Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2011: Tp 9, s 3: 468 - 475 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI XáC ĐịNH CáC ĐIềU KIệN NUÔI CấY THíCH HợP Để SảN XUấT GIốNG KHởI ĐộNG Từ NấM MốC Rhizopus oryzae Went v Prinsen Geerlings Determine of Appropriate Cultural Growth Conditions for Production of Starter Culture from Rhizopus oryzae Went and Prinsen Geerlings Lờ Minh Nguyt 1 , Nguyn Trng Thnh 1 , Nguyn Th Thanh Loan 2 1 Khoa Cụng ngh Thc phm, Trng i hc Nụng nghip H Ni 2 Sinh viờn K51 ngnh Bo qun ch bin, Trng i hc Nụng nghip H Ni a ch email tỏc gi liờn lc:nguyetlmh@yahoo.com Ngy gi ng: 26.04.2011; Ngy chp nhn: 22.06.2011 TểM TT Ging khi ng l ngun cung cp vi sinh vt thun chng sn xut cỏc sn phm lờn men truyn thng n nh cht lng v m bo an ton. Trong ging khi ng cú cha cỏc bo t nm mc v h cỏc enzyme thu phõn c to thnh trong quỏ trỡnh nm mc sinh trng. Thớ nghim ó xỏc nh c cỏc iu kin nuụi cy thớch hp cho s to thnh thnh bo t v sinh tng hp enzym protease ca nm mc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings nhm xõy dng quy trỡnh sn xut ging khi ng phc v cho sn xut chao. C th l ó xỏc nh c ngun c cht thớch hp cho sn xut ging khi ng t nm mc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings l bt ngụ hoc bt u tng; t l phi trn vi bt go l 60/40. Nguyờn liu c hp kh trựng, lm ngui, tri thnh lp mng 2 cm, tip ging bng hn dch bo t cú mt 2.10 7 bt/ml vi t l l 2 ml dch ging/ 100 g mụi trng nuụi cy. Thi gian nuụi cy l 54 h cú o trn 1 ln sau 24h. Sau khi nuụi cy thu c ch phm thụ, nhm bo ton hot lc enzym v bo t sng ca ging khi ng nờn sy ụng khụ (-45 0 C) hoc 40 o C bng t sy thng n khi t m l 10%. T khúa: Ging khi ng, nm mc, Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings. SUMMARY A starter culture is a source of pure microorganisms used to produce traditional fermented products of high quality, stability, and safety. The starter culture contains spores and hydrolysis enzymes produced during mold growth. This work was conducted to determine the appropriate cultural growth conditions for Rhizopus oryzae and biosynthesis of the protease enzymes, and then set up a manufacturing process for the starter culture which can be used to produce the fermented product from tofu. The microorganism was most successfully cultured with corn or soybean meal and rice flour in a 60/40 ratio. The flour mixture was autoclaved, spread to a height of 2 cm followed by the addition of the spore suspension with a density of 2.10 7 bt/ml at a rate of 2 ml of spores/100 g culture medium. Incubation lasted 54 h with a turning at 24h. After incubation, spores and enzymes were preserved through freeze drying (-45C) or oven drying (40C) until a moisture of 10% was reached. Key words: Mold, Went & Prinsen Geerlings, starter culture. Rhizopus oryzae 468 Xỏc nh cỏc iu kin nuụi cy thớch hp sn xut ging khi ng t nm mc 1. ĐặT VấN Đề ở Việt Nam, các sản phẩm thực phẩm lên men chủ yếu đợc sản xuất bằng kỹ thuật lên men truyền thống, sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên nên rất dễ bị nhiễm tạp các vi sinh