.93 10.26 9.72 Giâm 8.91 9.02 8.82 8.92 Trung bình 9.28 8.91 9.20 9.13 Kết Bảng 4.4 cho thấy chồi dứa có chiều cao nhìn chung biến động khoảng 8.52 – 10.26 cm Xét theo phương pháp nhân giống, chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh có chiều cao trung bình cao đạt 9.72 cm, chồi dứa tạo từ thân chẻ đạt 9.26 cm, chồi dứa tạo cách giâm đạt 8.92 cm, cuối dứa in vitro đạt 8.63 cm Xét theo giống, chồi dứa giống Trung Quốc 36 có chiều cao trung bình cao đạt 9.28 cm, chồi dứa giống Lâm Đồng đạt 9.20 cm, cuối chồi dứa giống Thái Lan đạt 8.91 cm Cây dứa in vitro ni cấy phịng thí nghiệm với điều kiện lý tưởng nên đem trồng vườn ươm cần có thời gian để thích nghi với điều kiện Do đó, dứa in vitro tăng trưởng chiều cao chậm so với chồi dứa nhân giống đồng Khả bật thành chồi mầm ngủ chồi yếu mầm ngủ thân Do đó, tách chồi trồng vườn ươm chồi tạo cách giâm tăng trưởng chiều cao chậm so với chồi tạo từ thân 4.2.2 Số Bảng 4.5 Số chồi dứa sau 20 ngày trồng Số Phƣơng pháp nhân giống Trung bình TQ TL LĐ In vitro 15.01 14.18 14.32 14.50 Thân chẻ 15.23 14.37 15.01 14.87 Thân cắt khoanh 15.79 13.25 14.58 14.54 Giâm 12.67 12.74 12.86 12.76 Trung bình 14.68 13.64 14.19 14.17 Kết Bảng 4.5 cho thấy chồi dứa có số nhìn chung biến động khoảng 12.67 – 15.79 Xét theo phương pháp nhân giống, chồi dứa tạo từ thân chẻ có số trung bình cao đạt 14.87 lá, chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh đạt 14.54 lá, in vitro đạt 14.50 lá, cuối chồi dứa tạo cách giâm đạt 12.76 Xét theo giống, chồi dứa giống Trung Quốc có số trung bình cao đạt 14.68 lá, chồi dứa giống Lâm Đồng đạt 14.19 lá, cuối chồi dứa giống Thái Lan đạt 13.64 37 Bảng 4.6 Số chồi dứa sau 30 ngày trồng Số Phƣơng pháp nhân giống Trung bình TQ TL LĐ In vitro 17.13 16.25 16.65 16.68 Thân chẻ 17.65 16.13 17.28 17.02 Thân cắt khoanh 18.01 15.25 17.24 16.83 Giâm 14.12 14.57 14.72 14.47 Trung bình 16.73 15.55 16.47 16.25 Kết Bảng 4.6 cho thấy chồi dứa có số nhìn chung biến động khoảng 14.12 – 18.01 Xét theo phương pháp nhân giống, chồi dứa tạo từ thân chẻ có số trung bình cao đạt 17.02 lá, chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh đạt 16.83 lá, in vitro đạt 16.68 lá, cuối chồi dứa tạo cách giâm đạt 14.47 Xét theo giống, chồi dứa giống Trung Quốc có số trung bình cao đạt 16.73 lá, chồi dứa giống Lâm Đồng đạt 16.47 lá, cuối chồi dứa giống Thái Lan đạt 15.55 Bảng 4.7 Số chồi dứa sau 40 ngày trồng Số Phƣơng pháp nhân giống Trung bình TQ TL LĐ In vitro 19.25 18.27 18.65 18.72 Thân chẻ 19.87 18.53 19.37 19.26 Thân cắt khoanh 20.16 17.58 19.53 19.09 Giâm 16.79 16.95 16.87 16.87 Trung bình 19.02 17.83 18.61 18.49 Kết Bảng 4.7 cho thấy chồi dứa có số nhìn chung biến động khoảng 16.79 – 20.16 Xét theo phương pháp nhân giống, chồi dứa tạo từ thân chẻ có số trung bình cao đạt 19.26 lá, chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh đạt 19.09 lá, in vitro đạt 18.72 lá, cuối chồi dứa tạo cách giâm đạt 16.87 Xét theo giống, chồi dứa giống Trung Quốc có số trung bình 38 cao đạt 19.02 lá, chồi dứa giống Lâm Đồng đạt 18.61 lá, cuối chồi dứa giống Thái Lan đạt 17.83 4.3 Kiểm tra virus PMWaV-1 dứa Cayenne sau 70 ngày trồng vƣờn ƣơm Bảng 4.8 Kết kiểm tra PMWaV-1 chồi dứa sau 70 ngày trồng vườn ươm Giống Phƣơng pháp nhân giống PMWaV-1 + - TQ in vitro 0/3 3/3 TL in vitro 0/3 3/3 LĐ in vitro 0/3 3/3 TQ thân chẻ 1/3 2/3 TL thân chẻ 0/3 3/3 LĐ thân chẻ 1/3 2/3 TQ thân cắt khoanh 1/3 2/3 TL thân cắt khoanh 1/3 2/3 LĐ thân cắt khoanh 0/3 3/3 TQ giâm 0/3 3/3 TL giâm 0/3 3/3 LĐ giâm 0/3 2/3 L (+) (-) 500 bp 10 11 12 589 bp Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm RT-PCR mẫu dứa sau 70 ngày trồng vườn ươm 39 Ghi chú: L: ladder (+): đối chứng dương (-): đối chứng âm Giếng 1, 2, 3: chồi dứa thân chẻ giống TQ, TL, LĐ Giếng 4, 5, 6: dứa in vitro giống TQ, TL, LĐ Giếng 7, 8, 9: chồi dứa thân cắt khoanh giống TQ, TL, LĐ Giếng 10, 11, 12: chồi dứa giâm giống TQ, TL, LĐ Kết Bảng 4.8 cho thấy sau 70 ngày trồng vườn ươm, tỉ lệ tái nhiễm virus PMWaV-1 dứa in vitro 0% (0/9) Tỉ lệ nhiễm virus PMWaV-1 dứa nhân giống đồng 14,81% (4/27) Hiện nay, bệnh héo đỏ đầu xuất nước ta với mật độ rộng tỉ lệ cao, nhân giống dứa thân chồi khả nhiễm virus PMWaV-1 chồi dứa tạo cao Do đó, sử dụng dứa in vitro làm thương phẩm mang lại hiệu kinh tế cao chồi dứa nhân giống đồng 40 Phần KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đưa số kết luận sau: Kiểm tra virus PMWaV-1 dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng qua xử lý nhiệt Cây dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng qua xử lý nhiệt 370C 40 ngày 50 ngày diện virus PMWaV-1 Tỉ lệ virus PMWaV-1 thời gian xử lý nhiệt 40 ngày, 77,78%; thời gian xử lý nhiệt 50 ngày 88,89% Khảo sát tăng trƣởng dứa in vitro virus PMWaV-1 dứa nhân giống phƣơng pháp vô tính khác Cây dứa in vitro tăng trưởng chiều cao chậm so với dứa tạo phương pháp vơ tính khác Chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh tăng trưởng chiều cao nhanh nhất, chồi dứa tạo từ thân chẻ 4, chồi dứa tạo cách giâm lá, cuối dứa in vitro Chồi dứa giống Trung Quốc tăng trưởng chiều cao nhanh nhất, giống Lâm Đồng, cuối giống Thái Lan Chồi dứa tạo từ thân chẻ có số nhiều nhất, chồi dứa tạo từ thân cắt khoanh, dứa in vitro, cuối chồi dứa tạo cách giâm Chồi dứa thuộc giống Trung Quốc có số nhiều nhất, giống Lâm Đồng, cuối giống Thái Lan Kiểm tra virus PMWaV-1 dứa Cayenne sau 70 ngày trồng vƣờn ƣơm Sau 70 ngày trồng vườn ươm, 100% dứa in vitro kiểm tra virus PMWaV-1, tỉ lệ nhiễm virus PMWaV-1 chồi dứa nhân giống đồng 14,81% 41 5.2 Đề nghị Với kết luận trên, đưa số đề nghị để tiếp tục phát triển hiệu đề tài: Tiếp tục nghiên cứu mức nhiệt độ cao hơn, thời