ứng dụng kỹ thuật PCR tìm gen DYZ1 để xác định NST Y cho các bệnh nhân cha rõ giới tính Nguyễn Thanh Thuý 1 , Vũ Triệu An 1 , Văn Đình Hoa 1 Nguyễn Thị Phợng 2 , Vũ Chí Dũng 2 1 Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, trờng Đại học Y Hà Nội 2 Khoa Nội tiết - Chuyển hoá - Di truyền, Viện Bảo vệ sức khoẻ trẻ em Sau khi tiến hành PCR tìm gen TDF để chẩn đoán giới tính và đối chiếu với kết quả nuôi cấy NST cho 40 bệnh nhân thì thấy 95% phù hợp tức là có mặt song hành TDF và NST Y và ngợc lại, còn lại 5 % (2 bệnh nhân) không phù hợp: 46XX nhng TDF (+) và 46XY/46Xr (X) nhng TDF (-). Để khẳng định cho hai trờng hợp này chúng tôi tiến hành PCR tìm gen DYZ là gen trên nhánh dài để phát hiện NST Y kết quả cho thấy không tìm thấy gen DYZ trên cả hai bệnh nhân này, do đó kết luận là không có mặt NST Y. I. Đặt vấn đề ở ngời và động vật có vú thì nhiễm sắc thể Y là một trong những nhiễm sắc thể ngắn nhất. Ngời ta đã tiến hành nghiên cứu trên một số cá thể có bộ nhiễm sắc thể: 46,XY; 47,XXY và 47,XYY đều có tinh hoàn và là nam. Trong khi đó 46,XX, 47,XXX và 45,XO có kiểu hình là nữ. Do đó, có thể kết luận là kiểu hình nam phụ thuộc vào nhiễm sắc thể Y. Ngày nay ngòi ta đi sâu hơn và đã tìm ra ở nhánh ngắn của NST Y thì có gen mã cho yếu tố TDF (Testis Determining Factor = Yếu tố quyết định tinh hoàn), còn nhánh dài thì có gen mã cho sự sinh tinh trùng AZF (Azoospermie factor) các gen này chiếm khoảng 2 - 3% NST Y. Còn lại là các trình tự lặp đi lặp lại một cách đặc hiệu và chỉ có ở NST Y. Ngời ta gọi đó là vùng Heterochromatin, gen DYZ nằm ở vùng này (D = DNA; Y = NST Y; Z = Repetive copy DNA - Đoạn lặp lại trên NST Y). Do NST Y có chức năng và cấu trúc đặc biệt nh vậy, nên việc xác định NST Y có vai trò quan trọng, quyết định trong việc chẩn đoán giới tính. Năm 1972, Pearson và cs [ 4 ] bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang các tế bào niêm mạc miệng, tế bào lympho ở metaphase đã thấy các tế bào lấy từ đối tợng là nam giới có bắt màu huỳnh quang ở nhánh dài NST Y ngời ta gọi đó là vật thể Y. Số lợng vật thể Y chính bằng số NST Y có trong tế bào, nhng chỉ có khoảng 15% các tế bào 47,XYY và 48,XXYY có hai vật thể Y và 0,05% nam 46,XY bình thờng về giới không có vật thể Y. Do vậy kỹ thuật này có độ nhạy kém. Kỹ thuật nuôi cấy xếp bộ NST là một trong kỹ thuật khá chính xác do Tjio và Levan tìm ra năm 1956 [7] và sau đó năm 1972 đợc hội nghị ở Pari thống nhất gọi tên các loại băng, từ đó đến nay nó là kỹ thuật chính để xác định NST Y [5] trong mọi trờng hợp. Phơng pháp này nhiều khi phải làm đi làm lại nhiều lần do kết quả nghi ngờ trong các trờng hợp khó: bệnh nhân kiểu hình là nam, có bất thờng bộ phận sinh dục, 46,XX TDF (+) do TDF nằm trên NST X, hay có một mẩu NST X hoặc NST mất đoạn thì dễ nhầm với NST Y. Vì vậy năm 1992 Kaoru Suzumori và cs đã ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử tìm gen DYZ trong máu mẹ để chẩn đoán giới tính cho thai nhi. [3]. Đây là gen đợc tạo nên bản sao 5 nucleotide (TTCCA) lặp lại 3000 lần trên Y, nếu có mặt thì chắc chắn đó là NST Y. ở nớc ta cha một nghiên cứu nào đề cập đến việc xác định NST Y qua gen này. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài này với các mục tiêu sau: 41 1. Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi SY 160 tìm gen DYZ để xác định NST Y cho các bệnh nhân cha rõ giới tính. 2. Tiến hành kỹ thuật PCR tìm DYZ để khẳng định sự có mặt hay không có mặt của NST Y trong trờng hợp không có sự phù hợp giữa PCR tìm TDF và caryotype. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu: 1. Đối tợng: 40 bệnh nhân có chẩn đoán là mập mờ giới tính đợc vào khoa Nội tiết chuyển hoá di truyền viện Bảo vệ sức khoẻ trẻ em. 2. Phơng pháp nghiên cứu: Chúng tôi tiến hành chiết tách ADN từ bạch cầu lympho máu ngoại vi của 40 bệnh nhân, sau đó tiến hành xác định giới tính cho bệnh nhân này bằng kỹ thuật PCR xác định gen TDF, kỹ thuật này đã đợc chuẩn cho phản ứng chính xác 100% các trờng hợp [8]. Khi có kết quả TDF thì chúng tôi đối chiếu với caryotype của bệnh nhân sẽ xảy ra hai trờng hợp sau: - Nếu kết quả TDF phù hợp với caryotype (TDF luôn có mặt cùng NST Y và ngợc lại) thì chúng tôi lấy làm nhóm chứng để chuẩn kỹ thuật PCR tìm gen DYZ để xem độ chính xác của kỹ thuật. - Nếu kết quả TDF không phù hợp với caryotype của bệnh nhân thì dựa trên kết quả PCR tìm DYZ, là kỹ thuật đã đợc chuẩn ở trên để kiểm tra lại và kết luận xem thật sự có hay không có mặt NST Y. 3. Kỹ thuật: * Kỹ thuật PCR: tiến hành tại bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh. Trờng Đại học Y Hà Nội. - Chiết tách ADN từ bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phơng pháp chelex. - Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen TDF để xác định giới và PCR với cặp mồi của gen DYZ để xác định NST Y. - Sau đó kiểm tra kết quả bằng điện di trên gen thạch agarose 2%. - Đọc kết quả bằng đèn tử ngoại =310nm nh sau: TDF (+) cho sản phẩm là 425bp.DYZ (+) cho sản phẩm là 236pb. Phân tích kết quả: TDF (+) nam; TDF (-) nữ. Nếu DYZ (+): có mặt NST Y. DYZ (-): không có NST Y. TDF (+), DYZ (-): TDF nằm trên NST X. TDF (-), DYZ (+): TDF bị mất đoạn trên Y. Chứng nam: TDF (+); DYZ (+); NST 46,XY. Chứng nữ: TDF (-); DYZ(-); NST 46,XX. * Kỹ thuật nuôi cấy tế bào định caryotype: đợc tiến hành tại bộ môn Y sinh học - Di truyền, trờng Đại học Y Hà Nội. III. Kết quả Bảng 1: PCR tìm gen TDF để xác định giớí cho 40 bệnh nhân cha rõ giới. TDF n % Dơng tính 24 60% Âm tính 16 40% 40 100% Các bệnh nhân cha rõ giới tính đợc nghiên cứu thì 40 % là nữ bị nam hoá, còn 60% là nam bị nữ hoá. Bảng 2: Đối chiếu giữa kết quả PCR và caryotype của 40 bệnh nhân PCR Caryotype n % 46, XX 15 37,5 TDF (-) n = 16 46, XY/ 46, X(r)X 1 2,5 46, XY 46, XX/ 46, XY 45, XO/ 46, XY 47, XXY 19 1 2 1 57,5 TDF (+) n = 24 46, XX 1 2,5 40 100 Nhận xét: - 15/40 số trờng hợp chiếm 37,5 % gen TDF (-) có kết quả phù hợp với kết quả NST là 46,XX. Đợc sử dụng làm nhóm chứng cho PCR tìm DYZ. - 23/40 số trờng hợp chiếm 57,5 % gen TDF (+) phù hợp với kết quả NST là 46,XY. 42 Đợc sử dụng làm nhóm chứng cho PCR tìm DYZ. - 1/40 số trờng hợp chiếm 2,5 % gen TDF (-) nhng kết quả nuôi cấy NST là 46, XY /46, Xr(X). - 1 /40 số trờng hợp chiếm 2,5% gen TDF (+) nhng kết quả nuôi cấy NST là 46,XX. Bảng 3: Xác định NST Y bằng PCR tìm DYZ ở nhóm chứng. TDF(+), 46, XY TDF(-), 46, XX n % n % DYZ(-) 0 0 15 100 DYZ(+) 23 100 0 0 Nhận xét: với 38 trờng hợp có kết quả phù hợp giữa TDF và caryotype để làm chứng cho cho kỹ thuật PCR tìm DYZ để xác định NST Y cho kết quả chính xác 100%, không có trờng hợp nào dơng