1 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA HÓA NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH AXIT HỮU CƠ TRONG LÁ CÂY SỐNG ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) Ở XÃ HOÀ LIÊN, HUYỆN HỒ VANG, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN SU PHẠM Giáo viên hướng dẫn : GS.TS Đào Hùng Cường Sinh viên thực : Trương Văn Cương – 08SHH Đà Nẵng - Năm 2012 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây sống đời, tên khoa học Kalanchoe pinnata (Lamk.) Pers, họ Crassulaceae, có tên gọi khác nhƣ thuốc bỏng, trƣờng sinh, diệp sinh Nó vừa cảnh, vừa thuốc đƣợc sử dụng từ lâu đời y học cổ truyền không Việt Nam mà giới Có thể sử dụng tất phận sống đời nhƣng chủ yếu dùng Cây sống đời phân bố khu vực châu Á, Thái Bình Dƣơng, Caribe Nó phân bố rộng rãi Việt Nam Cây sống đời dễ trồng, mọc hoang dã, cần bẻ cắt già cắm xuống đất đƣợc Cây sống đời có tác dụng chữa bệnh tiêu thũng, giảm đau, sinh cơ, viêm phế quản, viêm khớp, bóng nƣớc, bỏng cơng dụng nhƣ kháng khuẩn, làm lành vết thƣơng, lỡ loét, viêm tấy, cầm máu, ức chế miễn dịch, bảo vệ gan, thận, an thần, chống tác nhân gây đột biến, làm thuốc giải độc Trên giới loài thuộc chi Kalanchoe đƣợc trọng nghiên cứu lĩnh vực: chiết tách, xác định thành phần hợp chất hữu cơ, nghiên cứu tính kháng khuẩn chống độc tế bào…[12] Ở nƣớc ta chƣa có nghiên cứu mang tính thành phần, tính chất, khả ứng dụng, công nghệ khai thác hợp chất hố học có sống đời Để góp phần vào nguồn tƣ liệu loài sống đời nhƣ phát triển tác dụng chữa bệnh tuyệt vời nó, tơi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu xác định axit hữu sống đời (Kalanchoe pinnata) xã Hoà Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần axit hữu sống đời Từ đóng góp vào nguồn thông tin, tƣ liệu khoa học cấy sống đời, tạo sở khoa học phát huy tác dụng chữa bệnh Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng: sống đời hái xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng - Phạm vi nghiên cứu: + Xác định số số nhƣ độ ẩm, hàm lƣợng tro tƣơi + So sánh, xác định tổng lƣợng axit chiết đƣợc dung môi khác từ phƣơng pháp chiết khác + Định danh số axit phổ GC-MS + Thử hoạt tính kháng khuẩn kháng oxi hóa dịch chiết tƣơi Phƣơng pháp nghiên cứu 4.1 Nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp tài liệu, tƣ liệu, sách báo nƣớc - Trao đổi kinh nghiệm với chuyên gia, thầy cô giáo đồng nghiệp 4.2 Phƣơng pháp thực nghiệm - Phƣơng pháp lấy mẫu, thu hái xử lý mẫu; - Phƣơng pháp xác định số vật lý hóa học: xác định độ ẩm phƣơng pháp trọng lƣợng, xác định hàm lƣợng tro phƣơng pháp tro hóa mẫu; - Phƣơng pháp chiết: ngâm kiệt, chƣng ninh, chiết soxhlet dung mơi có độ phân cực khác nhau; - Phƣơng pháp chuẩn độ axit – bazơ để định lƣợng axit hữu phân