gian xử lý nhiệt khác để tăng tỉ lệ virus PMWaV-1 Đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ thời gian xử lý lên tái sinh dứa Kiểm tra virus PMWaV-1 PMWaV-2 chồi dứa thương phẩm Áp dụng mơ hình phịng trừ bệnh héo đỏ đầu sau: Xử lý nhiệt chồi dứa để khử PMWaV Kiểm tra chồi xử lý nhiệt để xác định mẫu PMWaV Nhân nhanh mẫu virus phương pháp nuôi cấy mô để tạo nguồn chồi giống bệnh, cung cấp cho người trồng 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông Thôn, Ngân hàng phát triển Châu Á, Viện Nghiên cứu ăn miền Nam, 2003 Sổ tay kỹ thuật trồng chăm sóc số ăn miền Trung miền Nam Nhà xuất Nông Nghiệp Bùi Trang Việt, 2002 Sinh học phân tử Đại học Quốc Gia Tp HCM Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, 2005 Hướng dẫn trồng trang trại dứa – đu đủ Nhà xuất Lao Động Hà Nội Huỳnh Văn Chánh, 2002 Nhân giống dứa Smooth Cayenne phương pháp giâm hom thân, giâm hom chồi hủy đỉnh sinh trưởng Luận Văn tốt nghiệp kỹ sư trồng trọt Đại Học Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Văn Kế, 2002 Cây ăn nhiệt đới (tập 2) Nhà xuất Nông Nghiệp Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002 Công nghệ tế bào Nhà xuất Đại học Quốc Gia Tp HCM Nguyễn Thị Lang, 2002 Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học Nhà xuất Nông Nghiệp Tp HCM Nguyễn Phú Dũng, 2005 Xây dựng quy trình phát virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu (Mealybug wilt) dứa Cayenne kỹ thuật RTPCR Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm Tp HCM Phan Gia Tân, 1984 Cây dứa kỹ thuật trồng dứa miền Nam Nhà xuất Tp Hồ Chí Minh 98 trang 10 Phạm Văn Khánh, 2003 Điều tra bệnh dứa Đức Trọng – Lâm Đồng nông trường Thọ Vực – Xuân Lộc – Đồng Nai Luận văn tốt nghiệp kỹ sư trồng trọt Đại học Nơng Lâm – Tp Hồ Chí Minh 11 Trần Thế Tục Vũ Mạnh Hải, 2001 Kỹ thuật trồng dứa Nhà xuất Nông Nghiệp 158 trang 12 Tôn Bảo Linh, 2005.Nghiên cứu tạo dứa Cayenne in vitro virus gây bệnh héo đỏ đầu (PMWaV – Pineapple meallybug wilt associated virus) Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm Tp HCM 43 13 Võ Thị Thúy Huệ, 2003 Điều tra tình hình bệnh hại dứa (Ananas comosus) huyện Bến Lức – Long An huyện Bình Chánh – Tp Hồ Chí Minh Luận văn tốt nghiệp kỹ sư trồng trọt Đại học Nông Lâm – Tp Hồ Chí Minh 14 Võ Thị Mỹ Hân, 2004 Điều tra tình hình bệnh hại dứa (Ananas comosus) huyện Tân Phước - Tiền Giang Luận văn tốt nghiệp kỹ sư nông nghiệp Đại học Nơng Lâm – Tp Hồ Chí Minh TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 15 Gunasinghe U.B., German T.L., 1989 Purification and partial charaterization of a virus from pineapple Phytopathology 79:1337-1341 16 Hu J.S., Sether D., and Ullman D.E.,1996 Detection of pineapple closterovirus in pineapple plants and mealybug using monoclonal antibodies Plant pathology 42: 829 – 836 17 Hu J.S., Sether D.M., Liu X.P., and Wang M., 1997 Use of a Tissue blotting immunoassay to examine the distribution of pineapple closterovirus in Hawaii Plant disease 81 (10): 1150 – 1154 18 Hu J.S., Sether D.M., and Ullman D.E., 1998 Transmission of pineapple mealybug wilt – associated virus by two species of mealybug (Dysmicoccus spp.) Phytopathology 88: 1224 – 1230 19 Joseph Sambrook, David W Russell, 2001 Molecular cloning, vol 2, third edition, Cold Spring habor laboratory press, New York, USA 20 Kenneth G Rohrbach, John W Beardsley, Thomas L German, Neal J Reimer, and Wallace G Sanford, 1988 Mealybug wilt, Mealybugs and Ants on Pineapple Plant Dis 72 (7) 21 Melzer, M J., Karasev, A V., Sether, D M., and Hu, J S., 2001 Nucleotide sequence, genome organization and phylogenetic analysis of pineapple mealybug wilt-associated virus-2 Journal of General Virology 82: 1-7 22 Pierik R.L.M., 1987 In Vitro Culture of Higher Plants Martinus Nijhoff Publishers 23 Sambrook J., and Russell D W., 2001 Molecular cloning, vol 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA 24 Sether, D.M., Karasev A.V., Okumura C., Arakawa C., Zee F., Kislan M.M., Busto J.L., and Hu J.S., 2001 Differentiation, distribution, and elimination of two different pineapple mealybug wilt – associated viruses found in pineapple Plant disease 85: 856 – 864 44 25 Sether, D.M., Hu J.S., 2002 Closterovirus infection and mealybug exposure are necessary for the development of mealybug wilt of pineapple disease Phytopathology 92: 928 – 935 26 Ullman D.E., German T.L., Gunashinge U.B., and Ebesu R.H., 1989 Serology of a closteroviruslike particle associated with mealybug wilt of pineapple Phytopathology 79: 1341 - 1345 27 Wakman W., Teakle D., Thomas J.E., and Dietzgen R.G., 1995 Presence of closterolike – virus and a bacilliform virus in pineapple plants in Queensland Aust J Agric Sci 46: 947 – 958 28 Webster Craig G., Wylie Stephen J., and Jones Michael G K., 2004 Diagnostic of plant viral pathogens Current Science, vol.86, No 12: 1604-1607 CÁC TRANG WEB http://www.bromeliadbiota.ifas.ufl.edu http://www2.ctahr.hawaii.edu/ t-star/mealybug.htm http://www.ctu.edu.vn/coursewares/supham/phanloaitv/ch5(4).htm www promega.com www biorad.com 45 PHỤ LỤC Các phƣơng pháp ly trích RNA thực vật (Nguyễn Thị Lang, 2002) Phương pháp 1 Cân g tươi để vào nitơ lỏng Nghiền cối cho bột màu xanh xuất hiện, thêm 20 ml phenol: chloroform: isoamyl alcohol (50:50:1) Bỏ mẫu vào tube 50 ml lắc 10 phút Ly tâm với vận tốc 5000 rpm 20 phút thu supernatant, thêm chloroform: isoamyl alcohol lắc phút Ly tâm với vận tốc 5000 rpm 20 phút Thêm chloroform lần thứ hai Thêm lượng tương đương isopropanol trộn vài lần, ủ nhiệt độ lạnh 20 phút Kết tủa dung dịch ly tâm vận tốc 500 rpm 20 phút 40C Pellet ml TE thêm 200 ml NaCl 5M 12,5 ml cồn lạnh, ủ đá 20 phút 10 Hòa tan dung dịch tube, thêm 0,25 thể tích urea 8M trộn, cộng thêm 0,25 thể tích LiCl2 10M Ủ qua đêm -200C 11 Chọn RNA để ly tâm 500 rpm 20 phút 40C Bỏ supernatant, lấy pellet hòa tan ml TE Tồn trữ điều kiện -700C Phương pháp Ly trích RNA thơng tin (mRNA) Cân 2g tươi nghiền nitơ lỏng Chuyển bột vào ống tube 50 ml, thêm tức khắc vào 15 ml lysis buffer (200mM NaCl, 200mM Tris pH 7,5, 1,5mM MgCl2 2% SDS) ủ nhiệt độ 450C 60 phút Mẫu ly tâm 4000 rpm phút 46 NaCl thêm vào (0,5M thêm 950µl stock NaCl 5M) Trộn đảo nhiều lần Supernatant (lysate) bỏ 3-4 lần thông qua giấy lọc đặc biệt để khơng cịn DNA Tế bào Oligo (dT) thêm vào lysate phút Mẫu lắc nhiệt độ phòng (60 phút) ly tâm 3000 rpm phút Cẩn thận di chuyển oligo (dT) resin rửa Cách rửa Oligo (dT) đựơc cột với buffer (500mM NaCl, 10mM Tris HCl pH 7,5 DEPC, ly tâm 3000 rpm phút Rửa nhiều lần với 10 ml binding buffer Sau rửa lấy 10 ml salt buffer (250mM NaCl, 10mM Tris HCl pH 7,5) ống nghiệm rửa DEPC Ly tâm lặp lại lần Hòa tan Để RNase tube thêm 20 µl elution buffer (10mM Tris HCl pH 7,5 DEPC) Chọn RNA thông tin thông qua ly tâm 30 giây Giai đoạn thêm 200 µl elution buffer thêm lần RNA kết tủa 0,15 thể tích sodium acetate 2M 2,5 thể tích cồn 100% Mẫu phơi khô đá (20 phút) Ly tâm 15 phút với vận tốc 15000 rpm 40C Di chuyển cồn cịn lại mRNA 20 µl elution buffer Mẫu dự trữ điều kiện -700C 47 Phƣơng pháp 5g tươi + nitơ lỏng Thêm 25 ml buffer Chuyển sang tube Thêm ml SDS 10% + 2,5 ml Natri acetate + 25 ml (P=C+IAA) Trộn Ủ phòng 15 phút Ly tâm 7500rpm 20 phút 0,8 thể tích propanol Ủ RNA Ly tâm 7500rpm 20 phút Kết tủa (pellet) hòa DEPC LiCl2 6M, ủ 40C qua đêm Ly tâm 7500rpm 20 phút Rửa RNA với LiCl2 2M cồn 70% Hòa DEPC RNA 48 PHỤ LỤC Thành phần mơi trƣờng khống (MS) dùng nuôi cấy dứa Cayenne Nguyên tố Nồng độ (mg/l) CaCl2 KNO3 170,00 1650,00 180,54 CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 H3BO3 6,20 KI 0,83 MnSO4.H2O 16,90 Na2MoO4.H2O 0,25 ZnSO4.H2O 8,60 Glycine 2,00 Myo-Inositol Vitamine & aminoacid KH2PO4 MgSO4.7H2O Nguyên tố vi lƣợng 1900,00 NH4NO3 Nguyên tố đa lƣợng 332,02 100 Nicotinic acid 0,50 Pyridoxine HCl 0,50 Thiamine-HCl 0,10 FeNaEDTA 36,70 ... NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR PHÁT HIỆN VIRUS PMWaV-1 (Pineapple mealybug wilt associated virus- 1) GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ TRÊN CÂY DỨA CAYENNE LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG... dứa Cayenne ngày mở rộng chuyên canh giống phải kiểm tra để đảm bảo chất lượng bệnh trước cung cấp cho khu vực trồng dứa Với đề tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ. .. BIỆN THỊ LAN THANH – Lớp DH02SH, Đại học Nông Lâm Tp HCM Đề tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR phát virus PMWaV-1 gây bệnh héo đỏ đầu dứa Cayenne? ?? hướng dẫn TS Trần Thị Dung CN Lưu Phúc Lợi thực Bộ môn