TCNCYH 28 (2) - 2004 1 Mối liên quan giữa tính đa hình thái của FcR và bệnh lupus ban đỏ hệ thống Phạm Đăng Khoa, Vũ Triệu An Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trờng Đại học Y Hà Nội Tính đa hình thái của FcRIIA, FcRIIIA và FcRIIIB ở bệnh nhân lupus ban đỏ hệ thống (SLE: systemic lupus erythematosus) đợc khảo sát bằng phơng pháp PCR (polymerase chain reaction) với ADN và primer đặc hiệu alen. Trong tần xuất các genotype của FcRIIA, thể đồng hợp FcRIIA-H131 xuất hiện 10 (10,1%) trong số 99 bệnh nhân SLE và 32 (34,4%) trong số 93 ngời chứng (p<0,01). Tần xuất alen FcRIIA-H131 ở bệnh nhân cũng thấp hơn một cách có ý nghĩa so với chứng (p<0,01). Trong tần xuất các genotype của FcRIIIB, thể đồng hợp FcRIIIB-NA2/2 xuất hiện 18 (26,9%) trong số 67 bệnh nhân SLE và 7 (10,6%) trong số 66 ngời chứng (p<0,05). Tần xuất alen FcRIIIB- NA2 ở bệnh nhân cũng cao hơn một cách có ý nghĩa so với chứng (p<0,01). Không thấy mối liên quan giữa tần xuất các genotype của FcRIIIA và SLE. Sự phân bố bất thờng trong tính đa hình thái của FcRIIA và FcRIIIB gợi ý rằng FcRIIA và FcRIIIB, chứ không phải FcRIIIA, có thể liên quan tới sự xuất hiện SLE. i. Đặt vấn đề Sai sót trong việc thải loại phức hợp miễn dịch đợc xem là yếu tố quan trọng nhất trong cơ chế bệnh sinh của bệnh lupus ban đỏ hệ thống (SLE: systemic lupus erythematosus). FcR (receptor dành cho phần Fc của IgG) là công cụ để thải loại phức hợp miễn dịch bởi các tế bào làm nhiệm vụ thực bào [1]. Ba loại FcR chính đã đợc phát hiện ở ngời, đó là: FcRI (CD64), FcRII (CD32) và FcRIII (CD16). Chúng bao gồm các gien riêng biệt và chứa đựng các biến thể phân cắt khác nhau [2]. Cho tới nay, ngời ta đã xác định đợc 6 biến thể khác nhau của FcRII, chúng đợc mã hoá bởi 3 gien (FcRIIA, IIB và IIC) và 2 biến thể gần giống nhau của FcRIII (IIIA và IIIB) đợc mã hoá bởi 2 gien khác nhau. Tính đa hình thái về gien chỉ đợc thấy ở các gien mã hoá cho FcRIIA, FcRIIIA và FcRIIIB [3]. Trong bài báo này, chúng tôi khảo sát sự phân bố genotype của FcRIIA, FcRIIIA và FcRIIIB ở bệnh nhân SLE nhằm nghiên cứu mối liên quan giữa tính đa hình thái của FcR và bệnh lupus ban đỏ hệ thống. ii. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng Bệnh nhân SLE đợc chẩn đoán và điều trị tại Viện Da liễu. Tất cả bệnh nhân có ít nhất 4 tiêu chuẩn để xếp loại SLE theo American College of Rheumatology [4]. Số lợng bệnh nhân đợc khảo sát genotype của FcRIIA, FcRIIIA và FcRIIIB lần lợt là 99, 67 và 67. Nhóm chứng là những ngời cho máu tình nguyện. Số lợng ngời thờng đợc khảo sát genotype của FcRIIA, FcRIIIA và FcRIIIB lần lợt 93, 62 và 66. Chiết tách AND ADN đợc chiết tách từ bạch cầu máu ngoại vi theo phơng pháp salting out có cải tiến [5]. Khoảng 100 ng ADN đợc dùng cho mối phản ứng PCR, tổng thể tích phản ứng PCR là 15 àl. Xác định genotype Genotype của FcRIIA đợc xác định theo phơng pháp PCR-SSP (PCR-sequence specific primer), kỹ thuật theo Yap và CS [6]. Genotype của Fc RIIIA đợc xác định theo phơng pháp PCR-SSP, kỹ thuật theo Wu và CS [7]. TCNCYH 28 (2) - 2004 2 Genotype của FcRIIIB đợc xác định theo phơng pháp PCR-SSP, kỹ thuật theo Hessner và CS [8]. Xử lý số liệu. Tần xuất genotype và tần xuất alen của FcRIIA (R131 và H131), FcRIIIA (V158 và F158) và FcRIIIB (NA1 và NA2) đợc xác định ở nhóm bệnh và nhóm chứng. Sự phân bố các tần xuất này đợc