cực; - Phƣơng pháp xác định thành phần hóa học, định danh xác định cấu trúc cấu tử phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS); - Thử hoạt tính kháng khuẩn kháng oxi hóa dịch chiết tƣơi Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp thông tin khoa học thành phần axit cơng dụng phối hợp sống đời góp phần nâng cao giá trị sử dụng sống đời làm tƣ liệu cho nghiên cứu sau 5.2 Ý nghĩa thực tiễn - Giúp cho việc ứng dụng sống đời phạm vi rộng cách khoa học - Giải thích cách khoa học số kinh nghiệm, thuốc dân gian, ứng dụng sống đời Cấu trúc luận văn Luận văn có 46 trang phần mở đầu trang, kết luận kiến nghị trang, tài liệu tham khảo có trang Luận văn có bảng, 28 hình đồ thị Nội dung chia thành chƣơng: Chƣơng 1: Tổng quan (12 trang) Chƣơng 2: Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu (5 trang) Chƣơng 3: Kết thảo luận (22 trang) Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CÂY SỐNG ĐỜI - Cây sống đời hay cịn gọi bỏng, bơng, trƣờng sinh, diệp sinh căn, đà , vừa cảnh, vừa thuốc chữa bệnh hàng ngày đơn giản hiệu - Tên Khoa học: Kalanchoe pinnata (Lamk.) Pers 1805 (CCVN, 1:967) [2] - Cây sống đời thuộc: + Lớp: Magnoliopsida + Bộ: Saxifragales + Họ: thuốc bỏng (Crassulaceae) + Chi: Kalanchoe Bao gồm khoảng 33 chi chứa khoảng 1.400 lồi Hình 1.1 Cây sống đời 1.2 PHÂN BỐ Cây sống đời loại tự nhiên khu vực châu Á, Thái Bình Dƣơng vùng Caribe Nó phân bố rộng rãi Việt Nam[12] Lí chủ yếu mà đƣợc phân bố rộng rãi nhƣ có khả sống nhiều vùng khí hậu khác dễ dàng trồng vƣờn 1.3 ĐẶC ĐIỂM CÂY SỐNG ĐỜI Cây sống đời dễ trồng, mọc hoang dã, cần bẻ cắt già cắm xuống đất đƣợc hoa sống đời màu tím hồng đẹp nên sống đời đƣợc trồng nhiều làm cảnh đƣợc trồng chậu hoa nhỏ dùng để trang trí nhà Cây sống đời có thân thảo rỗng, cao 0,5-1 mét; có hai loại lá: loại to loại nhỏ Lá mọc đối thành hình chữ thập, dày có khí ngun; mép có cƣa tù, to, mặt bóng có cuống dài từ 2-5 cm Hoa mọc kẽ lá, màu tím hồng, rủ chúc xuống nhƣ đèn lồng Hoa nở vào tháng 3-5, có vào tháng 4-6 [28] Cây sống đời có vị nhạt, chua chua, chát chát, dễ uống ốm đau lại có tính mát, tốt dùng tiêu thũng, thống, sinh Sống đời dùng làm thuốc giải độc chữa bỏng 1.4 CÔNG DỤNG CÂY SỐNG ĐỜI Các nƣớc giới sử dụng sống đời từ lâu với nhiều mục đích phong phú Tại Brazil sử dụng chữa áp-xe, bệnh vòm họng, viêm phế quản, viêm khớp, bóng nƣớc, bỏng, cục chai, viêm kết mạc, ho, viêm da, bệnh da liễu, đau tai, eczema, phù, sốt, bệnh tăng nhãn áp, nhức đầu, nhiễm trùng, viêm, côn trùng đốt, vấn đề đƣờng ruột, ngứa, sỏi thận, rối loạn bạch huyết, lở loét miệng căng thẳng, nhiễm trùng hô hấp, bệnh thấp khớp, vấn đề da, đau răng, bệnh lao, ung thƣ, loét, suy tiết niệu, mụn cơm, ho gà, vết thƣơng, sử dụng nhƣ thuốc an thần Tại Ecuador ngƣời địa sử