tính hay âm tính giả. Bảng 4: Kết quả PCR tìm DYZ ở nhóm bệnh nhân có kết quả không phù hợp giữa TDF và caryotype. Caryotype Kết quả DYZ TDF (+); 46,XX Âm tính TDF (-); 46,XY/46,Xr(X) Âm tính Nhận xét: cả hai trờng hợp đếu có DYZ âm tính, chứng tỏ không có mặt NST Y. IV. Bàn luận: Trong tổng số 40 bệnh nhân nghiên cứu sau khi đối chiếu giữa TDF và NST Y thì chúng tôi thấy có 95% phù hợp đã đợc bàn luận trong nghiên cứu trớc của chúng tôi [9] còn 5% không phù hợp đó là: trờng hợp thứ nhất có gen TDF nhng nuôi cấy NST là 46,XX và trờng hợp thứ hai là không có gen TDF nhng khi nuôi cấy NST là 46,XY/46, Xr(X) (nhiễm sắc thể X hình nhẫn do mất đoạn nhánh ngắn và nhánh dài). Khi tiến hành kiểm tra PCR với SY160 để tìm gen DYZ số bệnh nhân (38 bệnh nhân) có sự phù hợp TDF và nuôi cấy NST thì có kêt quả phù hợp với DYZ, nghĩa là, DYZ dơng tính thì caryotype có NST Y và DYZ âm tính thì caryotype không có Y. Hai trờng hợp còn lại thì đều có DYZ (-) chứng tỏ không có mặt NST Y. Các kết quả trên đợc lý luận nh sau: - Theo Cook và cs [2] 1976 đã thấy khoảng 50-70% vùng không bổ cứu trên NST Y bao gồm các đoạn ADN lặp đi lặp lại và chỉ xuất hiện trên NST Y, hoàn toàn đặc hiệu cho NST Y, nó kh trú trên nhánh dài NST Y ở vùng heterochromatin. Ngời ta gọi nó là gen DYZ1 và DYZ2. DYZ là chỉ sự nhắc lại trên NST Y, số 1 và 2 để chỉ trình tự phát hiện ra. DYZ 1 có kích thớc 3,4kb với 5 nucleotit đợc lặp lại TTCCA (khoảng 3000 bản lặp lại) còn DYZ 2 thì có 2000 bản lặp lại. Do vậy ngời ta lợi dụng tính chất này để xác định NST Y bằng kỹ thuật PCR khi khó xác định nó bằng phơng pháp nuôi cấy NST, hay khi gen TDF không nằm trên NST Y. Các tác giả nớc ngoài đã sử dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán giới nh Kaoru Suzumori và cộng sự 1992 [3] đã áp dụng trong việc chẩn đoán giới tính thai nhi từ máu mẹ, ngoài ra còn đợc Tanoue A. và cộng sự năm 1992 [6] áp dụng để nghiên cứu trên đối tợng 46,XX nam và 46,XX ái nam ái nữ thật (có mặt đồng thời cả tinh hoàn và buồng trứng) đã phát hiện ra TDF (+),và DYZ (-). - Từ bảng 4 cho thấy một bệnh nhân là 46,XX có gen TDF (+) chiếm 2,5% số trờng hợp. ở bệnh nhân này gen TDF nằm hoàn toàn trên NST X vì kết quả DYZ (-). Do đó phù hợp về lâm sàng bệnh nhân này có ngoại hình nam hoàn toàn, có tinh hoàn, nhng vào viện vì có tật lỗ đái thấp. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu của các tác giả khác trong y văn [6]. Bằng phơng pháp lai tại chỗ (FISH) Abbas N. et al 1993 [1] đã chứng minh nguyên nhân của các trờng hợp này là do trên nhánh ngắn NST X(Xp22) của bệnh nhân có mang gen TDF và vùng giả NST thờng (pseudo autosome region). NST X bệnh lý này là do cha truyền cho con, vì ngời ta đã tìm thấy ở cha bệnh nhân này có 2 gen TDF một trên NST Y và một gen trên NST X. [1] - Ngoài ra từ bảng 4 còn thấy 1 bệnh nhân khác chiếm 2,5% số trờng hợp không có sự phù hợp giữa kết quả PCR với nuôi 43 cấy NST: bộ NST đọc là 46,XY/46,Xr (X) có mặt NST Y nhng khi tiến hành PCR thì kết quả cho thấy TDF (-); DYZ (-) tức là hoàn toàn không có mặt NST Y và các gen trên nó. Trờng hợp này khi đối chiếu với lâm sàng của bệnh nhân thì phù hợp: bệnh nhân có ngoại hình nữ hoàn toàn, có tử cung và buồng trứng vào viện vì chiều cao chậm phát triển có ngoại hình gần giống hội chứng Turner. Do đó sơ bộ chúng tôi khẳng định rằng trong caryotype của bệnh nhân này không có NST Y. Nhận xét này của chúng tôi phù hợp hoàn toàn với y văn, vì nếu 46,XY/46,Xr(X) mà TDF (-) nghĩa là có sự đột biến 2 dòng tế bào trên cùng một hợp tử thì rất hiếm gặp. V. Kết luận 1. ở 38 bệnh nhân cha rõ giới (chiếm 95 % tổng số) có kết quả phù hợp giữa PCR tìm TDF và caryotype đã sử dụng làm nhóm chứng cho chuẩn kỹ thuật PCR tìm gen DYZ để xác định nhiễm sắc thể Y cho kết quả chính xác 100% không có trờng hợp nào âm tính hay dơng tính giả. 2. Còn 2 bệnh nhân (chiếm 5 %) có kết quả PCR tìm TDF và caryotype không phù hợp đều không tìm thấy gen DYZ, do đó khẳng định là không có mặt NST Y trong 2 trờng hợp này. 3. Phát hiện và khẳng định một trờng hợp TDF trên NST X đầu tiên ở Việt Nam. Tài liệu tham khảo 1. Abbas N.; McElreavey K.; Fellous M.; et al (1993). Familial case of 46,XX male and 46,XX true hermaphrodite associated with paternal -derived SRY -bearing X chromosome. C.R.Acad. Sci. III 1993; 316(4): 375-383. 2. Cooke HJ.(1976). Repeated sequence specific to human males. Nature 262:182- 186. 3. Kaoru Suzumori et al (1992) Fetal cell in maternal circulation; detection of Y sequence by gene amplification. Obstet.gynecol. 1992;80:150-60 4. Pearson P. et al (1972). The use of new staining techniques for human chromosome identification. J.Med.Genet 9; 264 - 75. 5. Polani P.E. et al (1981). Abnormal sex development in man. The mecanisme of the sex differentiation in animals and man. (Austin C.R. et Edwards R.G.; eds); 465 - 547. Academic Press London. 6. Tanoue A., Nakamura T., Endo F. et al (1992). Sex determining region Y (SRY) in a patient with 46 XX true hermaphroditism. Jpn. J. Hum. Genet. DEC; 37 (4); 311 - 20. 7. Tjio J.H. et Levan A. (1956). The chromosome number of man. Hereditas; 42: 1 - 6. 8. Nguyễn Thanh Thuý, Vũ Triệu An, Trần Thị Chính và cs (1997). Bớc đầu hoàn chỉnh kỹ thuật PCR và áp dụng trong việc xác định giới tính. Tạp chí nghiên cứu Y học. Đại học Y Hà Nội. Tập 4. Số 4: 33-35. 9. Nguyễn Thanh Thuý, Vũ Triệu An,Văn Đình Hoa, Nguyễn Thị Phợng, Vũ Chí Dũng. (2002). áp dụng kỹ thuật PCR tìm gen TDF và gen Amelogenin để xác định giới tính cho bệnh nhân cha rõ giới tính và đối chiếu với kết quả nuôi cấy NST. Tạp chí Nghiên cứu y học. Đại học Y Hà Nội 18.số 2. 6/2002. tr 3- 6. 44 Summary The application of the PCR technique to find the DYZ gene for the Y chromosome determination (We would like to thank Dr.McElreavey Ken for your help) The authors studied DNA samples with were extracted from the peripheral blood by the PCR technique with the primers TDF (to amplify the TDF gene on the short arm of the Y chromosome) and compared this PCR result with their karyotype: 95% accord with karyotype and except 5%: 46XX, TDF(+) and 46XY/Xr(X) TDF(-). The authors amplified the DYZ gene with primers SY160 to determine the Y chromosome in this 5% and the results showed that: - DYZ(-) in both 2 cases. - TDF (+) on the X chromosome. 45 . tìm gen DYZ để xác định NST Y cho các bệnh nhân cha rõ giới tính. 2. Tiến hành kỹ thuật PCR tìm DYZ để khẳng định sự có mặt hay không có mặt của NST Y. ứng dụng kỹ thuật PCR tìm gen DYZ1 để xác định NST Y cho các bệnh nhân cha rõ giới tính Nguyễn Thanh Thuý 1 , Vũ Triệu An 1 , Văn Đình Hoa 1 Nguyễn