Xây dựng quy trình nhân giống cây đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Establishment of the protocol for Gerbera propagation via in vitro culture technique Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Phơng Hoa, Nguyễn Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh Summary Using in vitro culture technique on Gerbera propagation is a critical/urgent requirement of the practical flower production in Vietnam. Several researches have been carried out on this flower. However there is still not an optimal protocol that can be applied for the large-scale production. The present study aimed to establish a protocol that can implement successfully in practical production. The study was conducted on 14 varieties. The followings are the main results obtained: - The best initial explants for in vitro culture was young blower bud. - The best medium for the highest multiplication rate was MS + 1ppm BA+ 0,3ppmKi + 0,2ppmIAA/liter. - The best medium for propagation was MS + 1,0 ppm Kinetin + 2,5% sacaro. - The best medium for rooting was MS + 0,1ppm NAA + 2,5% sacaro. - The best subtrate for plantlet hardening in the nursery was rice husk + humus (at ratio 1:1). - It was possible to transfer the in vitro plants to the nursery in spring, autum and winter season and the best time was sping. Keywords: gerbera, in vitro propagation 1. Đặt vấn đề Đã có một vài công bố về nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô ở ngoài nớc (Pierik và cộng sự, 1975; Erwin, J.j T.Heins, and W.Carlson, 1991; Tjia và Joiner, 1984). ở nớc ta một số tác giả đã công bố về nghiên cứu nhân giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô (Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trờng Sơn, 1991; Dơng Minh Nga, Hà Thị Thuý, Lê Quỳnh Mai, Đỗ Năng Vịnh, 2003). Tuy nhiên các nghiên cứu trên đều cha đa ra một quy trình hoàn chỉnh để có thể ứng dụng cho việc nhân giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô trong sản xuất. 2. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn 14 mẫu giống hoa đồng tiền nhập nội từ Côn Minh (TQ) dới dạng cây cấy mô xuất vờn. Đây là những giống đang trồng phổ biến trong sản xuất và đợc ngời tiêu dùng rất a chuộng. Trong đó, giống nghiên cứu chủ đạo là giống hoa kép, màu đỏ nhung, nhị nâu. 2.2. Phơng pháp nghiên cứu - Các phơng pháp nghiên cứu nuôi cấy mô hiện hành đã đợc sử dụng cho nghiên cứu. - Phơng pháp bố trí thí nghiệm và các chỉ tiêu theo dõi, điều tra đều đợc tiến hành theo phơng pháp nghiên cứu nông sinh học thông dụng. Các thí nghiệm đợc tiến hành tại phòng thí nghiệm, vờn thực nghiệm phòng CNSH - Viện Sinh học Nông nghiệp- Trờng ĐHNN I- Hà Nội. - Để có nguồn mẫu cho quá trình nuôi cấy in vitro chúng tôi đã chọn lựa các cây mẹ sạch bệnh, sinh trởng phát triển tốt nhất để làm nguồn mẫu ban đầu. 3. Kết quả và thảo luận 1 3.1. Giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu Bảng 1. ảnh hởng của thời gian khử trùng và vị trí lấy mẫu đến khả năng sống của mẫu cấy Thời gian khử trùng Cơ quan nuôi cấy Chỉ tiêu theo dõi 3 phút 5 phút 7 phút Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 93,3 86,7 73,3 Tỷ lệ mẫu chết (%) 6,7 13,3 26,7 Thân Tỷ lệ mẫu sống (%) 0,0 0,0 0,0 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 93,3 46,7 13,3 Tỷ lệ mẫu chết (%) 0,0 33,3 86,7 Cuống lá non Tỷ lệ mẫu sống (%) 6,7 20,0 0,0 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 86,7 66,7 3,3 Tỷ lệ mẫu chết (%) 0,0 26,7 96,7 Lá non Tỷ lệ mẫu sống (%) 13,3 6,6 0,0 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 80,0 46,8 6,7 Tỷ lệ mẫu chết (%) 6,7 20,0 93,3 Cuống hoa Tỷ lệ mẫu sống (%) 13,3 33,2 0,0 Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) 66,7 33,3 13,3 Tỷ lệ mẫu chết (%) 0,0 26,7 86,7 Hoa non Tỷ lệ mẫu sống (%) 33,3 40,0 0,0 Bảng 2. ảnh hởng của tổ hợp Benzyl adenin (BA)+ Kinetin (K) + Indol acetic axit (IAA) đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy (sau 16 tuần nuôi cấy) Sự phát sinh hình thái Công thức Lá non Cuống lá non Hoa non Cuống hoa (đối chứng) Mẫu có màu xanh, chết sau 2 tuần Chết Sau 2 tuần Chết Sau 2 tuần Chết Sau 2 tuần (0,3ppm BA + 0,2ppmK +0,2ppmIAA) Mẫu có màu xanh, phồng to và chết sau 5 tuần Chết Chết Chết (0,5ppm BA + 0,2 ppmK + 0,2ppmIAA) Sùi callus 15% sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 5%, sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 17% sau 9 tuần, có 6,7% tạo thành chồi sau 16 tuần nuôi cấy Chết (1,0ppm BA + 0,2 ppmK + 0,2ppmIAA) Sùi callus 23%, sau 9 - 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 13%, sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 25%, có 20% tạo chồi sau 16 tuần nuôi cấy Chết (1,5ppm BA + 0,2 ppmK + 0,2ppmIAA) Sùi callus 10%, sau 8 - 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 7%, sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 9%, sau 8 - 10 tuần nuôi cấy Chết (2 ppm BA + 0,2 ppmK + 0,2ppmIAA) Sùi callus 5%, sau 8 - 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 3%, sau 10 tuần nuôi cấy Sùi callus 3%, sau 8-10 tuần nuôi cấy Chết Kết quả bảng 1, 2 cho thấy: Tỷ lệ mẫu nhiễm tỷ lệ nghịch với thời gian khử trùng mẫu. Vị trí lấy mẫu khác nhau cho kết quả khử trùng khác nhau. Mẫu nuôi cấy từ hoa non cho tỷ lệ mẫu "sạch" cao nhất đạt 33,3%, tiếp theo là phần lá non, cuống hoa. Thời gian khử trùng 5 phút cho tỉ lệ mẫu sống cao nhất trên các vị trí lấy mẫu. Trên hầu hết các môi trờng bổ sung chất điều tiết sinh trởng mẫu cấy phát sinh hình thái theo hớng hình thành callus. Duy nhất chỉ có công thức bổ sung 1ppm BA + 0,2 ppmK + 2 0,2ppmIAA là cho 20% mẫu cấy tạo chồi ở mẫu cấy là hoa non, đây là hớng mà ngời nghiên cứu mong muốn. Thời gian để mẫu cấy tái sinh chồi là 16 tuần, đây là đặc điểm khá đặc trng của cây hoa đồng tiền. Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng đợc tiến hành để rút ngắn thời gian tái sinh chồi, lớp mỏng tế bào đợc cắt theo chiều ngang phần thân của thể tiền chồi với các kích thớc: 0,1mm, 0,3mm, 0,5mm, 0,7mm. Môi trờng nuôi cấy lớp mỏng là môi trờng MS có bổ sung 1ppmBA + 0,2ppmK + 0,2ppmIAA. Kết quả nghiên cứu đợc thể hiện ở bảng 3. Bảng 3. ảnh hởng của kích thớc lát mỏng đến khả năng phát sinh hình thái Tỷ lệ lát tái sinh theo thời gian (%) Đờng hớng phát sinh hình thái Kích thớc (mm) 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần Callus Chồi Số chồi/lát (4 tuần) chồi tạo thành (chồi) ĐC Thể tiền chồi tiếp tục sinh trởng 0,00 100,00 * 4-5 0,1 30 37 40 40 3,00 12,0 0,3 100 100 100 100 7,43 29,7 0,5 100 100 100 100 5,50 22,0 0,7 100 100 100 100 100% lát mỏng vừa tạo callus vừa tái sinh chồi ngay trên cùng một lát cắt 4,50 18,0 Nuôi cấy lớp mỏng đã rút ngắn thời gian và tăng số lợng chồi tạo thành rất đáng kể. Chỉ sau 4 tuần, từ một thể tiền chồi có thể cắt đợc 4 lát mỏng, mỗi lát mỏng ở kích thớc tối u cho 7,43 chồi/lát, vậy tổng số chồi thu đợc là 29,7 chồi trong khi đối chứng nếu đợc nhân thông thờng chỉ tạo 4-5 chồi (bảng 3). Nh vậy, việc nuôi cấy lớp mỏng đã làm tăng hệ số nhân từ 6 7 lần so với nhân nhanh thông thờng. 3.2. Giai đoạn nhân nhanh (bảng 4) Sau khi có đợc chồi non hình thành từ quá trình trên, tiến hành tách chồi non thành các cụm nhỏ có từ 2-3 chồi/cụm và đa vào môi trờng nuôi cấy có bổ sung riêng rẽ BA, kinetin, đờng sacaroza với các nồng độ khác nhau nhằm tìm ra môi trờng thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh. K có hiệu quả tót hơn cho giai đoạn nhân nhanh (kết quả thu đợc trình bày ở bảng 4). Nồng độ đờng trong môi trờng nuôi cấy 2,5% là tối u cho giai đoạn nhân nhanh. Nhìn chung, bổ sung chất điều tiết sinh trởng đều cho tác dụng kích thích sự đẻ chồi cao hơn so với đối chứng. Môi trờng cho hệ số nhân chồi cao nhất là môi trờng có bổ sung Kinetin ở nồng độ 1,0mg/l (hệ số nhân đạt 5,78 lần) đồng thời cho chất lợng chồi khá cao (chiều cao cây đạt 2,58 cm, số lá đạt 2,67lá/cây). Kết luận: môi trờng cho hệ số nhân chồi cao và chất lợng chồi tốt là: MS + 1ppm kinetin+ 2,5% đờng sacaro. Bảng 4. ảnh hởng của Kinetin đến quá trình nhân nhanh (sau 4 tuần nuôi cấy). Công thức Hệ số nhân Chiều cao (cm) Số lá/cây Đ/C (MS) 1,44 1,67 3,44 MS+0,3ppmK 2,45 1,60 2,78 MS+0,5ppmK 3,09 2,27 3,36 MS+1,0ppmK 5,78 2,85 3,67 MS+2ppmK 2,67 2,02 3,33 MS+3ppmK 2,22 2,26 2,56 CV (%) 1,60 1,00 0,60 LSD (5%) 0,08 0,04 0,03 3 3.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh (bảng 5) Bảng 5. ảnh hởng của NAA đến quá trình ra rễ Tỷ lệ ra rễ của chồi (%) Chiều cao trung bình cây (cm) Chỉ tiêu theo dõi Công thức Sau 1 tuần Sau 2 tuần Số rễ /cây Chiều dài TB rễ (cm) Ban đầu Sau 2 tuần Đ/C (MS) 0 100,00 4,30 0,50 4,00 5,80 MS+0,1ppmNAA 20,00 100,00 8,30 0,60 4,00 6,00 MS+0,3ppmNAA 40,00 100,00 4,00 1,00 4,00 5,80 MS+1,0ppmNAA 20,00 100,00 3,70 0,80 4,00 5,50 Chồi đồng tiền hoàn toàn có khả năng ra rễ sau 2 tuần nuôi cấy (tỷ lệ ra rễ đều đạt 100%) trên tất cả các môi trờng. Bổ sung 0,1ppm NAA đã cho tỷ lệ tạo rễ đạt 100% cũng nh chất lợng cây là cao nhất. Môi trờng thích hợp tạo cây hoàn chỉnh là MS + 0,1ppm NAA 3.4. Giai đoạn vờn ơm (bảng 6 và 7) Bảng 6. ảnh hởng của nền trồng đến tỷ lệ sống, sinh trởng, phát triển của cây cấy mô giai đoạn vơn ơm (sau 4 tuần theo dõi) Chỉ tiêu theo dõi Nền trồng Tỷ lệ sống (%) Chiều cao (cm) Số lá (lá/cây) Đất phù sa sông hồng 76,60 7,15 9,10 Cát 91,33 6,90 9,10 Trấu hun 6,00 5,98 6,16 Mùn 83,33 7,35 8,59 Đất + mùn (1:1) 80,00 7,37 8,67 Cát + trấu hun (1:1) 73,33 6,61 9,33 Mùn+trấu hun (1:1) 93,25 7,50 9,50 Bảng 7. ảnh hởng của thời vụ trồng đến sự sinh trởng của cây đồng tiền cấy mô ở vờn uơm (sau 4 tuần) CT Thời vụ Số cây thí nghiệm (cây) Tỷ lệ sống (%) Chiều cao cây (cm/cây) Số lá (lá/cây) 1. Vụ xuân (tháng 2- 3) 90 94,31 7,52 9,60 2. Vụ hè (tháng 6- 7) 90 35,46 6,86 8,85 3. Vụ thu (tháng 9- 10) 90 91,37 7,35 9,55 4. Vụ đông (tháng 12- 1) 90 83,56 6,17 7,97 Với các nền trồng khác nhau thì nền trồng bằng trấu hun hoàn toàn không thích hợp cho việc ra cây đồng tiền cấy mô (tỷ lệ sống chỉ đạt 6%). Giá thể cát cho tỷ lệ sống tơng đối cao nhng cây sinh trởng chậm. Giá thể thích hợp nhất là mùn + trấu hun (1:1) (tỷ lệ sống cao 93,5%, cây sinh trởng mạnh nhất). Thời vụ có thể ra cây đồng tiền cấy mô là vụ xuân, thu và vụ đông, tránh ra cây vào vụ hè do thời tiết quá nóng nắng, tỷ lệ chết khá cao. Thời vụ ra cây tốt nhất là vụ xuân Quy trình hình thành trên đã đợc vận dụng cho 13 giống thí nghiệm và đều cho kết quả tơng tự. Kết luận 3.1. Đã xây dựng đợc quy trình nhân giống hoa đồng tiền bằng phơng pháp nuôi cấy mô hoàn chỉnh nh sau: 4 Chế độ khử trùng thích hợp cho giai đoạn tạo nguồn mẫu ban đầu là: sử dụng HgCl2 nồng độ 0,1% thời gian 5 phút. Vị trí lấy mẫu thích hợp nhất cho tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nhất là hoa non. Môi trờng thích hợp cho sự phát sinh chồi là môi trờng MS +1ppmBA + 0,3ppmKi + 0,2ppmIAA +2,5 %sacaroza + 6,5g agar/lít. Môi trờng thích hợp cho quá trình nhân nhanh là: MS+ 1,0ppmKinetin +2,5% sacaroza+6,5g agar. Môi trờng ra rễ tốt nhất: MS + 0,1ppm NAA + 2,5% sacaroza +6,5g agar/lít Thời vụ ra cây tốt nhất là vụ xuân, cũng có thể ra cây đồng tiền cấy mô vào vụ thu và vụ đông. Giá thể ra cây tốt nhất cho cây đồng tiền cấy mô là mùn+trấu hun (1:1). 4.2. Đây là một quy trình có khả năng áp dụng rộng rãi ngoài sản xuất. Sơ đồ tóm tắt quy trình nhân giống hoa đồng tiền Cây mẫu Hoa non Khử trùng bằng HgCl2 0,1%trong 5 phút Tạo thể tiền chồi, cắt lớp mỏng tiền chồi (0,3mm) (16 tuần) MS +1ppm BA + 0,2 ppmKi + 0,2ppmIAA + 2,5% đờng sacarose +6,5g agar/lít Nhân nhanh (6 tuần) MS + 1ppm kinetin+ 2,5% đờng sacarose +6,5g agar/lít Ra rễ cho chồi in vitro (2 tuần) MS+0,1mgNAA+2,5% sacarose+6,5g agar/lít Vờn ơm (5 6 tuần) Mùn + trấu hun (1:1) Vờn sản xuất (sau 3 tháng có hoa) 5 Tài liệu tham khảo Erwin, J.j T.Heins, and W.Carlson (1991). Pot Gerbera production. Minnesota Flower Growers Association Bulletin 40(5):1 - 6. Dơng Minh Nga, Hà Thị Thuý, Lê Quỳnh Mai, Đỗ Năng Vịnh (2003). Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân nhanh các giống hoa đồng tiền Gerbera jasmesonii nhập nội bằng công nghệ in vitro Báo cáo khoa học Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003. Nhà xuất bản KHKT, trang 987 - 991. Pierik, R.L.M., J.L.M. Jansen, A.Maasdam và C.M. Binnendijk (1975). Optimalization of Gerberra plantlet production from excised capitulum explants. Scientia Horticulturae 3:35357. Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Trờng Sơn (1991). ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro để nhân nhanh cây hoa đồng tiền. Kết quả nghiên cứu khoa học 1986 1991, khoa Nông học, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, trang 6-8. Tjia, B., F.J. Marousky, and R.H. Stamps (1987). Response of cut gerbera flowers to fluoridated water and a floral preservative. HortScience 22:896-897. 6 . Xây dựng quy trình nhân giống cây đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Establishment of the protocol for Gerbera. cứu trên đều cha đa ra một quy trình hoàn chỉnh để có thể ứng dụng cho việc nhân giống hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô trong sản xuất. 2. Vật