TCNCYH 23 (3) 2003 Phát triển và ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ phân Nguyễn Vũ Trung 1 , Lê Huy Chính 1 , Lê Văn Phủng 1 , Andrej Weintraub 2 1 Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Hà Nội, 2 Khoa Vi sinh -Miễn dịch -Bệnh học Bệnh viện Huddinge, Viện Karolinska-Thuỵ Điển Kỹ thuật PCR đa mồi lần đầu tiên đợc nghiên cứu thành công ở Việt nam bằng cách phối hợp 8 cặp mồi để chẩn đoán 5 loại E. coli gây tiêu chảy (ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC) từ phân trẻ em dới 5 tuổi bị tiêu chảy. Kỹ thuật này cho phép chẩn đoán chính xác 5 loại E. coli gây tiêu chảy chỉ bằng một phản ứng PCR với độ nhạy và độ đặc hiệu gần 100% và tiết kiệm nguyên vật liệu, thời gian gấp 5 lần so với tiến hành từng phản ứng PCR riêng biệt. Qua phân tích 310 bệnh phẩm phân tiêu chảy, 90 chủng E. coli gây bệnh đã đợc phân lập chiếm 29,04% tổng số các bệnh phẩm. Trong đó, EAEC là 58 chủng chiếm 18,71%, ETEC 2 chủng (0,65%), EPEC 24 chủng (7,7%), và EIEC 6 chủng (1,94%). i. Đặt vấn đề Tiêu chảy là một vấn đề sức khoẻ toàn cầu. Bệnh hay gặp ở trẻ em. ở các nớc đang phát triển, có ít nhất 1 tỷ trờng hợp tiêu chảy hàng năm và số tử vong là 5 đến 7 triệu. Trung bình một năm một trẻ mắc 3,3 lần tiêu chảy. Tại Việt Nam, một số nghiên cứu cho thấy, số lần bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ từ 2,2 6. Tại các nớc công nghiệp phát triển, tiêu chảy vẫn còn phổ biến ở trẻ em, ngời già và các khách du lịch đến các nớc đang phát triển. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy. Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò quan trọng. Trong số các vi khuẩn gây tiêu chảy, E. coli hiện nay là căn nguyên nổi trội, thu hút đợc sự quan tâm của các bác sĩ lâm sàng, nhi khoa, vi sinh vì nó là căn nguyên của 1/3 số trờng hợp tiêu chảy. Việc chẩn đoán gặp khó khăn vì các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu. Có 5 loại E. coli gây tiêu chảy, đợc phân loại theo các cơ chế gây bệnh khác nhau dựa trên các gien nằm trong tế bào vi khuẩn mã hoá cho các yếu tố độc lực: Enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC) và enteroaggregative E. coli (EAEC) [3, 4]. Hiện nay có bốn phơng pháp đợc dùng để chẩn đoán các E. coli này: Dựa vào các tính chất sinh vật hoá học. Định týp huyết thanh. Các thử nghiệm dựa trên những đặc điểm về độc lực. Các phơng pháp này hầu nh không thể chẩn đoán đợc hoặc rất tốn kém. Các phơng pháp sinh học phân tử: + Hiện nay chủ yếu là hai phơng pháp: Mẫu dò ADN (ADN probe) và phản ứng chuỗi (Pylymerase Chain Reaction - PCR). Tuy nhiên độ nhạy của phơng pháp mẫu dò ADN 6 TCNCYH 23 (3) 2003 thấp, thao tác phức tạp và đòi hỏi một số lợng lớn vi sinh vật trong bệnh phẩm. + PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic trong ống nghiệm. Trong đó, một đoạn ADN đợc nhân lên đặc hiệu. Trong kỹ thuật này, hai đoạn oligonucleotid, đợc gọi là mồi, gắn đặc hiệu vào đoạn ADN đích và đợc khuếch đại theo một số chu kỳ đợc lặp đi lặp lại. Chu kỳ này gồm việc làm tách hai sợi của đoạn ADN, gắn hai oligonucleotid vào hai sợi này theo nguyên tắc bổ sung và kéo dài đoạn oligonucleotid dới tác động của enzym ADN polymerase. Trong PCR, ADN đích đợc tăng lên theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ. Sản phẩm của PCR đợc phát hiện sau khi điện di trên agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọc dới ánh sáng đèn cực tím. PCR là phơng pháp đang đợc áp dụng rộng rãi vì cho kết quả nhanh, chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Hiện nay, trên thế giới, PCR đang đợc nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy. Bình thờng trong một phản ứng PCR, ngời ta dùng một cặp mồi để khuếch đại một đoạn gien đặc hiệu. Để chẩn đoán xem trong bệnh phẩm có 1 trong số 5 loại E. coli gây tiêu chảy cần ít nhất 6 PCR riêng rẽ. Nh vậy rất tốn kém. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định đợc vi khuẩn này mà chỉ cần duy nhất 1 phản ứng PCR ? Nếu vậy, chúng ta không những tiết kiệm đợc nguyên vật liệu và thời gian mà còn tránh đợc sự nhiễm trong kỹ thuật này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm hai mục tiêu: 1. Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy. 2. ứng dụng kỹ thuật này để chẩn đoán các E. coli gây tiêu chảy từ phân trẻ em dới năm tuổi bị tiêu chảy. II. đối tợng và Phơng pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu. Đánh giá một nghiệm pháp chẩn đoán và nghiên cứu mô tả. PCR chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ bệnh phẩm phân. Chúng tôi sử dụng thờng qui chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy bằng PCR theo thờng qui của Khoa Vi sinh lâm sàng, Bệnh viện Huddinge, Viện Karolinska, Stockholm, Thuỵ Điển. Bệnh phẩm phân sau khi thu thập đợc cấy lên trên môi trờng cho vi khuẩn đờng ruột, để ở 37 0 C sau 18-24 giờ. Vi khuẩn trên đĩa môi trờng đợc hoà vào dung dịch đệm phosphat, đun cách thuỷ ở 100 0 C trong 20 phút để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn. ADN của vi khuẩn đợc giải phóng. Ly tâm dịch này với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Nớc nổi sau khi ly tâm dùng làm ADN khuôn cho phản ứng PCR. Các cặp mồi đợc thiết kế đặc hiệu với một số đoạn gen của ETEC, EHEC, EPEC, EIEC, EAEC (INTERACTIVA, Đan Mạch). Sản phẩm của PCR sau đó đợc điện di trên agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE để tách biệt các ADN đã đợc khuếch đại. Nhuộm gel sau khi điện di bằng Ethidium bromide và nhìn dới đèn cực tím sẽ cho phép thấy đợc các băng ADN đặc hiệu. So sánh các băng này với các băng của ADN mẫu. Đoạn gen đích Mồi Vi khuẩn Cỡ sản phẩm elt B LTl-r ETEC 322 bp est A STI2l-r ETEC 147 bp vt 1 VT1l-r EHEC 130 bp vt 2 VT2l-r EHEC 298 bp eae A eae u-l EHEC/ EPEC 376 bp ial SHIG1-2 EIEC 320 bp bfp A bfpA2u-l EPEC 367 bp 7 TCNCYH 23 (3) 2003 pCVD EA1-2 EAEC 630 bp Tiêu chuẩn tối thiểu: ETEC: Có gen eltB và/hoặc estA EHEC: Có gen vt1 và/hoặc vt 2. Có gen eaeA,EHEC điển hình EPEC: Có gen bfpA và eaeA EIEC : Có gen ial EAEC : Có gen pCVD Taq polymerase, MgCl 2 và Buffer do Hãng Perkin Elmer, Mỹ cung cấp. Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập, xác định E. coli đợc tiến hành theo thờng qui. Các chủng E. coli. 5 chủng E. coli gây tiêu chảy chuẩn quốc tế, 238 chủng E. coli từ phân đã đợc xác định bằng nhiều phơng pháp khác nhau gồm 99 chủng gây tiêu chảy, 139 chủng không gây tiêu chảy đợc cung cấp từ Khoa Vi sinh lâm sàng của Bệnh viện Huddinge-Viện Karolinska-Thuỵ Điển, Trung tâm kiểm soát bệnh nhiễm trùng của Thuỵ Điển, Trung tâm lu giữ chủng của Trờng Đại học Goterborg- Thuỵ Điển, dự án nghiên cứu về E. coli gây tiêu chảy giữa Thuỵ Điển và Nicaragua. Bệnh phẩm phân. 310 mẫu phân từ trẻ dới 5 tuổi bị tiêu chảy đợc thu thập ở 3 bệnh viện tại Hà Nội. III. Kết quả 1. Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi. Chúng tôi đã phối hợp thành công 8 cặp mồi trong một phản ứng để chẩn đoán cùng một lúc 5 loại E. coli gây tiêu chảy trong phân. PCR đơn mồi PCR đa mồi 1. Nớc cất : 11,5 àl 2. Đệm ì10 : 2,0 àl 3. dNTPs (1,25mM) : 1,6 àl 4. MgCl 2 25 mM : 1,2 àl 5. Mồi 2,5 àM : 1,6 àl 6. Taq 5 UI/ àl : 0,1 àl 7. ADN từ vi khuẩn : 2,0 àl 1 cặp mồi trong một phản ứng Thể tích: 20,0 àl 1. Nớc cất : 6,7 àl 2. Đệm ì 10 : 2,0 àl 3. dNTPs (1,25mM) : 1,6 àl 4. MgCl 2 25 mM : 1,2 àl 5. Mồi 2,5 àM : 6,4 àl 6. Taq 5 UI/ àl : 0,1 àl 7. ADN từ vi khuẩn : 2,0 àl 8 cặp mồi trong một phản ứng Thể tích: 20,0 àl 8 TCNCYH 23 (3) 2003 Bảng 1. Ưu điểm cuả PCR đa mồi Thành phần 1 PCR 6 PCR PCR đa mồi Tiết kiệm Nớc cất 11,1 àl 66,6 àl 6,3 àl 60,3 àl Đệm 2,0 àl 12,0 àl 2,0 àl 10,0 àl dNTPs 1,6 àl 9,6 àl 1,6 àl 8,0 àl MgCl 2 1,6 àl 9,6 àl 1,6 àl 8,0 àl Mồi 1,6 àl 9,6 àl 6,4 àl 3,2 àl Taq polymerase 0,1 àl 0,6 àl 0,1 àl 0,5 àl ADN mẫu 2,0 àl 12,0 àl 2,0 àl 10,0 àl Thể tích 20,0 àl 120,0 àl 20,0 àl 100,0 àl Qua bảng trên chúng tôi thấy, kỹ thuật PCR đa mồi cho phép tiết kiệm thời gian và nguyên vật liệu (khoảng 5 lần) so với chạy riêng rẽ từng PCR. 1 2 3 4 5 6 7 1636 1018 506,517 396 344 298 220 201 154 134 Hình ảnh điện di kết quả PCR đa mồi với các chủng E. coli chuẩn (kích cỡ bp) 1. E. coli 2. EIEC 3. EHEC 4. ETEC 5. EAEC 6. EPEC 7. ADN mẫu + Kỹ thuật PCR đa mồi đợc thực hiện với các chủng E. coli chuẩn và cho kết quả rất tốt. Chúng tôi đã thực hiện phản ứng này rất nhiều lần để kiểm tra độ ổn định của phản ứng trên các chủng E. coli chuẩn quốc tế và các chủng đợc cung cấp, độ lặp lại là 100%. 9 TCNCYH 23 (3) 2003 Bảng 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR đa mồi E. coli PCR Gây tiêu chảy (n = 99) Không gây tiêu chảy (n = 139) Tổng số (n = 238) Dơng tính 99 0 99 Âm tính 0 139 139 = 99 / 99 = 100% Số E. coli gây tiêu chảy dơng tính với PCR đa mồi Đ ộ nh ạy = Tổng số E. coli gây tiêu chảy Số E. coli không gây tiêu chảy âm tính với PCR đa mồi Tổng số E. coli không gây tiêu chảy = 139 /139 = 100% Độ đặc hiệu = Bảng 3. Phân bố các E. coli gây tiêu chảy phân lập đợc từ phân ETEC EHEC EPEC EIEC EAEC n = 310 Số chủng 2 0 24 6 58 90 % 0,65 0 7,74 1,94 18,71 29,04 Bảng 3 cho thấy, khoảng 30% số các bệnh phẩm phân tiêu chảy có E. coli thuộc một trong 5 loại E. coli gây tiêu chảy, trong đó chiếm đa số là EAEC. Kết quả PCR một số chủng E. coli gây tiêu chảy từ phân 1636 1018 506, 517 396 344 298 220, 201 154, 134 1 2 3 4 5 6 7 1. ADN marker 2. EIEC 3. EPEC 4. ETEC 5. EAEC 6. Chứng (+) EIEC 7. Chứng (-) E. coli không gây tiêu chảy. Kích cỡ (bp) 10 TCNCYH 23 (3) 2003 Bảng 4: So sánh E. coli gây tiêu chảy xác định bằng PCR với nuôi cấy phân lập (NCPL) từ 310 mẫu phân ETEC EPEC EIEC EAEC Tổng PCR 2 24 6 58 90 NCPL 0 0 0 0 0 Nếu chỉ dùng phơng pháp nuôi cấy phân lập đơn thuần, chúng ta không xác định đợc các chủng E. coli gây tiêu chảy từ phân. Bảng 5. Một số tính chất sinh vật hoá học chính của các chủng E. coli gây tiêu chảy so sánh với các chủng E. coli không gây tiêu chảy Lên men đờng Hình thể Gram Lac Glu Sor Di động Sinh hơi Sinh urease Sinh H 2 S Indole E. coli* TK (-) + + +/- +/- +/- - - + E. coli** TK (-) + + +/- +/- +/- - - + *, E. coli gây tiêu chảy ; **, E. coli bình thờng trong đại tràng. Qua bảng 5 chúng ta thấy không thể phân biệt các E. coli gây tiêu chảy với các E. coli thuộc thành phần khuẩn chí bình thờng bằng các tính chất sinh vật hoá học thông thờng. iv. Bàn luận Cho đến nay, vẫn cha có dấu ấn đặc trng nào dựa trên tính chất sinh vật hoá học cũng nh kháng nguyên có thể dùng để phân biệt các chủng E. coli gây bệnh với các chủng E. coli thuộc vi hệ bình thờng trong đại tràng. Nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đều có chung một nhân xét rằng PCR là phơng pháp đơn giản, dễ thực hiện và có độ nhậy cao hơn hẳn các phơng pháp khác. Độ nhậy và độ đặc hiệu của phơng pháp này đạt tới 90-100% [2]. PCR giúp chẩn đoán một cách nhanh chóng các tác nhân gây bệnh trên lâm sàng. Đối với chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy từ bệnh phẩm phân, lúc đầu các tác giả dùng từng cặp mồi riêng rẽ để phát hiện từng gien đích. Về sau, nhiều cặp mồi đã đợc phối hợp để chẩn đoán một hoặc nhiều loài E. coli gây tiêu chảy. Jan Olsvik và Sandrinsa Tacyphipps đã thành công trong việc dùng 2 cặp mồi LT I và ST II trong 1 phản ứng để chẩn đoán ETEC với độ nhạy 100%. James B và cộng sự sử dụng 4 cặp mồi trong một phản ứng kết quả độ nhậy 98,9%. Akioabe đã phối hợp 5 cặp mồi trong một phản ứng và kết quả cho thấy độ nhậy 100% [2, 8] Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sử dụng 8 cặp mồi trong 1 phản ứng PCR có độ nhậy và độ đặc hiệu gần 100%. Qua nghiên cứu, chúng tôi thấy PCR đa mồi dựa trên sự phối hợp 8 cặp mồi đảm bảo đợc độ tin cậy về độ nhạy và độ đặc hiệu trong chẩn đoán 5 loại E. coli gây tiêu chảy. Ngoài ra, sử dụng 8 cặp mồi trong một phản ứng giúp tiết kiệm về thời gian và nguyên vật liệu gấp 5 lần so với dùng riêng rẽ từng cặp mồi. Thêm nữa, khi giảm số lần tiến hành các phản ứng PCR chúng ta sẽ làm giảm sự nhiễm của phản ứng này. Một vấn đề đáng lo ngại của kỹ thuật PCR. Khi tiến hành kỹ thuật PCR đa mồi trên các bệnh phẩm phân ở trẻ em dới 5 tuổi bị tiêu chảy, chúng tôi đã phân lập đợc 90 chủng E. coli gây bệnh chiếm 29,04% tổng số các bệnh phẩm. Trong đó, EAEC là 58 chủng chiếm 11 TCNCYH 23 (3) 2003 18,71%. Điều đáng nói ở đây là, chúng tôi đã phát hiện và phân lập đợc 4 loại E. coli gây tiêu chảy với các tỷ lệ khác nhau. Nhiều nhất là EAEC (18,71%) và ít nhất là ETEC (0,65%). So với một số tác giả khác, nh tại ấn Độ tỷ lệ E. coli gây tiêu chảy chiếm 29,5%, Thái Lan 21% thì tỷ lệ phân lập E. coli gây tiêu chảy của chúng tôi cũng giống nh nhiều tác giả khác [6, 7]. Tuy nhiên, sự phân bố các loài E. coli gây tiêu chảy trong nghiên cứu của chúng tôi có khác so với một số tác giả. Điều này cũng tơng tự nh nhiều nghiên cứu trên thế giới vì tỷ lệ các vi khuẩn này phụ thuộc vào từng vùng địa lý khác nhau. Khi so sánh các tính chất sinh vật hoá học chính của các chủng E. coli gây tiêu chảy với các chủng E. coli thuộc thành phần khuẩn chí bình thờng, chúng tôi thấy các đặc điểm này giống nhau. Điều này càng khẳng định những nghiên cứu trớc kia của các tác giả cho rằng, không thể phân biệt các E. coli gây tiêu chảy với các E. coli thờng bằng các tính chất sinh vật hoá học và các đặc điểm về hình thể cũng