CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 1 Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ môn Công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận: KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trịnh Xuân Thảo MSSV: 06126142 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 2 MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU: 1. Giới thiệu về salmonella và phương pháp chuẩn doán: a.Đặc diểm hình thái của salmonella: b. Phân loại salmonella c. Các phương pháp chuẩn đoán salmonella 2. Mục tiêu nghiên cứu : 1. Xác định độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. 2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. Ưu điểm của PCR đa mồi: III. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu 2. Vật liệu 2.1. Vật liệu dùng cho nuôi cấy và xác định vi khuẩn 2.2. Sinh phẩm, hoá chất, dụng cụ và máy móc dùng trong PCR 3. Phương pháp nghiên cứu 3.1. Độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. a.Qui trình tách chiết ADN trực tiếp từ phân b. Xác định độ nhạy của hệ thống PCR đa mồi 3.2. Độ đặc hiệ u của PCR đa mồi 3.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm PCR 4. Xử lý số liệu IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Xác định độ nhạy của PCR đa mồi CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 3 2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi V. BÀN LUẬN 1. Độ nhạy của PCR đa mồi 2. Xác định độ đặc hiệu của hệ thống PCR đa mồi VI. KẾT LUẬN - Độ nhạy - Độ đặc hiệu VII. Tài liệu tham khảo CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 4 KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY I. ĐẶT VẤN ĐỀ - Tiêu chảy là một trong những vấn đề quan trọng về sức khỏe toàn cầu, đặc biệt đối với trẻ em trên toàn thế giới. Tiêu chảy chiếm vị trí thứ hai về tỷ lệ tử vong ở trẻ em dưới 5 tuổi do mắc các bệnh nhiễm khuẩn (chỉ sau nhiễm khuẩn đường hô hấp), ở các nước đang phát triển, có ít nhất 1 tỷ tr ường hợp tiêu chảy hàng năm và số tử vong là 5 đến 7 triệu. Trung bình một năm một trẻ mắc 3,3 lần tiêu chảy. Tại Việt nam, một số nghiên cứu cho biết, số lần bị tiêu chảy trong một năm đối với một trẻ từ 2,2 - 6 lần. Tại các nước công nghiệp phát triển, tiêu chảy vẫn còn phổ biến ở trẻ em và người già. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy, trong đó vi khuẩn đóng vai trò quan trọng.Tiêu chảy còn là nguyên nhân quan trọng gây suy dinh dưỡng, ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của trẻ. Salmonella là một vi khuẩn có phạm vi lây lan rộng, sống trong ruột của chim, loài bò sát và động vật có vú. Nó có thể lây sang người qua nhiều loại thức ăn từ động vật. Những bệnh do chúng gây ra (salmonellosis) tiêu biểu gồm sốt, tiêu chảy và đau bụng. Ở những người có sức khỏe kém hay hệ miễn dịch suy yếu, nó có thể xâm nhập vào máu và gây ra những bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm. Salmonella là một căn nguyên gây tiêu chảy đã được đề cập trong nhiều nghiên cứu. Salmonella có thể gây bệnh cho người, động vật hoặc cả cho người và động vật. Một số loài Salmonella CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 5 hay gây bệnh thường gặp là S. typhi, chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn quan trọng nhất. S. paratyphi A, chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn, tỷ lệ ở nước ta đứng sau S. typhi. S. paratyphi B, chủ yếu gây bệnh ở người. Tại các nước châu Âu, tỷ lệ vi khuẩn này cao hơn ở Việt Nam. S. paratyphi C, vừa có khả năng gây bệnh thương hàn vừa có khả nă ng gây viêm dạ dày-ruột và nhiễm khuẩn huyết. Thường gặp ở các nước Đông Nam Châu Á. S. typhimurium và S.enteritidis vừa có khả năng gây bệnh cho người vừa có khả năng gây bệnh cho động vật. Chúng là nguyên nhân chủ yếu của bệnh nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn do Salmonella. S. choleraesuis là căn nguyên thường gặp trong nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta. II. Tổng quan tài liệu: 2. Giới thi ệu về salmonella và phương pháp chuẩn đoán: a.Đặc diểm hình thái của salmonella: Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 µm, có nhiều lông ở xung quanh thân, trừ S.gallinarum và S.pullorum (gây bệnh ở gà vịt). Salmonella được phân lập từ các đại thực bào nhiễm độc CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 6 Salmonella là vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc được dùng trong phân lập vi khuẩn này từ phân. - Trên môi trường lỏng: sau 5-6h nuôi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18h môi trường đục đều. - Trên môi trường thạch thường: khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, không màu hoặc màu trắng xám. - Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạ c có màu hồng. Salmonella không lên men lactose, lên men đường Glucose thường sinh hơi. Sử dụng được citrat ở môi trường Simomons. Catalase (+), oxidase (-). Lysindecarboxylase (+), onPG (-), urease (-), RM (+), VP (-), H 2 S (-), indol (- ). Tuy nhiên không phải bất kỳ loài nào cũng có đầy đủ các tính chất trên. Những ngoại lệ đã được xác định cần phải biết là: S.typhi lên men đường glucose không sinh hơi và citrat Simmon (-). Trong loài S.paratyphi A chỉ có Salmonella phát triển trên thạch máu Salmonella quan sát dưới kính hiển vi CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 7 một số chủng sinh H 2 S và ở loài này kết quả thử citrat Simmon (-), lysindecarboxylase (-). S.arizona lên men lactose (tuy có chậm) và onPG (-). Salmonella trên thạch McConkey Salmonella sp. sau 24h trên thạch XLD B. Phân loại: salmonella được phân loại theo 2 cách chính như sau: • Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào: - Giới : Bacteria - Ngành: Proteobacteria - Lớp: Gramma Proteobacteria - Bộ: Enterobacteriales - Họ: Enterobacteriaceae - Giống: Salmonella lignieres 1900 - Loài: S. bongori & S. enterica • Về phân loại theo cấu trúc kháng nguyên: Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, Salmonella được chia thành các nhóm, các loài và các typ huyết thanh. Lúc đầu, các Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. typhi và các S. paratyphi A, B, C (typhoid = bệ nh thương hàn), hoặc theo vật chủ như S. typhimurium gây bệnh ở chuột (murine =chuột). Về sau, người ta thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài động vật CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 8 khác nhau. Vì những lý do đó, cuối cùng người ta gọi các loài mới phát hiện được theo tên địa phương ở đó nó được phân lập như S. teheran, S. congo, S.london. Đến nay, người ta đã phát hiện được trên 1500 typ huyết thanh Salmonella. Bảng: kiểu kháng nguyên của một số vi khuẩn