so sánh ở 2 nhóm bằng thử nghiệm 2 để xác định mối liên quan. iii. Kết quả Xác định genotype của Fc RIIA Bốn phản ứng PCR đợc dùng để xác định genotype của FcRIIA, hai phản ứng xác định sự hiện diện của một alen. ở cá thể đồng hợp, sản phẩm khuếch đại đợc thấy ở 2 trong 4 phản ứng PCR. ở cá thể dị hợp, sản phẩm khuếch đại đợc thấy ở cả 4 phản ứng PCR. Tần xuất genotype và tần xuất alen của FcRIIA đợc trình bày trong bảng 1. Tần xuất của R/R131, R/H131 và H/H131 ở 99 bệnh nhân lần lợt là 15 (15,1%), 74 (74,1%) và 10 (10,1%) và ở 93 ngời chứng lần lợt là 11 (11,8%), 50 (53,8%) và 32 (34,4%). Sự phân bố tần xuất 3 genotype giữa 2 nhóm khác biệt có ý nghĩa với 2 = 16,61 và p<0,01. Đặc biệt, cá thể đồng hợp H/H131 ở nhóm bệnh là 10 (10,1%) và nhóm chứng là 32 (34,4%), sự khác biệt này có ý nghĩa với 2 =16,6 và p<0,01. Tần xuất alen R131 là 104 (52,5%) ở nhóm bệnh và 72 (38,7%) ở nhóm chứng. Tần xuất alen H131 là 94 (47,5%) ở nhóm bệnh và 114 (61,3%) ở nhóm chứng. Nh vậy, ở nhóm bệnh, tần xuất alen H131 thấp hơn ở nhóm chứng một cách có ý nghĩa với 2 =7,4 và p<0,01. Bảng 1. Tần xuất genotype và alen của gien mã hoá cho Fc RIIA Tần xuất Nhóm bệnh (n = 99) Nhóm chứng (n = 93) Genotype R/R131 R/H131 H/H131 15 (15,1%) 74 (74,7%) 10 (10,1%) a 11 (11,8%) 50 (53,8%) 32 (34,4%) Alen R131 H131 104 (52,5%) 94 (47,8%) b 72 (38,7%) 114 (61,3%) a 2 =16,6 và p<0,01 so với nhóm chứng b 2 =7,4 và p<0,01 so với nhóm chứng Xác định genotype của Fc RIIIA. Hai phản ứng PCR đợc dùng để xác định genotype của FcRIIIA, mỗi phản ứng xác định sự hiện diện của một alen. ở cá thể đồng hợp, sản phẩm khuếch đại đợc thấy ở 1 trong 2 phản ứng PCR. ở cá thể dị hợp, sản phẩm khuếch đại đợc thấy ở cả 2 phản ứng PCR. Tần xuất genotype và tần xuất alen của FcRIIIA đợc trình bày trong bảng 2. Tần xuất của V/V158, V/F158 và F/F158 ở 67 bệnh nhân lần lợt là 11 (16,4%), 28 (41,8%) và 28 (41,8%) và ở 62 ngời chứng lần lợt là 10 (16,1%), 29 (46,8%) và 23 (37,1%). Sự phân bố tần xuất 3 genotype giữa 2 nhóm khác biệt không có ý nghĩa với 2 = 0,36 và p>0,1 . Bảng 2. Tần xuất genotype và alen của gien mã hoá cho Fc RIIIA Tần xuất Nhóm bệnh (n = 67) Nhóm chứng (n = 62) Genotype V/V158 V/F158 F/F158 11 (16,4%) 28 (41,8%) 28 (41,8%) a 10 (16,1%) 29 (46,8%) 23 (37,1%) Alen V158 F158 50 (37,3%) 84 (62,7%) b 49 (39,5%) 75 (60,5%) a 2 = 0,3 và p>0,1 so với nhóm chứng b 2 = 0,13và p>0,1 so với nhóm chứng Xác định genotype của Fc RIIIB. Hai phản ứng PCR đợc dùng để xác định genotype của FcRIIIB, mỗi phản ứng xác định sự hiện diện của một alen. ở cá thể đồng hợp, sản phẩm khuếch đại đợc thấy ở 1 trong 2 phản ứng PCR. ở cá thể dị hợp, sản phẩm khuếch đại đợc thấy ở cả 2 phản ứng PCR. Tần xuất genotype và tần xuất alen của FcRIIIB đợc trình bày trong bảng 3. Tần xuất của NA1/1, NA1/2 và NA2/2 ở 67 bệnh nhân lần lợt là 16 (23,9%), 33 (49,2%) và 18 (26,9%) và ở 66 ngời chứng lần lợt là 27 (40,9%), 32 (48,5%) và 7 (10,6%). Sự phân bố tần xuất 3 genotype giữa 2 nhóm khác biệt có ý nghĩa với 2 = 7,66 và p<0,05. Đặc biệt, cá thể đồng hợp NA2/2 ở nhóm bệnh là 18 (26,9%) và TCNCYH 28 (2) - 2004 3 nhóm chứng là 7 (10,6%), sự khác biệt này có ý nghĩa với 2 = 5,77 và p<0,05. Tần xuất alen NA1 là 65 (48,5%) ở nhóm bệnh và 86 (65,2%) ở nhóm chứng. Tần xuất alen NA2 là 69 (51,5%) ở nhóm bệnh và 46 (34,8%) ở nhóm chứng. Nh vậy, ở nhóm bệnh, tần