BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức Thành Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 iii LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóa luận đã được hoàn thành. Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường.  TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.  Các anh chị tại Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  Ban Giám đốc và các anh chị công ty Nam Khoa.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học 27 đã chia sẻ vui buồn trong quá trình học tập và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)”. Thời gian thực hiện từ tháng 03/2005 – 08/2005. Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA 2). Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon). Thí nghiệm được bố trí bằng cách trộn chung dịch chiết virus WSSV với các hợp chất chiết xuất từ thảo dược ở các nồng độ khác nhau, sau đó kiểm tra tác dụng của các hợp chất đối với virus WSSV. Sau khi sàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu quả tác dụng của các hợp chất này lên virus WSSV bằng cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất vào cơ thể tôm thí nghiệm. Đánh giá tác dụng của các hợp chất dựa vào kết quả Reatime PCR và tỷ lệ sống của tôm thí nghiệm. Kết quả đạt được sau khi thí nghiệm với các hợp chất ký hiệu D 2 , B, M: Ở các nồng độ thử nghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml): Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus hoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus. Hợp chất B và D 2 có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml). v MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt vi Mục lục v Danh sách các hình viii Danh sách các bảng và sơ đồ ix PHẤN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích, yêu cầu 2 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới 3 2.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam. 4 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú 6 2.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú 7 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 7 2.4.2 Khu vực phân bố 7 2.4.3 Ký chủ 8 2.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền 8 2.4.5 Cơ chế xâm nhập 9 2.4.6 Bệnh lý 9 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay 10 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến 10 2.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR 10 2.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật 11 2.6.1 Alkaloid 11 vi 2.6.2 Flavonoid 12 2.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản 12 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Vật liệu sinh học 15 3.2.2 Dụng cụ và hoá chất 15 3.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm 15 3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm ướt 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus 16 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm 16 3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16 3.3.4 Phương pháp PCR 16 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính 16 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 17 3.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường 17 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18 3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng 18 3.4.2 Thử nghiệm các hợp chất sàng lọc khi tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus và hợp chất vào tôm 19 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng 20 4.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D 2 20 4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B 21 4.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M 23 vii 4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV và hợp chất D 2 , B ở các nồng độ khác nhau 23 4.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D 2 27 4.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B 29 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA WSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất D 2 trong thời gian 2 giờ 20 Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA WSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ 21 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNA WSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất M trong thời gian 2 giờ 22 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D 2 trước thí nghiệm 28 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D 2 sau thí nghiệm 28 H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B trước thí nghiệm 30 H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B sau thí nghiệm 30 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG TRANG Bảng 2.1 Tên một số quốc gia và năm xuất hiện bệnh đốm trắng 3 Bảng 2.2 Đánh giá khả năng phát hiện bệnh đốm trắng bằng các phương pháp khác nhau 10 Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm 24 Bảng 4.2 Kết quả ghi nhận tỷ lệ tôm chết ở các lô trong quá trình thí nghiệm 25 Bảng 4.3 Kết quả Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng và hàm lượng DNA của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất trước thí nghiệm và sau thí nghiệm 26 SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). 18 Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau. 19 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề. Trong những thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt là các sản phẩm thủy sản ngày càng tăng cao. Vì thế, sản lượng thủy sản không thể đáp ứng được nhu cầu thị trường, trong khi nguồn lợi thủy sản ngày càng giảm do khai thác quá mức. Trước tình hình đó việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là sự bùng phát nghề nuôi tôm biển là một thực tế khách quan và là một nhu cầu cần thiết. Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta cũng phát triển mạnh trong vài thập kỷ gần đây, đặc biệt là nghề nuôi tôm ở các tỉnh ven biển. Nghề nuôi tôm nước ta phát triển chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn và kỹ thuật nuôi còn hạn chế. Điều đó dẫn đến sự suy thoái môi trường nuôi cùng sự bùng phát và lây lan của dịch bệnh. Khoảng 20 năm gần đây, dịch bệnh tôm xảy ra ở khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm. Một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đó là bệnh đốm trắng ( White Spot Desease ) do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). Thiệt hại có thể lên đến 100 % quần đàn từ 3 - 7 ngày kể từ khi phát hiện tôm bệnh. Có nhiều phương pháp phòng trị bệnh đốm trắng như dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… nhưng còn tồn tại nhiều mặt hạn chế và mức độ thành công chưa cao. Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật rất phong phú. Thảo dược từ xưa đã được ứng dụng phòng trị bệnh có hiệu quả trong y học và thú y. Tuy nhiên trong lĩnh vực thuỷ sản thì chưa được ứng dụng rộng rãi. Thử nghiệm một số hợp chất thảo dược trong phòng trị bệnh ở các đối tượng nuôi thuỷ sản là hướng nghiên cứu mới và cần khai thác. Được sự đồng ý của Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ (MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) và Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh cùng các thầy cô hướng dẫn, chúng tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” [...]... lọc một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có tác dụng lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) - Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất sàng lọc lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trong điều kiện thí nghiệm 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới Nuôi trồng thủy sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của một số nước trên. .. thí nghiệm 18 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) Thí nghiệm được thực hiện để khảo sát tác dụng trực tiếp của thuốc đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) Các hợp chất thử được hòa tan trong dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau Dịch chiết virus WSSV Trộn lẫn dịch chiết virus và mỗi loại hợp chất thử. .. thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau 20 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng Hiệu quả trực tiếp của các hợp chất B, M, D2 đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) được thử nghiệm bằng cách cho 250 µl dịch chiết. .. (1998), dịch chiết từ lá cây Clinacanthus nutans trộn với thức ăn viên theo liều lượng 1 g/kg thức 14 ăn có khả năng ức chế hoạt động virus gây ra bệnh đầu vàng (Yellow - Head Rhabdovirus) trên tôm sú (P monodon) Hiệu quả bảo vệ tôm sú khỏi virus này trong điều kiện thí nghiệm là 57,6 % Đây là một trong số rất nhiều công trình nghiên cứu dùng các hợp chất thảo dược để hạn chế một số bệnh gây chết hàng... công nghiệp nuôi tôm Ước tính tổng thiệt hại do virus gây ra trung bình hàng năm cho thế giới khoảng hơn 1 tỷ USD Bệnh do virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú đã gây tỷ lệ chết cao và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm công nghiệp của các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia và Ấn Độ Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên vào năm 1992 – 1993 ở Bắc Á, sau đó là các khu vực khác trên thế giới Tên một số. .. hành bệnh WSSV theo tháng trên tôm sú nuôi thương phẩm thì thấy tháng 7, 8, 9 có tỷ lệ nhiễm bệnh cao nhất (0,25 – 0,4); tháng 6 tỷ lệ thấp hơn (0,12) và tháng 5 chưa phát hiện thấy tôm nhiễm bệnh Các bệnh trên tôm xảy ra chủ yếu là do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), ngoài ra còn xuất hiện bệnh MBV, bệnh do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây còn xuất hiện bệnh phân trắng, ... nhau Ủ hỗn hợp dịch virus và hợp chất thử trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 28 – 30 oC Kiểm tra sự hiện diện của virus WSSV bằng PCR định tính nhưng không dùng NaOH-SDS trong quá trình ly trích DNA Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) 19 3.4.2 Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ướt Mục đích của bố trí thí nghiệm để biết... – pentadeca - trienylbenzoat để làm nguyên liệu sản xuất ra một số loại thuốc phòng trị bệnh do vi khuẩn và vi nấm gây ra như bệnh phát sáng, bệnh đóng rong, bệnh mang đen, bệnh mang vàng, bệnh đốm đỏ, bệnh mòn đuôi và hoại tử phụ bộ trên tôm sú, … Liều dùng trong phòng bệnh, cứ 15 ngày xử lý thuốc 1 lần với nồng độ 0,5 – 1 ppm Liều dùng trong trị bệnh ở nồng độ 1 – 3 ppm, sau 3 – 5 ngày lặp lại lần... với hợp chất B 1 2 3 4 5 6 7 M Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ ở 28 - 30 oC Ghi chú: Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp. .. Hiện tượng tôm chết hàng loạt ở các tỉnh ven biển phía Nam từ năm 1993 – 1994 đã xác định tôm sú có ba loại bệnh MBV, bệnh đốm trắng và bệnh đầu vàng (Bùi Quang Tề, 1996, 1997; Nguyễn Việt Thắng và CTV, 1998) Trong những năm gần đây, bệnh đốm trắng thường xuyên xuất hiện trong các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam Hầu hết các tỉnh khi tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng đã làm tôm chết hàng loạt gây tổn thất . THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon). “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) .