salmonella. Kháng nguyên H Vi khuẩn Nhóm kháng nguyên Kháng nguyên O Phase 1 Phase 2 S.paratyphy A 1, 2, 12 a (1, 5) S. typhimurium B 1, 4, 12 I 1, 2 S. typhi D 9, 12, (Vi) c 1, 2 S.enteriditis D 1, 9, 12 g, m (1, 7) S. gallinarum D 1, 9, 12 - - c. Các phương pháp chuẩn đóan salmonella: Salmonella có thể được chuẩn đoán theo các phương pháp sau: • Phương pháp phân lập • Phương pháp miễn dịch • Huyết thanh học • ELISA • Miễn dịch huỳnh quang CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 9 • Phương pháp phân tử • PCR • Realtime PCR • Multiplex PCR Phương pháp kinh điển xác định các Salmonella trong các trường hợp chúng gây bệnh tiêu chảy (đặc biệt trong thương hàn) là cấy máu và/hoặc cấy phân. Phương pháp định danh kinh điển sử dụng các tính chất sinh vật hóa học và ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu. Đã có một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuậ t sinh học phân tử như lai DNA, phản ứng khuyếch đại gen - Polymerase Chain Reaction (PCR). - PCR là kỹ thuật tổng hợp acid nucleic trong ống nghiệm. Trong đó, một đoạn ADN được nhân lên đặc hiệu. Trong kỹ thuật này, hai đoạn oligonucleotid gắn đặc hiệu vào đoạn ADN đích và được khuếch đại theo một số chu kỳ được lặp đi lặp lại. Chu kỳ này gồm việc làm tách hai sợi của đ oạn ADN, gắn hai oligonucleotid vào hai sợi này theo nguyên tắc bổ sung và kéo dài đoạn oligonucleotid dưới tác động của enzym ADN polymerase. Các oligonucleotid được gọi là "mồi" (primer) này gắn vào hai sợi của đoạn ADN và được định hướng. Do vậy, đoạn ADN mới sẽ được tổng hợp giữa hai mồi này. Trong PCR, ADN đích được tăng lên theo hàm số mũ sau mỗi chu kỳ. Sản phẩm của PCR được phát hiện sau khi điện di trên agarose, nhuộm bằng ethidium bromide và đọ c dưới ánh sáng đèn cực tím. CHUẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 10 - Tuy nhiên cho tới nay, việc xác định trực tiếp Salmonella từ phân bằng PCR vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. - Trên lâm sàng, việc xác định nhanh các Salmonella bằng một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán và lựa chọn chế độ điều trị thích hợp cho bệnh nhân. 2. Mục tiêu nghiên cứu : 1. Xác đị nh độ nhạy của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. 2. Xác định độ đặc hiệu của PCR đa mồi xác định Salmonella trực tiếp từ phân. [...]... phỏt hin salmonella spp trong thc phm bng phng phỏp PCR _ Phm Minh Thu, Phan Thu Dũng, Trng Xuõn Liờn.Vin Pasteur Tp H Chi Minh - Nguyn Tin Dng, Phỏt hin phõn bit Salmonella spp v S.enterica I bng PCR v kho sỏt tn s xut hin tng i ca S.enterica I trong thy sn, nc t nhin Lun vn thc s khoa hc-Trng HKHTN TP.H Chớ Minh 2002 - Nguyn Vn Hũa Nghiờn cu ng dng phng phỏp PCR phỏt hin Salmonella spp trong thy... n gin, khụng cn cỏc mỏy múc v trang thit b t tin, d thc hin, kinh t hn, mt ớt thi gian hn h thng PCR a mi xỏc nh Salmonella s dng ADN tỏch trc tip t phõn bng qui trỡnh ca chỳng tụi, cú nhy cao hn so vi PCR a mi s dng ADN tỏch trc tip t phõn bng b kớt QIAamp Mc dự cú mt s nghiờn cu s dng k thut PCR phỏt hin trc tip Salmonella t phõn Trong nghiờn cu ca Pathmanathan s dng PCR vi cp mi c hiu cho gen hilA... tớnh vi PCR a mi trờn tng s cỏc chng c th Bng 3 c hiu ca PCR a mi Nhn xột Kt qu bng 3 cho thy, PCR a mi vi cỏc vi khun ng rut khỏc u õm tớnh iu ú chng t c hiu ca h thng PCR a