xuất alen NA2 cao hơn ở nhóm chứng một cách có ý nghĩa với 2 =7,5 và p<0,01. Bảng 3. Tần xuất genotype và alen của gien mã hoá cho Fc RIIIB Tần xuất Nhóm bệnh (n = 67) Nhóm chứng (n = 66) Genotype NA 1/1 NA 1/2 NA 2/2 16 (23,9%) 33 (49,2%) 18 (26,9%) a 27 (40,9%) 32 (48,5%) 7 (10,6%) Alen NA 1 NA 2 65 (48,5%) 69 (51,5%) b 86 (65,2%) 46 (34,8%) a 2 = 5,77 và p<0,05 so với nhóm chứng b 2 = 7,5và p<0,01 so với nhóm chứng iv. Bàn luận Trong nghiên cứu này chúng tôi chứng minh rằng ở nhóm bệnh tần xuất H131 thấp hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng. Kết quả này phù hợp với các báo cáo trớc đây của Sato và của Song khi khảo sát ở bệnh nhân SLE ngời Nhật và ngời Hàn Quốc. Trái lại, một số báo cáo khác lại cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa trong sự phân bố genotype của FcRIIA giữa nhóm bệnh và nhóm chứng ở ngời Âu Mỹ (Caucasian), ngời Phi ở vùng Caribe, ngời Trung Quốc và ngời Malai. FcRIIA đợc biểu lộ trên màng tế bào của tế bào đơn nhân, đại thực bào, bạch cầu hạt trung tính và tiểu cầu. FcRIIA có 2 alen biểu lộ đồng trội, R131 và H131, khác nhau chỉ ở vị trí amino acid 131 (Arginine hoặc Histamine). Do đó, các cá thể có thể đợc xếp thành 3 loại FcRIIA H/H131, R/H131 và R/R131. Hình thái alotype H131 tác dụng có hiệu quả với các phức hợp miễn dịch hơn rất nhiều hình thái R131. Vì vậy, việc loại trừ phức hợp miễn dịch tốt nhất ở các cá thể H/H131, các cá thể R/H131 có khả năng trung bình và khả năng này kém nhất ở các cá thể R/R131. FcRIIIA đợc biểu lộ trên bề mặt tế bào NK và đại thực bào, có khả năng gắn với cả 2 dới lớp IgG1 và IgG3, giúp cho khả năng gây độc tế bào và thực bào. Tính đa hình thái thờng gặp nhất là đột biến điểm dẫn đến sự thay thế phenylalnin (F) cho valin (V) ở vị trí amino acid 158. Tính đa hình thái này gây ra sự biến đổi về chức năng, cá thể đồng hợp V/V có khả năng gắn IgG1 và IgG3 tốt hơn cá thể đồng hợp F/F. Sự phân bố tần xuất genotype của FcRIIIA trong nghiên cứu của chúng tôi không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhóm bệnh và chứng. Kết quả này không phù hợp với nghiên cứu của Koene khi nghiên cứu ở bệnh nhân SLE ngời Âu Mỹ (Caucasian). Mặt khác, theo Yun và Oh khi nghiên cứu ở bệnh nhân ngời Hàn Quốc và ngời Mỹ gốc Phi lại thấy không có mối liên quan giữa tính đa hình thái của gien mã hoá cho FcRIIIA và SLE. Với FcRIIIB, hai dạng xác định bằng huyết thanh học đã đợc mô tả, đó là NA1 và NA2 (NA: neutrophil antigen). Hai biển thể này có 4 điểm khác nhau trong chuỗi amino acid tại các vị trí 36, 65, 82 và 106. Tính đa hình thái này có ý nghĩa đối với chức năng sinh lý, cá thể đồng hợp NA2 có khả năng thực bào kém hơn cá thể mang NA1. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tần xuất NA2 ở nhóm bệnh cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng. Kết quả này phù hợp với kết quả của Hatta khi nghiên cứu trên bệnh nhân SLE ở ngời Nhật. Mặt khác, Yap khi khảo sát trên ngời Malay và Trung Quốc lại thấy không có sự liên quan giữa tính đa hình thái của FcRIIIB và SLE. Sự khác nhau trong các nghiên cứu trên có thể đợc lý giải theo một số cách nh sau. Thứ nhất, SLE là một bệnh phức tạp về mặt gien học và sự khác nhau về phenotype của bệnh giữa các nhóm dân tộc có thể có mối liên quan với sự khác nhau về sự phân bố các genotype. Thứ hai, ở những ngời bình thờng đã có sự phân bố khác nhau về tần xuất genotype của các gien khảo sát giữa các nhóm dân tộc. Cuối cùng, sự khác nhau này có thể phản ánh tính phức tạp của sự nhạy TCNCYH 28 (2) - 2004 4 cảm với SLE trong các quần thể có nguồn gốc khác nhau. v. Kết luận Về mối liên quan giữa tính đa hình thái của gien mã hoá cho Fc và bệnh lupus ban đỏ hệ thống, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: 1. Genotype của FcRIIA và FcRIIIB có thể là yếu tố nguy cơ cho sự xuất hiện SLE. 2. Genotype của FcRIIIA không có liên quan tới sự xuất hiện SLE. Tài liệu tham khảo 1. Salmon JE, Kimberly RP, Gibofsky A et al. Defective mononuclear phagocyte function in systemic lupus erythematosus: dissociation of Fc receptor-ligand binding and internalization. J Immunol 1984; 133: 2525-2531. 2. Van de Winkel JGJ, Capel PJA. Human IgG Fc receptor heterogeneity: molecular aspects and clinical implications. Immunol Today 1993; 14: 215-221. 3. Golzalez-Escribano MF, Aguilar F, Sanchez-Roman J et al. FcRIIA, FcRIIIA and FcRIIIB polymorphisms in Spanish patients with systemic lupus erythematosus. Europ J Immunogenet 2002; 29: 301-306. 4. Tan EM, Cohen AS, Fries JF et al. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1982; 25: 1271-1277. 5. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988; 16: 1215. 6. Yap SN, Phipps ME, Manivasagar M et al. Human Fc gamma receptor IIA (FcRIIA) genotyping and association with systemic lupus erythematosus (SLE) in Chinese and Malays in Malaysia. Lupus 1999; 8:305-310. 7. Wu J, Edberg JC, Redecha PB et al. A novel polymorphism of FcRIIIA (CD16) alters receptor function and predisposes to autoimmuno diseases. J Clin Invest 1997; 100: 1059-1070. 8. Henssner MJ, Curtis BR, Endean DJ et al. Determination of neutrophil antigen gene frequencies in five ethnic groups by polymerase chain reaction with sequence-specific primers. Transfusion 1996; 36: 895-899. Summary association between the polymorphism of FcR and systemic lupus erythematosus The polymorphisms of FcRIIA, FcRIIIA and FcRIIIB in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) were examined by using the polymerase chain reaction (PCR) method with genomic DNA and allele-specific primers. In the frequency of FcRIIA genotypes, the homozygosity of FcRIIA-H131 was 10 (10,1%) of 99 SLE patients and 32 (34,4%) of 93 healthy controls (p<0,01). The allele frequency of FcRIIA-H131 in SLE patients was also significantly lower than that in the controls (p<0,01). In the frequency of FcRIIIB genotypes, the homozygosity of FcRIIIB-NA2/2 was 18 (26,9%) of 67 SLE patients and 7 (10,6%) of 66 healthy controls (p<0,05). The allele frequency of FcRIIIB-NA2 in SLE patients was also significantly higher than that in the controls (p<0,01). No significant association was found between the frequency of FcRIIIA genotypes and SLE patients. The unusual distribution of FcRIIA and FcRIIIB polymorphism suggested that FcRIIA and FcRIIIB, but not FcRIIIA, might be involved in the development of SLE. . genotype của FcRIIA, FcRIIIA và FcRIIIB ở bệnh nhân SLE nhằm nghiên cứu mối liên quan giữa tính đa hình thái của FcR và bệnh lupus ban đỏ hệ thống. ii luận Về mối liên quan giữa tính đa hình thái của gien mã hoá cho Fc và bệnh lupus ban đỏ hệ thống, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: 1. Genotype của FcRIIA