BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH ĐẬU THỊ KIM DUNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sư Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN Luận văn kỹ sư Giáo viên hướng dẫn : Sinh viên thực hiện : TS. NGUYỄN NGỌC HẢI ĐẬU THỊ KIM DUNG PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG Khóa : 2002 - 2006 CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON SEMI SOLID MEDIUM Graduation thesis Major : Biotechnology Professors : Student : PhD. NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG Vice Professor-PhD. NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006 BA. ĐO THI TUYEN HCMC, 09/2006 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến : * Ban Giám hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. * Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. * Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn tất khóa luận này. * Anh Nguyễn Diên Sanh, anh Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ trợ cũng như cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài. * Các bạn lớp CNSH K28 đã động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng như chia xẻ những vui buồn trong suốt thời gian học tập. * Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. * Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bước vào đời. iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN”. Đề tài được thực hiện từ ngày 10/2/2006 đến ngày 1/6/2006 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM. Hội đồng hướng dẫn : PGS-TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TS. NGUYỄN NGOC HẢI CN. ĐỖ THỊ TUYẾN Chế phẩm enzyme thô dạng bột của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki được chiết bằng nước cất, thu được dịch chiết enzyme thô. Dịch chiết thô này được tủa với muối (NH 4 ) 2 SO 4 ở các nồng độ (% độ bão hòa) : 50, 55, 60, 65, 70, 75 và cồn 96 0 ở các tỷ lệ dịch chiết enzyme : cồn là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Cặn tủa thu được hòa vào dung dịch đệm và xác định hoạt tính protease nhằm tìm ra nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease. Từ đó khảo sát điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease từ dịch tủa enzyme thu được từ nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ưu. Cuối cùng, dịch tủa pha trong đệm được chạy qua sắc ký lọc gel và xác định trọng lượng phân tử protease bằng điện di. Kết quả thu được như sau :  Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ưu để tủa protease.  Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 47 0 C.  Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus kawasaki. v MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa i Trang tựa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt khóa luận iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các bảng ix Danh sách các hình và đồ thị xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích nghiên cứu 2 1.3 Yêu cầu 2 2.1 Khái quát chung về enzyme 3 2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3 2.1.2 Định nghĩa về enzyme 5 2.1.3 Phân loại enzyme 6 2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7 2.1.4.1 Hoạt tính enzyme 7 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7 2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống 9 2.1.5.1 Nguồn thu nhận 9 2.1.5.2 Vai trò 11 2.2 Khái quát chung về enzyme protease 11 2.2.1 Định nghĩa enzyme protease 11 2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease 12 2.2.2.1 Protease từ động vật 12 2.2.2.2 Protease từ thực vật 12 2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật 13 2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease 13 2.2.3.1 Từ động vật 13 2.2.3.2 Từ thực vật 13 2.2.3.3 Từ vi sinh vật 14 2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease 14 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15 2.3.1.1 Phân loại 15 2.3.1.2 Đặc điểm 15 2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt 16 2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease 18 2.5.1 Trích ly enzyme 19 2.5.2 Quá trình tủa 20 2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký 22 vi 2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS – PAGE 27 PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 3.1 Thời gian và địa điểm 29 3.2 Vật liệu 29 3.2.1 Chế phẩm enzyme thô 29 3.2.2 Hóa chất 29 3.2.3 Thiết bị 29 3.3 Phương pháp thí nghiệm 30 3.3.1 Bố trí thí nghiệm 30 3.3.1.1 Thí nghiệm 1 : Xác định hàm lượng và hoạt tính enzyme của dịch chiết enzyme thô 30 3.3.1.2 Thí nghiệm 2 : Xác định nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 và tỷ lệ cồn tối ưu để tủa enzyme protease 36 3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease 37 3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 37 3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện di SDS – PAGE 41 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 44 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 4.