TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN 2012 i LỜI CẢM TẠ Đầu tiên tôi xin chân thành gởi lời tri ân đến các quý Thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và nghiên cứu tại trường. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết Ngân đã tận tình hướng dẫn cũng như luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn học tập Trần Thị Tuyết Hoa, cùng với Thầy cô và các anh chị bộ môn Thủy sinh học ứng dụng đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Và tôi cũng xin chân thành biết ơn sâu sắc gia đình và những người thân đã tạo mọi điều kiện, tình yêu thương, sự động viên về vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian học và hoàn thành luận văn. Gửi lời cảm tạ đến tập thể lớp BHTS – K35 đã hết lòng ủng hộ, quan tâm, giúp đỡ trong suốt thời gian qua. Chân thành cảm ơn! ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm chọn lọc các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh. Vi khuẩn khảo sát gồm 9 dòng Bacillus: B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67 có nguồn gốc từ ao nuôi tôm sú thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng, có khả năng cải thiện chất lượng nước và nâng cao tỉ lệ sống của tôm. Phương pháp đục lỗ thạch được áp dụng để kiểm tra đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus, những dòng vi khuẩn không đối kháng lẫn nhau đã được kết hợp lại tạo hỗn hơp. Tượng tự đối với thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng nhóm Vibrio của các dòng/hỗn hợp Bacilus tìm được với chỉ tiêu đánh giá là đường kính vòng vô khuẩn xung quanh các lỗ thạch. Kết quả tìm được 9 hỗn hợp trong 4 nhóm vi khuẩn sau đây thể hiện sự tương thích lẫn nhau: (B2, B7, B41), (B2, B8, B41), (B9, B41), (B8, B67). Kết quả khảo sát cho thấy có 5 trong tổng số 9 dòng vi khuẩn Bacillus (B2, B8, B9, B41, B67) có khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio. Có 6 hỗn hợp được tuyển chọn H2 (B2, B8, B41), H4 (B2, B8), H5 (B2, B41), H7 (B8, B41), H8 (B9, B41), H9 (B8, B67) dựa trên hai tiêu chí đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus và khả năng đối kháng Vibrio. Tất cả 6 hỗn hợp được chọn lọc đều thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, tuy nhiên ở các mức độ khác nhau. Trong đó khả năng kháng Vibrio harveyi 30953 mạnh nhất là các hỗn hợp H7 (0,56 cm), H2 (0,70 cm); đối với Vibrio harveyi 0986 có H9 (0,67 cm), H2 (0,57 cm), H5 (0,48 cm) có kích thước đường kính vòng vô khuẩn cao. Riêng chủng Vibrio V(x) có nguồn gốc từ trại thực nghiệm khoa Thủy sản, trường Đại học Cần Thơ cho kết quả hai hỗn hợp H5 (0,73 cm) và H9 (0,60 cm) có khả năng đối kháng vượt trội hơn hẳn các hỗn hợp còn lại. iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH iv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT iv Phần 1: GIỚI THIỆU 1 1.1 Giới thiệu 1 1.2 Mục tiêu đề tài: 1 1.3 Nội dung đề tài: 2 1.4 Thời gian thực hiện đề tài: 2 Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Đặc điểm và vai trò của nhóm vi khuẩn Bacillus 3 2.1.1 Đặc điểm sinh học 3 2.1.2 Vai trò 3 2.2 Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản 6 2.3 Một giải pháp mới thay thế kháng sinh - Probiotic 8 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus ứng dụng trong thủy sản 9 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1 Vật liệu nghiên cứu 12 3.1.1 Thiết bị và dụng cụ 12 3.1.1 Nguồn vi khuẩn 12 3.1.3 Môi trường nuôi 12 3.1.1 Hóa chất 13 3.2 Phương pháp nghiên cứu 13 3.2.1 Khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc 13 3.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc 16 3.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp Bacillus 18 3.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 20 3.4 Phương pháp xử lí số liệu 20 4.1 Kết quả khảo sát đặc tính tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc 22 4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng Bacillus 23 4.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các hỗn hợp Bacillus. 24 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 30 5.1 Kết luận 30 5.2 Đề xuất 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 35 iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Đặc tính tương thích của 9 dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc 22 Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các dòng vi khuẩn Bacillus 23 Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus 25 DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn trong môi trường TSB 14 Hình 3.2: Sơ đồ xác định đặc tính tương thích bằng phương pháp đục lỗ thạch 15 Hình 3.3: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn riêng lẻ bằng phương pháp đục lỗ thạch 17 Hình 3.4: Sơ đồ xác định hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp vi khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch 19 Hình 3.5: Dụng cụ và qui trình đục lỗ thạch 21 Hình 4.1: Đường kính vòng kháng khuẩn 26 Hình 4.2: Phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS 28 Hình 4.3: Dịch khuẩn sau khi ly tâm 28 Hình 4.4: Kích thước vòng vô khuẩn 29 DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long CFU: Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc) OD: Optical Density TSB: Tryptic Soya Broth TSA: Tryptic Soya Agar TCBS: Thiosulphate citrate bile salt agar NA Nutrient Agar V. harveyi Vibrio harveyi B. subtillis Bacillus subtillis B. cereus Bacillus cereus 1 Phần 1: GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam, đặc biệt là vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Tuy nhiên tỉ lệ sống của đối tượng này thường không ổn định, việc nhiễm bệnh do vi khuẩn (chủ yếu là nhóm Vibrio) gây ảnh hưởng lớn đến năng suất nuôi. Hiện nay tình hình sử dụng kháng sinh bừa bãi trong phòng trị bệnh cho tôm nuôi đã gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh. Vì vậy, chế phẩm vi sinh (probiotic) đã trở thành một trong những cách tiếp cận mới thay thế cho việc sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên phần lớn các chế phẩm vi sinh sử dụng trong nước hiện nay đều có nguồn gốc ngoại nhập hoặc không rõ thành phần, chủng loại. Các chế phẩm vi sinh phân lập và sản xuất trong nước vẫn còn hạn chế. Việc nghiên cứu chọn lựa những hỗn hợp các dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh, có nguồn gốc tại địa phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Bacillus là một trong các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu nhiều nhất, nó có vai trò quan trọng vì khả năng sản sinh nhiều sản phẩm biến dưỡng thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu sinh học, hóa chất và enzyme. Một số dòng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus: B37, B41, B67, được phân lập từ ao nuôi tôm thâm canh ở tỉnh Sóc Trăng đã được chọn lựa nghiên cứu vì tính thích nghi với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL. Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài “Chọn hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối kháng Vibrio” đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài: Xác định hỗn hợp vi khuẩn Bacillus chọn lọc có khả năng đối kháng nhóm Vibrio gây bệnh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính tương thích lẫn nhau. 2 1.3 Nội dung đề tài: Khảo sát đặc tính tương thích (không đối kháng lẫn nhau) giữa các dòng Bacillus chọn lọc. Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Đánh giá khả năng đối kháng Vibrio các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn. 1.4 Thời gian thực hiện đề tài: Từ 09/2012 đến 12/2012. Tại phòng phân tích vi sinh - Bộ môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng, Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ. 3 Phần 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm và vai trò của nhóm vi khuẩn Bacillus 2.1.1 Đặc điểm sinh học Bacillus là những vi khuẩn gram dương, catalase dương tính, nhóm vi khuẩn này thường tìm thấy trong môi trường có độ pH biến động cao, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Thuộc chi Bacillaceae, đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hay thành sợi. Chúng có khả năng tạo ra bào tử khi xảy ra các điều kiện khắc nghiệt như thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt độ cao, phần lớn tế bào này có bào tử trong, hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bào tử có tính kháng nhiệt cao, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. Khi gặp điều kiện thuận lợi có thể nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng. Qua kính hiển vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng. Một đặc điểm nữa của vi khuẩn Bacillus là có bao nhầy (giác mạc), bao nhầy có cấu tạo polypeptit. Việc hình thành bao nhầy giúp cho vi khuẩn B. Subtilis có khả năng chịu được các điều kiện khắc nghiệt là do bao nhầy có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi gặp khô hạn (Trần Thị Thu Hiền, 2010). 2.1.2 Vai trò 4 Từ rất lâu Bacillus đã được sử dụng như một chế phẩm sinh học giúp cải tiến chất lượng nước vì có một số đặc tính probiotic: + Enzym protease: Vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại bào phân giải protein và chuyển hóa thành các phân tử có khối lượng phân tử nhỏ (các polypeptide, oligopeptid). Các chất này hoặc tiếp tục phân hủy thành các axit amin nhờ các peptidaza ngoại bào hoặc xâm nhập ngay vào tế bào rồi mới chuyển hóa thành axit amin. Một phần các axit amin này được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng, phần khác được tiếp tục phân giải tạo thành NH 3 và các sản phẩm khác. Quá trình này gọi là sự khoáng hóa hay amon hóa, đó là quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành dạng vô cơ (NH 3) . NH 3 được chuyển hóa thành NO 3- nhờ nhóm vi khuẩn nitrat hóa. Các hợp chất nitrat lại chuyển thành dạng nitơ phân tử nhờ các nhóm vi khuẩn khử nitrat. Các vi khuẩn tham gia vào quá trình amon hóa là Bacillus mycoides, B. subtillis, B. cereus, Pseudomonas. Aerurinosa, P. flourescens… Như vậy, vi khuẩn có khả năng tổng hợp protease mạnh là các vi khuẩn thuộc giống Bacillus và Pseudomonas. + Enzym amylase: Các amylase có nguồn gốc khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối. Nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn nhưng α-amylase chủ yếu tổng hợp từ Bacillus như Bacillus subtillis, B. licheniformis… Enzym amylase của Bacillus subtillis có khối lượng phân tử là 9. 900Da. Enzym amylase của Bacillus subtillis không đòi hỏi phải có chất hoạt hóa, pH tối ưu cho enzym amylase của Bacillus subtillis là 5,0-6,0. Enzym amylase của Bacillus subtillis được đông khô bền với canxi axetat và natri axetat. Enzym α-amylase được dùng cho giai đoạn thủy phân đầu tiên trong trao đổi chất của tinh bột. Các vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzym α-amylase cao. Ngày nay việc thu enzym α-amylase và protease từ các vi khuẩn chịu mặn chịu kiềm rất được quan [...]... B41 có đặc tính kháng khuẩn vượt trội Các dòng vi khuẩn B7, B17, B37, B38 không có khả năng đối kháng Vibrio Dựa vào khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh và đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn Bacillus, có 6 hỗn hợp được tuyển chọn H2, H4, H5, H7, H8, H9 để xác định khả năng kháng khuẩn Cả 6 hỗn hợp được tuyển chọn đều thể hiện đặc tính đối kháng Vibrio, tuy nhiên ở các mức độ đối kháng là khác... khuẩn mới được tuyển chọn sử dụng trong thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của hỗn hợp Bacillus Phục hồi và phân lập vi khuẩn Vibrio: 2 dòng vi khuẩn Vibrio harveyi 30953 và Vibrio harveyi 0986 được phục hồi tương tự như đối với vi khuẩn Bacillus Đối với chủng Vibrio chưa định danh đã được phân lập từ mẫu nước bể nuôi tôm ở trại thực nghiệm của khoa Thủy sản, Đai học Cần Thơ Mẫu nước... lần để đảm bảo tính chính xác 3.3.3 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các hỗn hợp Bacillus Các hỗn hợp đã được sàn lọc cho bước nghiên cứu khả năng kháng Vibrio gây bệnh dựa trên khả năng đối kháng Vibrio của từng dòng Bacillus và đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn này Các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đã tuyển chọn được kết hợp dựa vào đặc tính tương thích (xác định ở mục 3.3.1) với... Bacillus thấp hơn so với đối chứng 4.3 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các hỗn hợp Bacillus Dựa trên hai tiêu chí: khả năng đối kháng Vibrio của từng dòng Bacillus và đặc tính tương thích giữa các dòng vi khuẩn này các hỗn hợp đã được sàn lọc cho bước nghiên cứu khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh Từ kết quả hai thí nghiệm trên đã tuyển chọn được 6 trong tổng số 9 hỗn hợp: H2, H4, H5, H7,... đều đối kháng lẫn nhau Nghiên cứu của Trần Thị Thu Hiền (2010) đã tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn Bacillus T3, T4, T9 không có khả ức chế kiềm hãm lẫn nhau để cho vào sản phẩm sinh học 4.2 Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Vibrio của các dòng Bacillus Với mục tiêu lựa chọn các dòng vi khuẩn Bacillus có khả năng đối kháng vi khuẩn Vibrio, các dòng này được thử hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi. .. tương thích giữa các dòng Bacillus chọn lọc Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá những dòng vi khuẩn có khả năng tương thích (không đối kháng lẫn nhau) Chỉ có những dòng vi khuẩn tương thích mới có thể được sử dụng kết hợp lại trong cùng một hỗn hợp trong thí nghiệm kiểm tra khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của hỗn hợp Bacillus Phục hồi vi khuẩn Bacillus: 9 dòng vi khuẩn gồm B2, B7, B8, B9,... dòng vi khuẩn được đánh giá là tương thích lẫn nhau khi chúng không tạo các vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch Thí nghiệm được lập lại 3 lần để đảm bảo mức độ chính xác 3.3.2 Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh của các dòng vi khuẩn Bacillus chọn lọc Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá những dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh Những dòng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn. .. Nguồn vi khuẩn Vi khuẩn Bacillus đã được phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh ở ấp Tân Tĩnh, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng vào năm 2008 Sau khi phân lập vi khuẩn được lưu trữ trong 20% glycerol ở tủ đông (-80oC) Vi khuẩn khảo sát gồm 9 dòng vi khuẩn Bacillus: B2, B7, B8, B9, B17 B37, B38, B41, B67 Vi khuẩn Vibrio gồm 3 chủng: chủng Vibrio harveyi gồm 2 dòng (Vibrio harveyi 30953 và Vibrio. .. đã tuyển chọn được 6 trong tổng số 9 hỗn hợp: H2, H4, H5, H7, H8, H9 để tiếp tục khả sát khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp 24 Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus Đường kính vòng vô khuẩn (D- d, cm) Kí hiệu dòng Vibrio harveyi 30953 Vibrio harveyi 0986 Vibrio V (x) H2 0,70±0,20 ab 0,57±0,06ac 0,37±0,06a H4 0,40±0,10 ac 0,18±0,03b 0,15±0,05b H5 0,46±0,05... kính vòng vô khuẩn thể hiện khả năng đối kháng các chủng Vibrio của các dòng vi khuẩn Bacillus Các dòng vi khuẩn Bacillus B2, B8, B9, B41, B67 thể hiện khả năng đối kháng Vibrio thông qua vi c xuất hiện 23 vòng vô khuẩn tuy nhiên ở các mức độ khác nhau, trong đó B47, B67 có đường kính vòng vô khuẩn vượt trội hơn so với các dòng còn lại Các dòng vi khuẩn B7, B17, B37, B38 không có vòng vô khuẩn xung quanh . NGỌC HUYỀN CHỌN HỖN HỢP VI KHUẨN Bacillus ĐỐI KHÁNG Vibrio LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN . vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các dòng vi khuẩn Bacillus 23 Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn (cm) của Vibrio đối kháng các hỗn hợp vi khuẩn Bacillus