vật không mong muốn, đặc biệt l các loại nấm mốc sinh độc tố gây nguy hiểm cho ngời sử dụng (Nguyễn Hữu Phúc, 1998). Do đó, việc nghiên cứu để sử dụng các chủng nấm mốc thuần chủng vo sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống ở nớc ta l rất cần thiết. Từ một lợng nhỏ mốc giống ban đầu qua quá trình nhân giống ngời ta sẽ thu đợc giống khởi động. Giống khởi động còn đợc gọi l mốc giống hay hoa mốc. Mục đích chính của quá trình sản xuất giống khởi động l tạo điều kiện thuận lợi cho nấm mốc sinh trởng v phát triển trên cơ chất để lm nguồn cung cấp vi sinh vật cho quá trình sản xuất sau ny. Ngoi ra trong giống khởi động còn có một lợng các enzym nhất định m nấm mốc sinh tổng hợp đợc trong quá trình phát triển, do đó giống khởi động còn đóng vai trò quan trọng trong việc thuỷ phân tinh bột v protein của nguyên liệu, cung cấp các chất dinh dỡng cần thiết cho sự sinh trởng của vi sinh vật v tạo hơng cho sản phẩm cuối cùng. Tuỳ thuộc vo mỗi loại sản phẩm m ngời ta sử dụng các loại giống khởi động đợc sản xuất từ các loại nấm mốc khác nhau. Để sản xuất chao (đậu phụ lên men) ngời ta sử dụng giống khởi động lm từ nấm mốc Mucor, Rhizopus, Actionomucor vì các giống nấm mốc ny có mu trắng đục, trắng ng không lm ảnh hởng tới mu sắc của sản phẩm; hệ sợi nấm mảnh nhng di có khả năng tạo thnh một lớp mng mỏng xung quanh miếng đậu chao, có tác dụng giữ hình dáng miếng chao tốt (Nguyễn Hữu Phúc, 1998); có khả năng sinh enzym protease; chỉ hình thnh bo tử sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định Thí nghiệm ny đợc tiến hnh nhằm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp để sản xuất ra giống khởi động tốt từ nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings nhằm phục vụ cho quá trình sản xuất chao. 2. VậT LIệU V PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Vật liệu Chủng nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings đã đợc phân lập từ đậu tơng thối hỏng v bánh men, sau đó đợc định danh bằng phơng pháp sinh học phân tử tại Phòng thí nghiệm về Nấm học, Trờng Đại học Catholique de Louvain, Vơng quốc Bỉ (MUCL). Bố trí thí nghiệm Sử dụng phơng pháp thay đổi một nhân tố, các nhân tố khác giữ nguyên, sau khi chọn đợc giá trị thích hợp của nhân tố đó thì giá trị ny đợc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm đợc bố trí để nghiên cứu ảnh hởng của các yếu tố nh nguồn nguyên liệu, mức độ thoáng khí, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ giống nấm mốc cấy vo, sự đảo trộn trong quá trình nuôi, chế độ sấy đến hoạt tính, nhằm xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp. Điều kiện tiến hnh thí nghiệm ban đầu l 100 g cơ chất đợc khử trùng v lm chín có độ ẩm 55% trải thnh lớp mỏng 3 cm trên khay inox, đợc lm nguội v tiếp giống bằng cách dùng xylanh hút 2 ml hỗn dịch bo tử giống (2.10 7 bo tử/ml) rồi phun đều lên lớp nguyên liệu, nhiệt độ nuôi cấy l 30 0 C, thời gian nuôi cấy l 48h, không đảo trộn. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hởng của nguồn cơ chất đối với khả năng sinh tổng hợp enzym protease v khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings đợc tiến hnh trên bốn loại môi trờng khác nhau l 469 Lờ Minh Nguyt, Nguyn Trng Thnh, Nguyn Th Thanh Loan bột gạo, bột sắn, bột đậu tơng v bột ngô, các loại bột đợc bổ sung 15% trấu nhằm tạo độ thoáng khí. Để nghiên cứu ảnh hởng của thời gian đến khả năng tổng hợp enzyme protease v khả năng hình thnh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings thí nghiệm nuôi cấy chủng ny trong những khoảng thời gian khác nhau tơng ứng l 36h, 42h, 48h, 54h, 60h. Thí nghiệm xác định ảnh hởng của tỷ lệ giống cấy vo đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease v khả năng tạo bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings đợc tiến hnh cấy nấm mốc ny với lợng giống mốc cấy vo khác nhau lần lợt l 1ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml hỗn dịch bo tử nấm mốc (2.10 7 bo tử/ml)/100 g cơ chất. Thí nghiệm về ảnh hởng của mức độ thoáng khí trong môi trờng nuôi cấy rắn đến khả năng sinh bo tử v tổng hợp enzym protease của nấm mốc Rhizopus oryzae đợc tiến hnh bằng cách nuôi chủng ny trên các lớp môi trờng có độ dy khác nhau lần lợt l 2 cm, 3 cm, 4 cm, 5 cm. Thí nghiệm về ảnh hởng của chế độ sấy đợc tiến hnh với 4 công thức, một công thức ở chế độ sấy đông khô v 3 công thức ở tủ sấy với các mức nhiệt độ khác nhau, sấy đến khi mẫu đạt độ ẩm 10%. Mỗi lần sấy 2 kg chế phẩm ớt. Các chỉ tiêu theo dõi: Hoạt độ enzym protease, số lợng bo tử v trạng thái hệ sợi nấm mốc. Phơng pháp nghiên cứu Sử dụng phơng pháp Anson cải tiến để xác định hoạt lực của enzyme protease trong chế phẩm enzyme thô (Lê Thanh Mai v cs., 2005). Xác định số lợng bo tử của nấm mốc bằng phơng pháp trực tiếp bằng buồng đếm Goriaev Thom (Nguyễn Thnh Đạt v cs., 1990). Xác định số lợng bo tử sống bằng phơng pháp gián tiếp: nuôi v đếm số khuẩn lạc trên môi trờng PDA (Nguyễn Thnh Đạt v cs., 1990). 3. KếT QUả V THảO LUậN 3.1. ảnh hởng của nguồn cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease v khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings Enzym protease l enzym cảm ứng điển hình của nấm mốc nói chung v của Rhizopus nói riêng. Nguồn cơ chất cảm ứng tốt nhất của enzym protease l các nguồn nitơ hữu cơ nh bột ngô, bột mỳ, bột đậu tơng Số liệu bảng 1 cho thấy rằng khả năng sinh enzym protease của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings khi nuôi cấy trên môi trờng bột ngô ở CT 1.4 l cao nhất (2,58 đv/g) v thấp nhất khi nuôi cấy trên môi trờng bột sắn ở CT 1.2 (0,76 đv/g). Đó l do protease l enzym đợc tổng hợp với cơ chất cảm ứng l nguồn nitơ hữu cơ, bột đậu tơng v bột ngô có hm lợng protein cao hơn so với gạo v bột sắn nên lợng enzym protease tạo thnh cao hơn. Về khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings: khi nuôi cấy trên môi trờng bột ngô ở CT 1.4 l cao nhất (3,23.10 7 bt/g) v thấp nhất khi nuôi cấy trên môi trờng bột sắn (1,60.10 7 bt/g). Nh vậy, môi trờng bột ngô v bột đậu tơng đều l những môi trờng thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzym protease của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings. Tuy nhiên, xét về tính thông dụng v mục đích của mốc giống l tạo ra nhiều bo tử nên nghiên cứu ny đã chọn bột ngô l nguồn cơ chất cho các thí nghiệm tiếp theo. 470 Xỏc nh cỏc iu kin nuụi cy thớch hp sn xut ging khi ng t nm mc Bảng 1. ảnh hởng của nguồn cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease v khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings CT Hot enzym protease (v/g) S lng bo t (bt/g) Mụ t trng thỏi h mc ging CT 1.1 0,88 c 1,98.10 7 - H si nm bao ph kớn ht cm - Si nm cú mu trng - ó xut hin bo t CT 1.2 0,72 c 1,60.10 7 - H si nm ngn, mu trng - Cha bao ph ht b mt c cht. - Bo t xut hin rt ớt CT 1.3 1,76 b 2,66.10 7 - H si nm bao ph ton b b mt c cht - Si nm mc di, cú mu trng - Cú xut hin bo t en CT 1.4 2,58 a 3,23.10 7 - H si nm bao ph ton b b mt c cht - Si nm di mu trng - Bo t en xut hin nhiu LSD 0,05 0,23 (Trong cựng mt ct, cỏc s cú ch cỏi ging nhau thỡ khụng khỏc nhau cú ý ngha mc ý ngha = 5%) CT1.1: Bt go; CT1.2: Bt sn; CT1.3: Bt u tng: CT1.4: Bt ngụ; 3.2. ảnh hởng của tỷ lệ nguyên liệu Khả năng tổng hợp sinh khối của vi sinh vật không những phụ thuộc vo mỗi nguồn nitơ m còn phụ thuộc vo cả tỷ lệ cacbon v nitơ trong môi trờng. Tỷ lệ ny thích hợp sẽ tạo cho nấm mốc khả năng trao đổi chất, khả năng tích tụ cao các sản phẩm sinh tổng hợp v đặc biệt l sinh bo tử cao. Do đó, ở thí nghiệm ny, bột gạo v bột ngô đợc phối trộn theo các tỷ lệ khác nhau (Bảng 2). Số liệu cho thấy, khả năng sinh bo tử v khả năng sinh tổng hợp enzyme protease khi nuôi cấy trên môi trờng ở công thức 2.1 l cao nhất (4,34.10 7 bt/g v 3,65 U/g) v ít nhất khi nuôi cấy trên môi trờng ở công thức 2.3 (2,78.10 7 bt/g v 1,56 U/g). Kết quả thí nghiệm chỉ ra môi trờng nuôi cấy với tỷ lệ 40% bột gạo v 60% bột ngô l môi trờng thích hợp nhất cho sự sinh bo tử v khả năng tổng hợp enzym protease của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings. 3.3. ảnh hởng của thời gian nuôi cấy Kết quả cho thấy sau 36h nuôi mốc, khả năng sinh enzym protease của nấm mốc Rhizopus cao nhất (2,47 đv/g) v thấp nhất ở 60h (0,62 đv/g). Thời gian nuôi mốc cng kéo di thì hoạt độ enzyme trong khối nguyên liệu giảm nhng ngợc lại thì khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings lại tăng. Số lợng bo tử tăng mạnh từ giờ thứ 36 đến giờ thứ 48, từ giờ thứ 54 trở đi thì số lợng bo tử tăng chậm lại. Trong giai đoạn đầu quá trình sinh trởng của nấm mốc (36h đầu tiên), nấm mốc sẽ thuỷ phân các nguồn cơ chất để tích luỹ sinh khối v khả năng sinh tổng hợp enzym protease l cao nhất (Bảng 3). Khi thời gian cng kéo di thì hoạt độ của enzym protease cng giảm vì lúc ny nấm mốc đã chuyển sang giai đoạn sinh bo tử nhng số lợng bo tử chỉ tăng nhanh đến một giới hạn no đó rồi chững lại. Đây l quá trình sản xuất mốc giống nên khả năng sinh bo tử l mục đích chính, vì thế cần quan tâm đến số lợng bo tử nhiều hơn khả năng sinh enzym protease. Số lợng bo tử chênh nhau không nhiều giữa 2 thời điểm 54h v 60h nên có thể kết thúc thời gian nuôi mốc ở giờ thứ 54 hay giờ thứ 60 đều thích hợp. Tuy nhiên, trong sản xuất thì phải quan tâm tính kinh tế, để giảm chi phí sản xuất, mức thời oryzae Went & Prinsen Geerlings 471 Lờ Minh Nguyt, Nguyn Trng Thnh, Nguyn Th Thanh Loan gian l 54h đợc chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 2. ảnh hởng của tỷ lệ nguyên liệu đến khả năng sinh bo tử v khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings CT Hot enzym protease (v/g) S lng bo t (bt/g) Mụ t trng thỏi mc ging CT2.1 3,65 a 4,34.10 7 - H si nm di, mu trng bao ph ton b c cht - Cú bo t en CT2.2 1,95 a 3,62.10 7 - H si nm khụng phỏt trin cao na, ó bt u xp xung - Xut hin bo t en CT2.3 1,56 b 2,78.10 7 - Si nm mu trng, bao ph kớn b mt c cht - Cú bo t en LSD 0,05 0,85 (Trong cựng mt ct, cỏc s cú ch cỏi ging nhau thỡ khụng khỏc nhau cú ý ngha mc ý ngha = 5%) CT2.1: (40% bt go : 60% bt ngụ) ; CT2.2: (50% bt go : 50% bt ngụ) ; CT2.3: (60% bt go : 40% bt ngụ). Bảng 3. ảnh hởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease v khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings Thi gian nuụi mc Hot enzym protease (v/g) S lng bo t (bt/g) Mụ t trng thỏi mc ging 36h 2,47 a 3,55.10 7 - Si nm bao ph ton b khi c cht - Si nm phỏt trin di, mu trng - ó xut hin bo t 42h 1,92 b 5,20.10 7 - Si nm bao ph ton b khi c cht thnh dng bỏnh - Si nm di, mu trng - Bo t mu en xut hin nhiu 48h 1,05 c 7,93.10 7 - Si nm bụng xp, mu trng, bao ph kớn c cht - Bo t en xut hin nhiu 54h 0,65 d 22,5.10 7 - Si nm khụng phỏt trin cao na - ó cú hin tng xp xung - Bo t en xut hin rt nhiu. 60h 0,62 d 27,8.10 7 - Si nm xp xung. - Bo t xut hin rt nhiu to thnh lp mu en trờn b mt c cht. LSD 0,05 0,17 (Trong cựng mt ct, cỏc s cú ch cỏi ging nhau thỡ khụng khỏc nhau cú ý ngha mc ý ngha = 5%) Bảng 4. ảnh hởng của tỷ lệ giống cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzym protease v khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings T l ging cy Hot enzyme protease (v/g) S lng bo t (bt/g) Mụ t trng thỏi mc ging 1 ml 0,436 d 7,63.10 7 - Si nm bt u xp xung. - Si nm bao ph ton b khi c cht, cú mu trng - Nhiu bo t en xut hin 2 ml 0,681 c 32,3.10 7 - Si nm bao ph kớn khi c cht - Si nm bt u xp xung - Cú rt nhiu bo t en 3 ml 0.699 b 27,3.10 7 - Si nm bao ph ton b khi c cht - Si nm cú hin tng xp xung - Bo t en xuõt hin 4 ml 1,203 a 6,23.10 7 - Si nm xp xung, cú mu trng - Bo t xut hin ớt hn LSD 0,05 0,018 472 Xỏc nh cỏc iu kin nuụi cy thớch hp sn xut ging khi ng t nm mc (Trong cựng mt ct, cỏc s cú ch cỏi ging nhau thỡ khụng khỏc nhau cú ý ngha mc ý ngha =5%) Mt bo t trong ging cy vo l 2.10 7 bt/ml. 3.4. ảnh hởng của tỷ lệ giống cấy Kết quả bảng 4 cho thấy, ở các tỷ lệ giống cấy vo khác nhau thì khả năng sinh bo tử của nấm mốc cũng khác nhau. Khi tỷ lệ giống cấy vo môi trờng tăng từ 1- 2 ml thì khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings tăng, nếu tiếp tục tăng tỷ lệ giống cấy lên 3 4 ml thì khả năng sinh bo tử bắt đầu có xu hớng giảm dần. Bên cạnh đó thì hoạt lực của enzym protease lại tăng dần khi tỷ lệ giống cấy vo cng nhiều. Hoạt lực enzym protease cao nhất khi tỷ lệ giống cấy vo 4 ml (1,203 đv/g) v thấp nhất khi ở 1 ml giống cấy vo môi trờng nuôi cấy (0,436 