mi bng 100% V BN LUN 1 nhy ca PCR a mi - Hin nay, PCR c ỏnh giỏ l mt k thut cú nhy v c hiu rt cao, gn 100% K thut cú c nhy v c hiu cao l do PCR s dng cp mi gn c hiu vo on ADN ớch - Tuy nhiờn, khi thc hin k thut PCR, ngi... 106 CFU/ml, lp li ca th nghim l 100% - c hiu ca h thng PCR a mi xỏc nh Salmonella trc tip t phõn l 100% VII Ti liu tham kho - Wikipedia ting Vit - Cụng ngh sinh hc trong thỳ y _ Nguyn Ngc Hi _ Nh xut bn Nụng Nghip - Lm th no Vi khun Salmonella gõy Tiờu chy Trong Mỏy ch ca h ScienceDaily (Ngy 17 Thỏng 10 2009) - Phỏt trin v ng dng k thut PCR a mi trong chn oỏn E coli gõy tiờu chy t phõn Nguyn V Trung,... xỏc nh vi khun - Mụi trng dựng trong nuụi cy v phõn lp vi khun: Sorbitol Mac Conkey (SMAC), Deoxycholate Citrat Agar (DCA), cỏc loi tube, a petri, khỏng huyt thanh ca mt s vi khun ng rut, b húa cht xỏc nh vi khun API 20E ca Biomerieux (Phỏp) 2.2 Sinh phm, hoỏ cht, dng c v mỏy múc dựng trong PCR Trong nghiờn cu ny, chỳng tụi s dng k thut PCR a mi vi cỏc cp mi c hiu cho Salmonella v V cholerae vi mc ớch... Tuy nhiờn, trong nghiờn cu ny, tỏc gi khụng cp n lp li ca thc nghim Trong nghiờn cu ca chỳng tụi, lp li ca thc nghim l 100% (10/10) ln u cú kt qu nhy l 106 CFU/ml v 50% (5/5) ln cho nhy l 105 CFU/ml Ngoi ra, qui trỡnh ca chỳng tụi ch mt khong 6 h k c thi gian chy PCR, in di so vi 18h nh trong nghiờn cu ca Pathamanathan 2 Xỏc nh c hiu ca h thng PCR a mi - ỏnh giỏ c hiu ca h thng PCR a mi chỳng... EIEC, EPEC, v ETEC) Kt qu nghiờn cu cho thy, vi tt c cỏc chng vi khun c th nghim, PCR u cho kt 17 CHUN ON BNH GIA SC, GIA CM BNG SINH HC PHN T qu õm tớnh PCR a mi xỏc nh Salmonella trc tip t phõn, hon ton c hiu vi cỏc Salmonella Khụng cú hin tng õm tớnh gi vi cỏc vi khun khỏc trong ng tiờu húa - Thc cht, c hiu ca phn ng PCR chớnh l c hiu ca cỏc cp mi s dng Cp mi phi c la chn sao cho cú kh nng ghộp... khun khỏc cú mt trong mu phõn Do vy, khi thc hin xỏc nh c hiu ca PCR trờn dung dch sau tỏch chit ny, chỳng tụi cng ó tin hnh th nghim c hiu ca PCR vi tt c cỏc chng vi khun khỏc cú mt trong mu phõn Hay cú th núi th nghim ca 18 CHUN ON BNH GIA SC, GIA CM BNG SINH HC PHN T chỳng tụi ó rỳt ngn c rt nhiu thi gian v tit kim c nhiu vt liu v cụng sc VI KT LUN - nhy ca h thng PCR a mi xỏc nh Salmonella l 106... hin ca phn ng Gii hn ny chớnh l nng ca on ADN ớch trong hn hp phn ng Mt quỏ trỡnh tỏch chit ADN tt s cho mt dung dch ADN cú cht lng cao v nng phn ng PCR cho kt qu dng tớnh 16 CHUN ON BNH GIA SC, GIA CM BNG SINH HC PHN T - Theo kt qu ca Bng 2, gii hn phỏt hin ca PCR a mi xỏc nh Salmonella trc tip t phõn l 106 CFU/ml Trong khi ú, nhy ca phn ng PCR vi ADN tỏch chit trc tip t phõn bng b kit thng phm... 200 mg phõn ó c xỏc nh khụng cú Salmonella gõy tiờu chy bng nuụi cy phõn lp v PCR 13 CHUN ON BNH GIA SC, GIA CM BNG SINH HC PHN T - Tỏch chit ADN theo qui trỡnh trờn - Tin hnh k thut PCR a mi vi ADN thu c sau khi tỏch chit + Cỏc thnh phn tham gia phn ng PCR nh sau: Mi phn ng gm 25 àl cỏc thnh phn sau: 12,5 àl PCR master mix (Epicentre, Canada); 2,5 mM cp mi OMPCF-OMPCR v ctxB2-ctxB3 (Promega, M), . Bài tiểu luận: KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU CHẢY Giáo. BỆNH GIA SÚC, GIA CẦM BẰNG SINH HỌC PHÂN TỬ 4 KIỂM TRA ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƯƠNG PHÁP PCR ĐA MỒI TRONG PHÁT HIỆN SALMONELLA GÂY BỆNH TIÊU