iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ NGỌC THƠ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iv BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN VÕ NGỌC THƠ BSTY. HOÀNG THANH HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Các Thầy Cô và anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Hải, Cô Hà và các Thầy Cô Bộ Môn Vi Sinh-Truyền Nhiễm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Anh Lê Hồng Phong ở Cục Thú Y vùng 6 đã rất tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Anh Uyên đã động viên và chia sẻ vấn đề của tôi. Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 (nhất là các bạn trong phòng 14A, cƣ xá B) đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.  Đặc biệt tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cô Trần Thị Bích Liên và Anh Hoàng Thanh Hải đã rất tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.  Con xin gởi lòng mang ơn đặc biệt nhất đến với cha mẹ, những ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ và luôn cho con một tinh thần thoải mái để luôn chú tâm vào chuyện học.  Và lời cám ơn đặc biệt nhất tôi xin gởi đến ngƣời bạn thân thiết nhất, Nguyễn Minh Khôi, đã luôn luôn bên tôi, an ủi và động viên để tôi làm tốt nhất. Xin cám ơn, cám ơn từ tận đáy lòng tôi. Thủ Đức, tháng 8 năm 2007 iv Võ Ngọc Thơ TÓM TẮT Đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng Vi Sinh Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi Thú Y và tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài là phân lập virus từ các loại mẫu khác nhau và xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Nội dung nghiên cứu gồm:  Hồi phục tế bào và xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên bình nuôi cấy 25cm 2 với những lƣợng tế bào là 7.10 5 và 10 6 .  Khảo sát bệnh tích tế bào MARC-145 sau khi nuôi cấy phân lập từ các loại mẫu khác nhau: huyết thanh, hạch amiđan, phổi, hạch phổi.  Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ bệnh tích tế bào MARC-145 sau gây nhiễm bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Sau thời gian thực hiện, chúng tôi có các kết quả sau: o Thời gian một lần cấy chuyển ở lọ 25cm 2 với những lƣợng tế bào: 7.10 5 , 10 6 lần lƣợt là 72,56 giờ và 46 giờ. o Tế bào MARC-145 sau khi đƣợc hồi phục từ nitơ lỏng vẫn phát triển bình thƣờng. o Phân lập virus PRRS từ hạch phổi, phổi, huyết thanh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Ghi nhận đƣợc 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11). o Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả dƣơng tính chiếm tỷ lệ 33,33% trên mẫu xét nghiệm. v SUMMARY Graduating thesis: " Isolating PRRS virus by MARC-145 cell and confirming the virus by RT-PCR technology". The thesis have been done from March to August, 2007 at Microbiology And Infectious Diseases Dept. of Faculty Of Animal Science Veterinary and Center For Chemical And Biological Analysis And Experiment of Nong Lam university Hồ Chí Minh city. Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and determine its appearance by RT-PCR technology. The contain is concerned about:  Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.10 5 and 10 6 .  Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with different specimens such as: serum, lung, lympho nodes.  Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Finally, we have results: o The average period of one transfer with the amount of 7.10 5 cells is 72,565 hours, 10 6 cells is 46 hours. o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally. o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell invironment. 3 specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: 2 lymphonotes, 1 lung (3/11 specimens). o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích - Yêu cầu 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào 3 2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật 3 2.1.2. Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy 4 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 6 2.1.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế 6 2.2. Phƣơng pháp PCR 6 2.2.1. Nguyên tắc 7 2.2.2. Thực nghiệm 7 2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 8 2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR 9 2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus 10 2.3.1. Lịch sử bệnh 10 2.3.2. Căn bệnh học 11 2.3.2.1. Phân loại 11 2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc 12 vii 2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy 14 2.3.2.4. Sức đề kháng 16 2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS 16 2.3.3.1. Loài mắc bệnh 16 2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan 16 2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập 17 2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh 17 2.3.4. Triệu chứng lâm sàng 20 2.3.5. Chẩn đoán 20 2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng 20 2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng 21 2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 21 2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên 22 2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS 23 2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào 23 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 25 3.1. Thời gian và địa điểm 25 3.2. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu 25 3.3. Nội dung nghiên cứu 25 3.4. Vật liệu và dụng cụ 26 3.4.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus 26 3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 26 3.4.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR 27 3.4.4. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA 27 3.4.5. Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR 27 3.4.6. vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR 28 3.5. Phƣơng pháp tiến hành 28 3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 28 3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 28 viii 3.5.2.1. Hồi phục tế bào 28 3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào 29 3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 34 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 35 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 37 4.4. Kết quả RT-PCR 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1. Kết luận 44 5.2. Tồn tại 44 5.3. Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS 19 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS 31 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR 33 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Virus PRRS 12 Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng 15 Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS 15 Hình 2.4. Triệu chứng bệnh tai xanh 20 Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS 20 Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer 30 Hình 4.1. Đối chứng âm 40 Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào 40 Hình 4.3. Đối chứng dƣơng 40 Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP 41 Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2 41 Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào 42 [...]... của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 bằng kỹ thuật RT- PCR góp phần hoàn thiện dần quá trình chẩn đoán bệnh PRRS trên heo và lấy đó làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này 1.2.2 Yêu cầu Khảo sát đặc tính của tế bào MARC-145 bằng cách hồi phục tế bào và xác định thời gian một lần cấy chuyển Phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch phổi của heo nghi ngờ bệnh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. .. của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MA104 (MARC-145) , hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48- 72 giờ nuôi cấy Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào nhƣng vẫn có một số chủng virus PRRS thì không (Christianson và Joo, 1994; Yoon và cs, 1992) Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và. .. bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy Dùng kỹ thuật RT- PCR (Reverse Trascriptase - Polymerase Chain Reaction) để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào nuôi cấy 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan về nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống nhƣng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dƣỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào Quá trình... bệnh và các nghiên cứu sau này 2 Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM, dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của ThS Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT- PCR” 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định sự... tễ-Cục Thú y) Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đƣờng nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor Ngƣời ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus( Delputte và cs, 2001; Nathalie và cs, 2003) và trên MARC-145 là vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Jeong-Ki Kim và cs, 2005)... nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào nhƣ khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào Tăng trƣởng và phân chia chậm: thời gian tăng trƣởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia Thông thƣờng, tế bào phát triển... bào Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò nhƣ những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt dinh dƣỡng Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Harrison Ngày nay kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y học để nghiên... cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt là sản xuất vaccine Quá trình nuôi cấy thƣờng gồm những tế bào thuộc cùng một loại 2.1.1 Một số đặc điểm của tế bào động vật Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thƣớc tế bào khá lớn (khoảng 10 µm) nên... khi gắn vào bề mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi Tuy vậy một số tế bào nhƣ tế bào ung thƣ có thể sinh trƣởng và phân chia ở trạng thái lơ lửng không cần giá đỡ 4 Tế bào động vật có thể đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -1960C, ở nhiệt độ này tế bào có thể giữ đƣợc khả năng sống không hạn định và sẽ phát triển trở lại trên môi trƣờng... 2001) Benfield và cs (1992) cũng mô tả bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra nhƣ: các tế bào co tròn, trở nên thoái hoá (nhân kết đặc lại) và tách khỏi tế bào một lớp sau 2- 4 ngày nuôi cấy Toàn bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày Kết quả cũng tƣơng tự trên dòng tế bào PAM khi gây nhiễm virus PRRS (Pol và 16 Wagenaar, 1992; Wensvoort, 1992; Pol, 1997) (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006) Các dòng PRRSV của Bắc . Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định virus bằng kỹ thuật. Ngọc Thơ TÓM TẮT Đề tài: Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR . Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng