BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** 000 *** NGUYỄN QUỲNH NAM PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** 000 *** PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU CHẢY TRÊN HEO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS.Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ISOLATE BACILLUS SUBTILIS IN PIG FECES AND TEST THE ANTAGONISM WITH E. COLI K88 Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student Dr. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Quỳnh Nam Term: 2002 - 2006 Ho Chi Minh City 09/2006 iii LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính khắc ghi công lao khó nhọc của cha mẹ, Ngƣời đã sinh thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con ăn học nên ngƣời. Con xin cảm ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc qua mọi khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và trang bị cho em những kiến thức cần thiết nhất để em hoàn tất khóa luận này. Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu. Các Thầy, Cô tại phòng thực tập vi sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này. Các anh chị, các bạn cùng thực tập trong phòng vi sinh đã khuyến khích , ủng hộ và giúp đỡ để em thực hiện tốt khóa luận này. Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện khóa luận này. Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2006 Nguyễn Quỳnh Nam iv TÓM TẮT Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự hiệu quả trong phòng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo. Chúng tôi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13 chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn với E. coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức chế sự phát triển của E. coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12 giờ ) khi có sự hiện diện của E. coli. Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt iv Danh sách các hình v Danh sách các bảng vi 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. E. coli gây bệnh tiêu chảy 3 2.2. Enterotoxigenic E. coli 4 2.2.1. Độc tố nhạy nhiệt LT 4 2.2.1.1. Cấu tạo của LT-1 4 2.2.1.2. Cơ chế tác động của độc tố LT-1 4 2.2.2. Độc tố kháng nhiệt 5 2.2.2.1. Độc tố kháng nhiệt STa 5 2.2.2.2. Độc tố kháng nhiệt STb 6 2.2.3. Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC 7 2.3. Chế phẩm sinh học 9 2.3.1. Định nghĩa 9 2.3.2. Cơ chế tác động 9 2.3.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học 9 2.3.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học 10 2.3.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10 2.4. Bacillus subtilis 11 2.4.1. Đặc điểm phân loại 11 2.4.2. Đặc điểm hình thái 11 2.5. Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis 13 2.5.1. Giới thiệu 13 2.5.2. Peptide antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome 14 2.5.2.1. Subtilin 14 2.5.2.2. Subtilosin 15 2.5.2.3. Sublancin 16 2.5.2.4. TasA 16 2.5.3. Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome 18 2.5.3.1. Surfactin 17 2.5.3.2. Fengycin 19 2.5.3.3. Mycosubtilin 29 2.5.3.4. Bacilysocin 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 vi 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 22 3.1.1. Thời gian 22 3.1.2. Địa điểm 22 3.2. Vật liệu thí nghiệm 22 3.2.1. Mẫu thí nghiệm 22 3.2.2. Hóa chất 22 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 22 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 22 3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo 22 3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa 23 3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA 24 3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSB 24 3.3.5. Thử kháng sinh đồ 24 3.3.6. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% 24 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Kết quả 25 4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo 25 4.1.2. Kết quả thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA 27 4.1.3. Kết quả đối kháng trên môi trƣờng TSB 29 4.1.4. Kết quả thử kháng sinh đồ 30 4.1.5. Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột 32 4.2. Thảo luận 32 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 33 5.1. Kết luận 33 5.2. Đề nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC 39 vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ETEC : Enterotoxigenic E. coli EAEC : Enteroaggregative E. coli LT : Heat-labile toxin ST : Heat-stable toxin CT : Cholera enterotoxin EAST : Enteroaggreative stable-toxin ENS : Enteric nervous system GC-C : Guanylate cyclase C ABC : ATP-binding cassette viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 4.1 : Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA 25 Hình 4.2 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10 -2 27 Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ 31 Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E. coli qua các thời điểm 28 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc với E. coli ở nồng độ pha loãng là 10-2 trên môi trƣờng TSA 27 Bảng 4.2 : Kết quả số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ 29 Bảng 4.3 : Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng 30 Bảng 4.4 : Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc trên môi truờng thạch tinh bột 1% 32 [...]... heo và thử đối kháng với E coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ” 2 1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU 1.2.1 Mục đích Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh với chủng vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, nhằm phục vụ cho vi c ứng dụng vào trong chăn nuôi 1.2.2 Yêu cầu Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo ở Đồng Nai và Bình Dƣơng Chọn... dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E coli Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E coli gây bệnh trong môi trƣờng TSB Đánh giá sự an toàn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng phƣơng pháp kháng sinh đồ Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1% 3 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 E coli gây bệnh tiêu chảy Escherichia coli là vi khuẩn. .. Enterotoxigenic E coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến trong đƣờng tiêu hóa của heo và ngƣời, chiếm đến 66,7% trƣờng hợp tiêu chảy trên heo còn non và heo đang cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngƣời chăn nuôi Do tính chất đề kháng rất nhanh đối với nhiều loại kháng sinh của E coli, thì vi c sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời vi c sử dụng kháng sinh dẫn đến xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và làm... chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy và không mang các gene kháng kháng sinh là điều cần thiết Trƣớc tình hình đó đƣợc sự phân công của khoa công nghệ sinh học trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hƣớng dẫn của Ts Nguyễn Ngọc Hải chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và thử đối. .. vòng kháng khuẩn đƣợc tính bằng hiệu số giữa đƣờng kính vòng kháng khuẩn với đƣờng kính khuẩn lạc, chọn 5 chủng cho vòng kháng khuẩn lớn nhất để thực hiện đối kháng trên môi trƣờng TSB 3.3.4 Đánh giá sự đối kháng với E coli trong môi trƣờng TSB Cấy E coli và chủng vi khuẩn Bacillus subtilis vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, lấy 0,5 ml canh khuẩn của từng chủng Bacillus. .. năng phân giải tinh bột (+), phản ứng VP (+), catalase (+) kết quả quả thử sinh hóa đƣợc đối chứng với chủng Bacillus subtilis đối chứng dƣơng của phòng thí nghiệm đƣợc gọi là chủng số 1 trong các thí nghiệm bên dƣới 3.3.3 Thử đối kháng với E coli trên môi trƣờng thạch Cấy E coli và những chủng Bacillus subtilis phân lập đƣợc vào riêng mỗi ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng TSB ủ ở 37°C trong 24 giờ, thử đối. .. chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có kết quả thử sinh hóa là:  Phản ứng lecithinase (-)  Phản ứng khử nitrate (+)  Phản ứng khử citrate (+)  Sử dụng maltose (-)  Phản ứng catalase (+)  Phản ứng VP (+)  Phát triển trong điều kiện yếm khí (+) Tất cả các chủng này đƣợc thử đối kháng với E coli gây bệnh tiêu chảy trên heo 4.1.2 Kết quả đối kháng với E coli trên môi trƣờng TSA Chúng tôi thực hiện thử đối. .. quả bệnh tiêu chảy Bên cạnh đó một số sản phẩm probiotic phòng bệnh tiêu chảy trên thị trƣờng của Vi t Nam nhƣ Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng không phải vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng đƣợc nhiều loại kháng sinh (Ngô Thị Hoa, 2000) nên có khả năng phổ biến các gene kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đƣờng ruột của thú Do đó tiếp tục phân lập. .. subtilis nên tạo đƣợc vòng kháng khuẩn rõ ràng đƣợc thể hiện ở Hình 4.2 Ở nồng độ pha loãng 10-3 không có chủng nào tạo vòng kháng khuẩn, có thể nồng độ E coli không đủ lớn để khích thích Bacillus subtilis tổng hợp kháng sinh Có thể sự tổng hợp kháng sinh ức chế vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy trên heo của các chủng Bacillus subtilis đƣợc thử nghiệm đƣợc kích thích ở một nồng độ E coli đủ lớn Bảng 4.1:... sulfonilic, kháng sinh ……… 3.2.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Thiết bị: Nồi hấp vô trùng, tủ ấm, bình điều nhiệt, kính hiển vi, cân điện tử Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, phễu, bình tam giác, 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo Qui trình phân lập Bacillus subtilis trong phân heo Lấy 0,2g đến 0,3g phân heo cho vào ống nghiệm chứa 9ml nƣớc cất vô trùng, . gây bệnh thành ít nhất 6 loại: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enteroaggregative E. coli (EAEC), enteropathogenic E. coli. transposome hay phage. Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E. coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên heo. 2.2 Enterotoxigenic E. coli (ETEC) Enterotoxigenic