đv/g). Có thể giải thích kết quả ny do khi đa vo môi trờng nuôi cấy tỷ lệ giống cng cao thì nấm mốc phát triển hệ sợi nấm, kết thnh bánh v phát triển sinh khối nhiều. Nếu giảm tỷ lệ giống sẽ dẫn đến hệ sợi nấm sinh trởng ở dạng bo tử v giảm hiệu suất hình thnh enzyme. Xét mục đích tạo mốc giống thì khả năng sinh bo tử phải nhiều để đảm bảo rằng khi sử dụng giống khởi động cho các sản phẩm lên men, chỉ sử dụng một lợng cng ít cng tốt, vì vậy mức tỷ lệ giống cấy vo l 2 ml hỗn dịch (2.10 7 bo tử/ml) cho 100 g nguyên liệu ở các thí nghiệm tiếp theo đã đợc chọn. 3.5. ảnh hởng của mức độ thoáng khí Nấm mốc l loại vi sinh vật hô hấp hiếu khí, vì thế mức độ thoáng khí l một trong những ảnh hởng quan trọng tới sự phát triển của chúng. Theo số liệu bảng 5, độ dy lớp nguyên liệu khác nhau thì khả năng sinh bo tử v khả năng sinh tổng hợp enzym của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings l khác nhau ở mức ý nghĩa = 0,05. Khả năng sinh bo tử v khả năng sinh tổng hợp enzym cao nhất khi nuôi cấy độ dy lớp nguyên liệu l 2 cm (5,28.10 8 bt/g; 0,421 U/g). Hoạt độ enzym thấp nhất khi nuôi cấy ở độ dy 4 cm (2,64.10 8 bt/g, 0,212 U/g). Độ dy lớp nguyên liệu cng mỏng thì diện tích mặt thoáng cng lớn v ngợc lại. Mặt thoáng rộng thì sự tiếp xúc của nấm mốc với môi trờng không khí cng cao, sự hấp thụ oxy cng lớn, sự trao đổi chất diễn ra cng mạnh, sản phẩm tạo ra cng nhiều. Vì vậy độ dy nguyên liệu 2 cm rất thích hợp cho nấm mốc Rhizopus oryzae sinh bo tử v enzym protease. Độ dy nguyên liệu ny đợc lựa chọn để dùng cho thí nghiệm tiếp theo. 3.6. ảnh hởng của sự đảo trộn Khi hệ sợi nấm phát triển rất mạnh trên bề mặt cơ chất rắn sẽ tạo thnh bánh hoặc mảng khiến độ thoáng khí trong môi trờng giảm, khi có tác động phá vỡ cấu trúc hệ sợi nấm dạng bánh hoặc mảng đó sẽ lm thay đổi trạng thái chung của khối nấm mốc. Bảng 5. ảnh hởng của mức độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease v khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings dy lp nguyờn liu Hot enzyme protease (v/g) S lng bo t (bt/g) Mụ t trng thỏi mc ging 2cm 0,421 a 5,3.10 8 - S i nm bt u xp xung, bao ph kớn ton b khi c cht - Bo t en dy ph kớn b mt 3cm 0,391 a 4,4.10 8 - Si nm ang xp xung - Bo t en rt nhiu 4cm 0,217 c 2,6.10 8 - Si nm ó xp xung - Bo t en lm m trờn b mt c cht 0,272 b 3,1.10 8 - Si nm mu trng ph kớn khi c cht 473 Lờ Minh Nguyt, Nguyn Trng Thnh, Nguyn Th Thanh Loan 5cm - Rt nhiu bo t en LSD 0,05 0,027 (Trong cựng mt ct, cỏc s cú ch cỏi ging nhau thỡ khụng khỏc nhau cú ý ngha mc ý ngha = 5%) Bảng 6. ảnh hởng của sự đảo trộn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease v khả năng sinh bo tử của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings CT Hot enzyme protease (v/g) S lng bo t (bt/g) Mụ t trng thỏi mc ging CT 6.1 0,115 a 5,7 . 10 8 - Si nm mu trng bao ph ton b khi c cht - Cú nhiu bo t en CT 6.2 0,477 a 7,7 . 10 8 - Si nm ngn, mu trng, mc tng cm - Bo t en mc dy c ph kớn b mt khi c cht CT 6.3 0,246 a 6,8 . 10 8 - H si nm mu trng, ngn, tha tht - Bo t en lm m LSD 0,05 0,02 (Trong cựng mt ct, cỏc s cú ch cỏi ging nhau thỡ khụng khỏc nhau cú ý ngha mc ý ngha = 5%) CT 6.1: Khụng o trn; CT 6.2: o trn 1 ln sau 24h; CT 6.3: o trn 2 ln sau 24h v 48h So sánh 3 công thức với các mức độ đảo trộn khác nhau thì khả năng sinh bo tử v khả năng tổng hợp enzyme protease của nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings l không khác nhau với mức ý nghĩa = 0,05 (Bảng 6). Số lợng bo tử v hoạt độ enzyme l cao nhất khi đảo trộn 1 lần ở CT 6.2 (7,68.10 8 bt/g; 0,477 U/g). ở CT 6.1, khi không đảo trộn thì số lợng bo tử v hoạt độ enzym l thấp nhất (5,76.10 8 bt/g; 0,115U/g). Do cấu tạo hệ sợi nấm không phân nhánh, sợi nấm khí sinh phát triển di, phát triển lan trn, tạo bánh sau một thời gian phát triển sinh khối. Sau 24h nuôi cấy, hệ sợi nấm còn cha phát triển cha ổn định nên cha tạo độ vững chắc, vì vậy khi đảo trộn sẽ phá vỡ sự ổn định của cấu trúc hệ sợi, sau đó những sợi gẫy đó tiếp tục phát triển một pha mới nên sẽ kéo di thời gian sinh trởng v phát triển, vì vậy số lợng bo tử v khả năng sinh tổng hợp enzyme đợc tăng lên so với khi không đảo trộn. ở CT 6.3, lần đảo trộn thứ 2 sau 48h nuôi cấy v kết thúc thí nghiệm sau 54h, khi đó hệ sợi nấm bị phá vỡ cấu trúc lần thứ hai nên cha đủ thời gian để nó phát triển ổn định sang một pha mới. Vì vậy số lợng bo tử tuy có nhiều hơn so với khi không đảo trộn nhng lại thấp hơn khi đảo trộn 1 lần. Thí nghiệm đã chọn chế độ đảo trộn 1 lần sau 24h nuôi mốc. 3.7. ảnh hởng của chế độ sấy Giống khởi động thu đợc sau khi nuôi cấy có độ ẩm khoảng 55%, nếu cha đợc sử dụng ngay, thờng đợc sấy khô đến độ ẩm khoảng 8 10%, loại bỏ trấu đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm để dùng dần cho sản xuất. Khả năng sống sót của bo tử sau khi sấy cao nhất khi chế phẩm đợc sấy đông khô (25,4%) v thấp nhất khi sấy ở nhiệt độ 50 o C (6,8%) bằng tủ sấy thờng (Bảng 7). Tơng tự nh vậy, hoạt độ enzym protease sau khi sấy còn lại cao nhất khi chế phẩm đợc sấy ở chế độ sấy đông khô (96,5%) v thấp nhất khi sấy ở 50 o C bằng tủ sấy thờng (54,3%). Khi chế phẩm đợc sấy bằng tủ sấy thờng ở nhiệt độ 40 o C (83,89%) thì hoạt độ enzym sau khi sấy cao nhất. Hoạt độ enzym của chế phẩm khi sấy ở các mức nhiệt độ 474 Xỏc nh cỏc iu kin nuụi cy thớch hp sn xut ging khi ng t nm mc khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa ở mức = 5%. Nguyên nhân ở đây l do khi sấy đông khô, quá trình sấy đợc thực hiện ở nhiệt độ sấy rất thấp (dới - 45 o C) với áp suất chân không nên quá trình lm khô nhanh, sự biến tính protein của tế bo vi sinh vật, trong đó kể cả sự phá huỷ của hệ thống enzym có thể coi l rất ít, ở mức thấp nhất. Bảng 7. ảnh hởng của chế độ sấy tới hoạt tính của enzyme protease v khả năng sống của bo tử nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings Ch sy Hot enzyme protease (% so vi trc khi sy) S lng bo t sng (% so vi trc khi sy) Mụ t trng thỏi ging khi ng sau khi sy Sy ụng khụ (-45 o C)/15h 96,5 a 25,4 - Ch phm sy xong vn gi nguyờn mu sc ca si nm mu trng. - Ch phm bụng xp, nhiu bo t. 40 o C/24h 83,9 b 19,9 - C cht cựng si nm b bin mu, khụng gi c mu sc ca si nm - Ch phm cú mu vng, v mu en ca bo t 45 o C/20h 65,9 c 13,6 - Ch phm cú mu vng sm sau khi sy 50 o C/17h 54,3 d 6,8 - Ch phm cú mu sm hn trc khi sy LSD 0,05 4,0 (Trong cựng mt ct, cỏc s cú ch cỏi ging nhau thỡ khụng khỏc nhau cú ý ngha mc ý ngha = 5%) Mặt khác trong quá trình đông khô một số lớn vi sinh vật bị chết, nhng tỷ lệ của vi sinh vật sống sót còn khoảng 5 30%, khi cho nớc vô phẩm vo vật phẩm đông khô thì phục hồi đợc môi trờng chứa vi sinh vật, giữ nguyên vẹn ton bộ khả năng sinh phát triển v những đặc tính trao đổi chất của vi sinh vật. Còn khi sấy bằng tủ sấy thờng, do sấy ở nhiệt độ cao, thời gian sấy kéo di, sự phá huỷ của hệ thống enzyme cao, khả năng chịu nhiệt của bo tử cũng chỉ ở giới hạn nhất định, nếu vợt quá ngỡng giới hạn thì bo tử sẽ mất khả năng sống. Kết quả ở bảng 7 cho thấy rằng khi giống khởi động đợc sấy ở chế độ sấy đông khô thì hoạt lực enzym đợc bảo tồn lớn nhất v khả năng sống của bo tử l cao nhất. Đối với tủ sấy bình thờng, hoạt lực enzym v khả năng sống của bo tử đạt giá trị cao nhất khi chế phẩm đợc sấy ở nhiệt độ 40 o C. Nếu không có thiết bị sấy đông khô, có thể chọn nhiệt độ sấy l 40 o C khi sấy giống khởi động bằng tủ sấy thờng. 4. KếT LUậN Trên cơ sở những kết quả thu đợc, nghiên cứu đã đa ra các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình sản xuất giống khởi động từ nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings nh sau: nguồn cơ chất thích hợp cho sản xuất giống khởi động từ nấm mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings có thể l bột ngô, bột đậu tơng, tốt nhất l bột ngô; tỷ lệ phối trộn với bột gạo l 60/40. Nguyên liệu đợc hấp khử trùng, lm nguội, trải thnh lớp mỏng 2 cm, tiếp giống bằng hỗn dịch bo tử có mật độ 2.10 7 bt/ml với tỷ lệ l 2 ml dịch giống/ 100 g môi trờng nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy l 54h có đảo trộn 1 lần sau 24h. Sau khi nuôi cấy thu đợc chế phẩm thô, nhằm bảo ton hoạt lực enzym v bo tử sống của giống khởi động nên sấy đông khô (-45 0 C) hoặc ở 40 0 C bằng tủ sấy thờng đến khi đạt độ ẩm l 10%. TI LIệU THAM KHảO Nguyễn Trọng Cần, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998). Công nghệ enzym. NXB. Nông nghiệp, H Nội. Nguyễn Thnh Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vơng Trọng Hảo (1990). Thực hnh vi sinh học. NXB. Giáo dục, H Nội. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2005). Các phơng pháp phân tích 475 Lờ Minh Nguyt, Nguyn Trng Thnh, Nguyn Th Thanh Loan ngnh công nghệ lên men. NXB. Khoa học v Kỹ thuật, H Nội. Lơng Đức Phẩm (2000). Vi sinh vật học v vệ sinh an ton thực phẩm. NXB. Nông nghiệp, H Nội. Nguyễn Hữu Phúc (1998). Các phơng pháp lên men thực phẩm truyền thống ở Việt Nam v các nớc trong vùng. NXB. Nông nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh. 476 . gian nuôi cấy nhất định Thí nghiệm ny đợc ti n hnh nhằm xác định các điều ki n nuôi cấy thích hợp để s n xuất ra giống khởi động tốt từ n m mốc Rhizopus. nghi n cứu đã đa ra các điều ki n nuôi cấy thích hợp cho quá trình s n xuất giống khởi động từ n m mốc Rhizopus oryzae Went & Prinsen Geerlings