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô 45 4.2 Nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 tối ưu cho việc tủa protease 45 4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 46 4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 48 4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease 49 4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 49 4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 51 4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 96 0 và tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 53 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease 54 4.5.1 pH tối ưu 54 4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae 54 4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki 54 4.5.2 Nhiệt độ tối ưu 55 4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 55 4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 56 4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel 56 4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae 57 4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki 59 4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 62 4.7.1 Tủa protease bằng muối 62 4.7.2 Tủa protease bằng cồn 62 4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE 63 PHẦN 5 : KẾT LUẬNVÀ ĐỀ NGHỊ 67 5.1 Kết luận 67 5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 67 vii 5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki 67 5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 68 5.2 Đề nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 PHỤ LỤC 70 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ Asp.oryzae : Aspergillus oryzae Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp). CBB : Coomasie Brilliant Blue. ĐVHT : Đơn vị hoạt tính. HT : Hoạt tính HTR : Hoạt tính riêng. TCA : Trichloacetic acid A.U : Độ hấp thụ. mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lường độ dẫn điện). UI : Đơn vị hoạt tính enzyme. ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein 22 Bảng 3.1 Đường chuẩn Albumin 32 Bảng 3.2 Đường chuẩn Tyrosine 34 Bảng 3.3 Khối lượng (NH 4 ) 2 SO 4 tương ứng với mỗi nồng độ 36 Bảng 3.4 Thể tích cồn tương ứng với các tỷ lệ 36 Bảng 4.1 Hoạt tính enzyme protease và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp. kawasaki 45 Bảng 4.2 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46 Bảng 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 46 Bảng 4.4 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48 Bảng 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 48 Bảng 4.6 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50 Bảng 4.7 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 50 Bảng 4.8 Tổng hàm lượng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch pha tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 51 Bảng 4.9 Hàm lượng protein và hoạt tính protease có trong 1 g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52 x [...]... enzyme hoạt động là khác nhau Do đó, để sử dụng enzyme hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài : Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki trên môi trường. .. enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki  So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 1.3 Yêu cầu  Thu nhận enzyme , xác định nồng độ muối (NH 4)2SO4 bão hòa và tỷ lệ cồn tối ưu trong việc tủa enzyme - bước đầu trong quá trình tinh sạch enzyme  Xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme protease. .. pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp .oryzae 54 Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp .kawasaki 55 Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp .oryzae 55 Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp .kawasaki 56 xiii Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa... nhân cồn và muối ở hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 53 Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp .oryzae theo pH .54 Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp .kawasaki theo pH 55 Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp .oryzae theo nhiệt độ .55 Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp .kawasaki theo... tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel .59 Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel 61 Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối 62 Bảng 4.18 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng cồn 62 Bảng 4.19 Giá trị Rf và. .. sung vào thức ăn của lợn và gia cầm  Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen Protease phân giải và hòa tan lớp 16 nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý 2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae. .. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Biogel P100 khi tủa protease bằng cồn đối với Aspergillus kawasaki 60 ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lượng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp .oryzae và Asp .kawasaki 45 Đồ thị 4.2 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp .oryzae khi tủa protease bằng muối... Giống : Aspergillus Loài : Aspergillus oryzae 2.3.1.2 Đặc điểm  Hình thái Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 µm), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi 17 Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae. .. Đồ thị 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp .kawasaki khi tủa protease bằng muối 49 Đồ thị 4.4 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp .oryzae khi tủa protease bằng cồn 51 Đồ thị 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp .kawasaki khi tủa protease bằng cồn .52... 4.1 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus oryzae 58 Hình 4.2 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng cồn đối với nấm Aspergillus oryzae .58 xii Hình 4.3 Sắc ký đồ kết quả tinh sạch qua lọc gel Bio-gel P – 100 khi tủa protease bằng muối đối với nấm Aspergillus kawasaki 60 . 9/2006. “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS ORYZAE VÀ ASPERGILLUS KAWASAKI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN”. Đề tài được. trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài : Khảo sát hoạt tính và tinh sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus