Tạp chí Khoa học 2011:17a 173-180 Trường Đại học Cần Thơ 173 TẠO DÒNG BIỂU HIỆN malQ TỪ ESCHERICHIA COLI K12 VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA ENZYM MalQ Trần Phương Lan 1 , Park Kwan-Hwa 2 và Park Jong-Tea 2 ABSTRACT The gene of malQ encoding 4-α-glucanotransferase (amylomaltase) is located in the malPQ operon of Escherichia coli K12. It has an open reading frame of 2082 nucleotides encoding 694 amino acid residues of a 72 kDa protein. In an effort to understand the function of this enzyme from E. coli, MalQ was overexpressed by constructing in pET29b. The optimal reaction condition of MalQ was at 37°C, in 200 mM sodium acetate buffer, pH 6.5. Keywords: 4-α-glucanotransferase, amylomaltase, E. coli K12, malQ Title: Cloning malQ from Escherichia coli K12 and Determination of Optimal Reaction Condition of MalQ TÓM TẮT Gen malQ giải mã enzym 4-α-glucanotransferase (amylomaltase) được định vị trong malPQ operon của Escherichia coli K12. Gen malQ có 2082 nucleotide mã hóa 694 amino acid hình thành protein có trọng lượng phân tử là 72 kDa. Để tìm hiểu đặc tính của enzym này từ E. coli, MalQ được biểu hiện bằng cách biến nạp trong vector pET29b. Điều kiện hoạt động tối thích của enzym MalQ được xác định ở nhiệt độ 37°C, pH 6.5 trong dung dịch sodium acetate 200 mM. Từ khóa: 4-α-glucanotransferase, amylomaltase, E. coli K12, malQ 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hệ thống maltose/maltodextrin của E. coli bao gồm 10 gen qui định kết hợp, điều khiển tổng hợp các protein liên quan đến hiệu quả sử dụng maltose và các maltodextrin như một nguồn carbon và năng lượng [2]. Trong tế bào chất, MalQ được biểu hiện với glucan phosphorylase và cả hai có vị trí trên cùng operon. Protein này được xác định là thành phần của hệ thống vận chuyển và sử dụng maltooligosaccharide [4]. Để hiểu và xác định đặc tính của MalQ, “Tạo dòng biểu hiện malQ từ Escherichia coli K12 và xác định điều kiện hoạt động tối ưu của enzym MalQ” được thực hiện. 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn E. coli K12, do giáo sư W. Boos ở trường Đại học Konstanz- Đức cung cấp, sử dụng cho chiết tách DNA mục tiêu; Chủng E. coli BL 21 (DE3) được 1 Trường Đại học Ang Giang 2 Khoa Kỹ thuật Sinh học Nông Nghiệp, Trường ĐH Quốc gia Seoul, Hàn Quốc Tạp chí Khoa học 2011:17a 173-180 Trường Đại học Cần Thơ 174 sử dụng làm vật chủ cho biểu hiện dòng gen. E. coli được nuôi cấy trong môi trường Luria-Bertani (LB) [1% tryptone, 0,5% yeast extract và 1% NaCl] có bổ sung 20 µg/ml kanamycin kháng sinh khi cần để làm nhân tố chọn lọc. 2.2 Tạo dòng gen malQ ở E.coli K12 Dựa vào trình tự gen malQ của E. coli K12 trong ngân hàng gen, cặp mồi malQ- NdeI R (5’-AAACGCTAAGGAAGCCATATGGAAAGC-3’) và malQ-XhoI F (5’-AACCGCACTCTCGAGCTTCTTCGCTGCAGC-3’) được thiết kế để dùng cho PCR. PCR được thực hiện trong thiết bị thermal cycler với 34 chu kỳ. Trong mỗi chu kỳ, giai đoạn 1 nâng nhiệt đến 94°C, 30 giây; giai đoạn 2 hạ nhiệt xuống 55°C, 30 giây; giai đoạn 3 nâng nhiệt đến 72°C, 135 giây. Thành phần phản ứng PCR gồm 100 µl trong đó dung dịch đệm [10 mM Tris/pH 8.85; 25 mM KCl; 5 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ; 2 mM MgSO 4 ; 0.2 mM mỗi dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ], 50100 ng DNA bản mẫu, 50 pmole mồi xuôi và mồi ngược, 2.5U Ex Taq DNA polymerase. Sản phẩm PCR được được tinh sạch bằng QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Germany) và cắt bằng NdeI và XhoI. Đoạn gen malQ được nối vào vector pET-29(+)(T7 promoter, N-terminal His 6 tag, Kan r , Novagen Inc., Madison, Wis.) tại NdeI và XhoI nhờ T4 DNA ligase. Thành phần phản ứng nối gồm plasmid pET29-malQ[His] và gen malQ. Sản phẩm nối sau đó được biến nạp vào E. coli BL21(DE3). 2.3 Sản xuất và tinh sạch MalQ Sản phẩm nối sau khi được biến nạp vào E. coli BL21(DE3) sẽ được chọn lọc dựa trên kiểu hình kháng kanamycin. Các khuẩn lạc dự tuyển được kiểm chứng bằng phương pháp PCR khuẩn lạc sử dụng cặp m ồi malQ-NdeI R và malQ-XhoI F của gen malQ. Phương pháp bản đồ cắt hạn chế cũng được sử dụng để kiểm tra plasmid thu được [1]. Biến nạp pET29-malQ vào E.coli BL21 (DE3). Chủng biểu hiện sau khi biến nạp được nuôi ở 37°C trong môi trường Luria-Bertani (LB) lỏng hoặc LB agar có bổ sung 20 µg/ml kanamycin. Sự biểu hiện của gen được điều tiết bằng cách thêm isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Tế bào thu được bằng cách ly tâm (12,000 rpm, 10 phút). Tế bào được phá vỡ trong thiết bị VC- 600, Sonics & Materials Inc. Enzym thô được chiết tách bằng ly tâm (12,000 rpm, 4°C, 15 phút) và tinh sạch bằng nhựa nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) trong cột sắc ký Poly-Prep  . Protein mục tiêu được thẩm tách lại trong dung dịch đệm 50 mM Tris-HCl pH 7.5. Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford [3]. Độ tinh khiết và khối lượng phân tử của protein tinh sạch được phân tích bằng 10% SDS-PAGE. 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo dòng biểu hiện gen malQ từ E. coli K12 Để tách gen malQ, đoạn gen 2082 bp của gen này được khuyếch đại từ nhiễm sắc thể DNA củ a E. coli K12 bằng PCR (Hình1). Sản phẩm PCR được xử lý bằng enzym giới hạn XhoI và NdeI và sau đó được chuyển vào vector pET29b với vị trí giới hạn tương ứng. DNA tái tổ hợp được chuyển vào E. coli BL21 (DE3). Trình tự nucleotide của đoạn malQ trong pET29b-malQ[His] được thẩm định qua phân Tạp chí Khoa học 2011:17a 173-180 Trường Đại học Cần Thơ 175 tích trình tự DNA (Biomedic-Korea) xác định không có sai sót trong suốt quá trình PCR. Hình 1: Phân tích agarose gel electrophoresis của sản phẩm PCR Cột M: 1kb DNA chuẩn; Cột 1: sản phẩm PCR 3.2 Cấu trúc cơ bản của gen malQ Khung đọc mở gen malQ bắt đầu bằng start codon ATG ở nucleotide 3,292 và kết thúc với TAG codon ở nucleotide 1,208 giải mã chuỗi polypeptide đơn của 694 amino acid (Hình 2). 1 1 40 14 79 27 118 40 157 53 196 66 235 79 274 92 313 105 352 118 391 131 430 144 496 157 508 170 547 ATG GAA AGC AAA CGT CTG GAT AAT GCC GCG CTG GCG GCG M E S K R L D N A A L A A GGG ATT AGC CCC AAT TAC ATC AAT GCC CAC GGT AAA CCG G I S P N Y I N A H G K P CAG TCG ATT AGC GCC GAA ACC AAA CGG CGT TTG CTT GAC Q S I S A E T K R R L L D GCG ATG CAT CAA CGT ACC GCC ACG AAA GTG GCG GTA ACG A M H Q R T A T K V A V T CCA GTC CCG AAT GTC ATG GTT TAT ACC AGC GGC AAA AAA P V P N V M V Y T S G K K ATG CCG ATG GTG GTG GAG GGC AGC GGC GAA TAT AGC TGG M P M V V E G S G E Y S W CTG CTG ACC ACC GAA GAA GGA ACG CAG TAC AAA GGC CAT L L T T E E G T Q Y K G H GTA ACG GGG GGC AAA GCG TTC AAT CTA CCG ACG AAG CTG V T G G K A F N L P T K L CCG GAA GGT TAT CAC ACG CTG ACA CTC ACC CAG GAC GAC P E G Y H T L T L T Q D D CAG CGC GCG CAT TGC CGG GTG ATT GTC GCC CCG AAA CGC Q R A H C R V I V A P K R TGT TAC GAA CCG CAG GCG TTG CTG AAT AAA CAA AAG CTG C Y E P Q A L L N K Q K L TGG GGT GCC TGC GTT CAG CTT TAT ACG CTG CGA TCG GAA W G A C V Q L Y T L R S E AAA AAC TGG GGT ATT GGG GAT TTT GGC GAT CTC AAA GCG K N W G I G D F G D L K A ATG CTG GTG GAT GTG GCA AAA CGT GGC GGG TCG TTC ATT M L V D V A K R G G S F I GGC CTG AAC CCG ATT CAT GCG CTC TAT CCG GCA AAT CCG 2.0 1.0 2.5 0.75 1.5 3.0 2.1 kb M 1 Tạp chí Khoa học 2011:17a 173-180 Trường Đại học Cần Thơ 176 183 586 196 625 209 664 222 703 235 742 248 781 261 820 274 859 287 898 300 937 313 976 326 1015 339 1054 352 1093 365 1132 378 1172 391 1210 404 1249 417 1288 430 1327 443 1366 456 1405 469 1444 482 1483 495 1522 508 1561 521 G L N P I H A L Y P A N P GAG AGC GCC AGC CCA TAC AGC CCG TCT TCT CGC CGT TGG E S A S P Y S P S S R R W CTG AAT GTG ATT TAT ATC GAC GTT AAC GCC GTT GAA GAT L N V I Y I D V N A V E D TTC CAT CTT AGC GAA GAG GCT CAG GCC TGG TGG CAG TTG F H L S E E A Q A W W Q L CCG ACC ACG CAA CAG ACG CTG CAA CAG GCG CGC GAT GCC P T T Q Q T L Q Q A R D A GAC TGG GTC GAT TAC TCC ACG GTT ACC GCC CTA AAA ATG D W V D Y S T V T A L K M ACA GCA TTA CGA ATG GCG TGG AAA GGT TTC GCG CAA CGT T A L R M A W K G F A Q R GAT GAT GAG CAG ATG GCC GCG TTT CGC CAG TTT GTT GCA D D E Q M A A F R Q F V A GAG CAG GGC GAC AGC CTG TTC TGG CAG GCA GCC TTT GAT E Q G D S L F W Q A A F D GCG CTA CAT GCC CAG CAA GTG AAA GAG GAC GAA ATG CGC A L H A Q Q V K E D E M R TGG GGC TGG CCT GCA TGG CCA GAG ATG TAT CAG AAC GTG W G W P A W P E M Y Q N V GAT TCA CCA GAA GTG CGT CAG TTC TGC GAA GAA CAT CGT D T P E V R Q F C E E H R GAT GAC GTC GAT TTT TAT CTC TGG TTG CAG TGG CTG GCT D D V D F Y L W L Q W L A TAC AGC CAG TTT GCC GCC TGC TGG GAG ATA AGC CAG GGC Y S Q F A A C W E L S Q G TAT GAA ATG CCG ATT GGC TTG TAT CGT GAT CTG GCG GTT Y E M P I G L Y R D L A V GGC GTA GCG GAA GGT GGG GCG GAA ACC TGG TGT GAC CGT G V A E G G A E T W C D R GAA CTA TAT TGC CTG AAA GCA TCG GTT GGC GCG CCG CCG E L Y C L K A S V G A P P GAT ATC CTC GGC CCG TTG GGG CAG AAC TGG GGA TTA CCG D I L G P L G Q N W G L P CCA ATG GAC CCG CAT ATC ATC ACC GCG CGT GCC TAT GAA P M D P H I I T A R A Y E CCG TTT ATC GAG CTG TTG CGT GCC AAT ATG CAA AAC TGC P F I E L L R A N M Q N C GGC GCA TTA CGA ATT GAC CAT GTG ATG TCG ATG CTG CGT G A L R I D H V M S M L R TTG TGG TGG ATA CCG TAT GGC GAG ACG GCA GAT CAG GGC L W W I P Y G E T A D Q G GCG TAT GTT CAC TAT CCG GTG GAT GAT CTG CTC TCG ATT A Y V H Y P V D D L L S I CTG GCA CTC GAA AGT AAA CGT CAT CGC TGT ATG GTG ATT L A L E S K R H R C M V I GGT GAA GAT CTC GGT ACC GTA CCG GTA GAG ATT GTC GGT G E D L G T V P V E I V G AAG CTG CGC AGC AGC GGT GTG TAC TCT TAC AAA GTG CTC K L R S S G V Y S Y K V L TAT TTC GAA AAC GAC CAC GAG AAG ACG TTC CGT GCA CCG Y F E N D H E K T F R A P Tạp chí Khoa học 2011:17a 173-180 Trường Đại học Cần Thơ 177 1600 534 1639 547 1678 560 1717 573 1756 586 1795 599 1834 612 1873 625 1912 638 1951 651 1990 664 2029 677 2068 690 AAA GCG TAT CCG GAG CAG TCG ATG GCG GTT GCG GCG ACA K A Y P E Q S M A V A A T CAT GAC CTG CCA ACG CTG CGC GGT TAC TGG GAG TGC GGG H D L P T L R G Y W E C G GAT CTA ACG CTG GGC AAA ACC CTG GGG CTG TAT CCG GAT D L T L G K T L G L Y P D GAA GTG GTA CTG CGC GGT CTG TAT CAG GAT CGC GAA CTG E V V L R G L Y Q D R E L GCG AAG CAA GGG CTG CTG GAT GCA CTG CAT AAA TAT GGT A K Q G L L D A L H K Y G TGT CTG CCG AAA CGT GCC GGG CAT AAG GCA TCG TTG ATG C L P K R A G H K A S L M TCG ATG ACG CCG ACG CTG AAC CGT GGT TTG CAG CGC TAC S M T P T L N R G L Q R Y ATT GCC GAC AGT AAC AGT GCT CTG TTA GGA CTA CAG CCG I A D S N S A L L G L Q P GAA GAC TGG CTG GAT ATG GCC GAA CCG GTG AAT ATT CCT E D W L D M A E P V N I P GGC ACC AGT TAC CAG TAT AAA AAC TGG CGA CGC AAG CTT G T S Y Q Y K N W R R K L TCC GCA ACG CTT GAG TCG ATG TTT GCC GAT GAT GGC GTG T A T L E S M F A D D G V AAC AAG TTG CTG AAG GAT TTG GAC AGA CGG CGC AGA GCT N K L L K D L D R R R R A GCA GCG AAG AAG AAG TAG A A K K K * Hình 2: Trình tự chuỗi nucleotide của gen malQ Trình tự protein dự đoán được trình bày bên dưới trình tự DNA , (*) stop codon 3.3 Biểu hiện và tinh sạch MalQ tái tổ hợp Amylomaltase E. coli được giải mã bởi gen malQ hợp nhất với C-terminal His 6 tag của vector pET29b và biểu hiện dưới sự kiểm soát của promoter T7. Plasmid tái tổ hợp được chuyển vào E. coli BL21 (DE3) và nuôi cấy trong môi trường LB chứa kanamycin (20 µg/ml). Gen biểu hiện sẽ được điều tiết bằng cách bổ sung IPTG đến nồng độ cuối cùng là 0.2 mM được xem là thích hợp ở mức hấp thu quang học đạt đến 0.6 (đo ở 600 nm). Sản phẩm MalQ tạo ra trong E.coli được tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực Ni-NTA. K ết quả hoạt tính enzym được xác định bằng phương pháp Lugol’s [5] (Bảng 1) cho thấy enzym được tinh sạch 3 lần, với sản lượng đạt được là 20% trong quá trình tinh sạch một bước và trọng lượng phân tử tương đương 72 kDa (Hình 3) tương quan với trọng lượng phân tử dự đoán từ trình tự amino acid của MalQ. Tạp chí Khoa học 2011:17a 173-180 Trường Đại học Cần Thơ 178 Hình 3: Phân tích SDS-PAGE của MalQ tái tổ hợp được biểu hiện từ pET29b trong E. coli BL21 (DE3) Cột M: trọng lượng phân tử chuẩn; Cột 1: trong phần hòa tan của tế bào được phá vỡ; Cột 2: MalQ sau khi tinh sạch Bảng 1: Hoạt tính và hàm lượng protein của enzym MalQ qua các bước tinh sạch Bước tinh sạch Tổng thể tích (ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (mU) Hoạt tính riêng (mU/mg) Sản lượng (%) Độ tinh sạch Phá vỡ tế bào Ni-NTA 20 4 242.7 18.1 3,000 600 12.4 33.2 100 20 1 3 3.4 Đặc tính của enzym MalQ 3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ Tốc độ phản ứng của MalQ tăng dần và đạt tối đa ở nhiệt độ 37°C, nhưng sau đó hoạt tính của enzym giảm nhanh ở nhiệt độ trên 40°C. Vì vậy, nhiệt tối thích cho hoạt động của MalQ tái tổ hợp là 37°C khi 0.05% (w/v) amylose trong 200 mM sodium acetate bufer (pH 6.5) được sử dụng làm cơ chất (Hình 4). Hình 4: Nhiệt độ tối ưu của MalQ 97 72 kDa 66 M 29 45 116 1 2 kDa Nhi ệ t đ ộ (°C) Hoạt tính tương đối (%) 20 30 40 50 60 70 0 20 40 60 80 100 120 Tạp chí Khoa học 2011:17a 173-180 Trường Đại học Cần Thơ 179 3.4.2 Ảnh hưởng của pH và ion sodium Để xác định pH tối ưu của MalQ, hoạt tính tương đối của MalQ với amylose được đo qua một loạt pH từ 4 đến 10. Dung dịch đệm được sử dụng như sau: 50 mM sodium acetate (pH 4.0 đến 6.0); 200 mM sodium acetate (pH 4.0 đến 6.5); 50 mM sodium phosphate (pH 6.5 đến 8.0); and 50 mM Tris-HCl (pH 6.5 đến 10) (Hình 5). Enzym MalQ hoạt động tốt nhất ở pH 6.5 với 0.05% (w/v) amylose trong môi trường 200 mM sodium acetate; ngược lại hoạt tính của nó khá thấp trong dung dịch đệm 50 mM sodium acetate. Hình 5: pH tối ưu của MalQ Hình 6: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm sodium acetate trên hoạt tính của MalQ pH 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 20 40 60 80 100 120 50 mM Tris-HCl 50 mM Na- p hos p hate 50 mM Na-acetate 200 mM Na-acetate Hoạt tính tương đối (%) Nồng độ (mM) Hoạt tính tương đối (%) 0 50 100 150 200 250 0 20 40 60 80 100 Tạp chí Khoa học 2011:17a 173-180 Trường Đại học Cần Thơ 180 Hình 7: Ảnh hưởng của ion sodium trên hoạt tính của MalQ Hoạt tính của enzym MalQ không bị ưc chế bởi nồng độ ion sodium cao. Khi nồng độ sodium chloride được tăng lên từ 200 mM đến 500 mM trong dung dịch đệm 50 mM sodium acetate, hoạt tính của enzym này chỉ thay đổi 11% (Hình 6 và 7). 4 KẾT LUẬN Với “tạo dòng biểu hiện malQ từ Escherichia coli K12 và xác định điều kiện hoạt động tối ưu của enzym MalQ” bước đầu cung cấp các dữ liệu và thông tin cơ bản cho các nghiên cứu về đặc tính xúc tác của enzym này đồng thời giúp tìm hiểu sâu hơn vai trò của nó trong hệ thống chuyển hóa maltodextrin/glycogen của E. coli. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Boos, W. and H. Shuman. 1998. Maltose/maltodextrin system of Escherichia coli: transport, metabolism, and regulation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 204-229. [2] Böhm, A. and W. Boos. 2004. Gene regulation prokaryotes by subcellular relocalization of transcription factors. Curr. Opin. Microbiol. 7: 151-156. [3] Bradford, M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72: 248-254. [4] Decker, K., R. Peist, J. Reidl, M. Kossmann, B. Brand and W. Boos. 1993. Maltose and maltotriose can be formed endogenously in Escherichia coli from glucose and glucose-1- phosphate independently of enzymes of the maltose system. J. Bacteriol. 175: 5655-5665. [5] Liebl, W., R. Feil, J. Gabelsberger, J. Kellermann and K. H. Schleifer. 1992. Purification and characterization of a novel thermostable 4-α-glucanotransferase of Thermotoga maritima cloned in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 207: 81-88. 0 100 200 300 400 500 600 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ (mM) Hoạt tính tương đối (%) . hiểu và xác định đặc tính của MalQ, Tạo dòng biểu hiện malQ từ Escherichia coli K12 và xác định điều kiện hoạt động tối ưu của enzym MalQ được thực hiện. . 173 TẠO DÒNG BIỂU HIỆN malQ TỪ ESCHERICHIA COLI K12 VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN HOẠT ĐỘNG TỐI ƯU CỦA ENZYM MalQ Trần Phương Lan 1 , Park Kwan-Hwa 2 và Park