nh bắt màu Gram, đây là phơng pháp dùng phổ biến hiện nay tại các khoa vi sinh của các bệnh viện. Nh vậy, kỹ thuật PCR là một phơng tiện chẩn đoán rất có hiệu quả các loại E. coli này. V. Kết luận PCR đa mồi đã đợc phát triển thành công trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy. Độ nhạy và độ đặc hiệu đạt gần 100%. Sử dụng kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy giúp tránh lây nhiễm, tiết kiệm thời gian, nguyên vật liệu gấp 5 lần so với dùng PCR đơn mồi. Kỹ thuật PCR đa mồi đã đợc ứng dụng thành công trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy trong phân. Tài liệu tham khảo 1. Hoàng Thu Thủy.: Góp phần nghiên cứu các chủng Escherichia coli gây tiêu chảy cấp ở trẻ em tại Hà Nội, Luận án Phó tiến sỹ y học, Viện vệ sinh dịch tễ. 1988. 2. Akio Abe, Hiromi Obata, Shigeru Matsushita, Sumio Yamada, Yasuo Kudoh.: A sensitive method for the detection of enterotoxigenic Escherichia coli by the polimerase chain reaction using multiple primer pairs, Zbl, Bakt. 1992, Vol 277: 170- 178. 3. Bardhan PK, Albert MJ, Alam NH.: Small bowel and fecal microbiology in children suffering from persistent diarrhea in Bangladesh, J. Pediatr Gastroenterol Nutr. 1998, 26(1): 9-15. 4. James P. Nataro and James.B .Kaper.: Diarrheagenic Escherichia coli, Clinical Microbiol Revews. 1998, 4 :142-210. 5. Jan Holmgren and Ann- Mari Svennerholm.: Bacterial enteric infection and vaccine development, Gastroenterology Clinics of North America. 1992, 21(2): 283-302. 6. Kamlakar U.P. Pathak. : Enteropathogenic Escherichia coli diarrhea in children and in young adults, India J. pathol. Microbiol. 1995, Vol 38(2): 153-8. 7. Leutin B, K.Gleier, Peter Echeverria.: Origin and characteristics of enteroinvasive strain of Escherichia coli (EIEC) isolated in Germany, Epidemiol. Infect. 1997, 118: 199- 205. 8. Okeke IN, Lamikaran A, Steinruck H, Kaper JB.: Characterization of Escherichia coli from cases of childhood diarrhea in provincial Southwestern Nigeria, J. Clin. Microbiol. 2000, Vol 38(1) : 7-12. 12 TCNCYH 23 (3) 2003 Summary Development and application of multiplex PCR to diagnose diarrheogenic EScherichia coli from feces A multiplex PCR has been developed successfully for the first time by combining 8 pairs of primers to diagnose 5 different types of diarrheogenic Escherichia coli (ETEC, EHEC, EIEC, EPEC, EAEC) from fecal samples of children under 5 years old. The advantages of this technique are that it allows to diagnose these pathogens with its sensitivity and specificity nearly 100%. In addition, it can save reagents 5 times less than separate PCRs. 310 fecal samples from children with diarrhea under 5 years old at 3 hospitals in Hanoi were analysed by the multiplex PCR. EAEC (18.7%) was the most common causal agent, followed by EPEC (7.74%), EIEC (1.94%) and ETEC (0.65%). The results suggest that a promissing application of multiplex PCR will be used to diagnose diarrheogenic E. coli. 13 . tiêu: 1. Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi trong chẩn đoán E. coli gây tiêu chảy. 2. ứng dụng kỹ thuật này để chẩn đoán các E. coli gây tiêu chảy từ phân. ETEC: Có gen eltB và/ hoặc estA EHEC: Có gen vt1 và/ hoặc vt 2. Có gen eaeA,EHEC điển hình EPEC: Có gen bfpA và eaeA EIEC : Có gen ial EAEC : Có gen pCVD