dụng nƣớc tách từ cho xƣơng bị gãy, vết bầm tím bên trong, sử dụng chữa nhức mỏi, tiêu chảy, vấn đề da Tại Ấn Độ sử dụng chữa cảm giác khó chịu bụng, sơi, vết bầm tím, bệnh tả, cầm máu sát trùng vết cắt, bệnh tiểu đƣờng, tiêu chảy, kiết lỵ, đầy hơi, nhức đầu, sỏi thận, khó tiêu, trùng cắn, ghẻ, lở loét, suy tiết niệu, vết thƣơng Tại Mexico sử dụng chữa bệnh nhiễm trùng mắt, nhức đầu, viêm nhiễm, rối loạn kinh nguyệt, mụn, vết thƣơng Tại Nicaragua sử dụng chữa đau nhức, bỏng, cảm lạnh, ho, sốt, nhức đầu, đau, nhiễm trùng đƣờng hô hấp Tại Nigeria sử dụng chữa ho, đau tai, eczema, viêm, mụn Tại Peru sử dụng chữa bệnh nhiễm trùng vi khuẩn, bóng nƣớc, gãy xƣơng, viêm phế quản, ung thƣ (ung thƣ hạch), viêm kết mạc, ho, đau tai, nhiễm trùng mắt, động kinh, viêm quầng, sốt, khí đốt, nhức đầu, ợ nóng, viêm, vấn đề đƣờng ruột, đau nửa đầu, buồn nôn, vấn đề da, lở loét, viêm niệu đạo Tại Nam Mỹ sử dụng chữa bệnh suyễn, đau tai, đau đầu, ức chế khối u Tại Mỹ sử dụng chữa thủy đậu, sốt, đau bụng… Những loài khác sống đời đƣợc sử dụng nhiều y học Đông Dƣơng quần đảo Philippines Lá vỏ thuốc bổ đắng, chất làm se cho ruột, giảm đau, tống ruột, hữu ích điều trị tiêu chảy ói mửa Nó đƣợc ứng dụng để chữa trị bên lẫn bên trong, điều trị cho tất loại đau viêm, nhiễm vi khuẩn, virus bệnh nấm, nhiễm trùng, leishmaniasis, đau tai, nhiễm trùng hô hấp trên, viêm loét dày, cảm cúm, sốt, điều trị vết cắt, vết thƣơng, trĩ, chứng rong kinh, đổi màu da, bóng nƣớc, loét tróc vảy, mắt, bỏng, tiêu chảy, kiết lỵ, đau đầu, ói mửa, viêm cấp tính viêm phế quản [15] Ở Việt Nam, sống đời đƣợc sử dụng nhiều thuốc dân gian: - Say rƣợu: Ăn 10 sống đời, sau 10 phút khỏi say - Viêm họng: Ăn 10 sống đời, chia làm 10 lần ngày (sáng lá, chiều lá, tối lá) Nên nhai ngậm nuốt bã Dùng ngày khỏi - Mất sữa: Sáng chiều lần ăn sống đời, sau ngày có sữa - Mất ngủ: Chiều tối ăn lần sống đời, giấc ngủ đến sớm - Viêm xoang mũi: Giã nát sống đời, lấy nƣớc thấm vào bông, nút hố mũi bên viêm Ngày làm 4-5 lần Nếu viêm bên sáng nút bên chiều nút bên - Trĩ nội: Mỗi ngày dùng 10 sống đời (sáng lá, chiều lá, tối lá) nhai nuốt bớt nƣớc, bã bỏ vào gạc vải, đắp lên hậu môn Trƣớc đắp thuốc phải làm vệ sinh hậu môn nƣớc pha muối Sau 20-45 ngày khỏi - Kiết lỵ (viêm đại tràng): Mỗi ngày ăn 20 sống đời (sáng lá, chiều lá, tối lá) Trẻ 5-10 tuổi dùng liều nửa ngƣời lớn Ăn ngày khỏi 1.5 CÁC TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CÂY SỐNG ĐỜI Cây sống đời từ lâu đƣợc biết đến nhƣ thuốc đƣợc đánh giá cao giới nhƣ nguồn phong phú khả trị bách bệnh Phần phần rễ có tác dụng chữa trị cao [20] Sống đời Kalanchoe giàu ancaloit, triterpenes, glycosides, flavonoid, steroid chất béo Đặc biệt có chứa nhóm hóa chất gọi bufadienolides Nó có cấu trúc hoạt động tƣơng tự nhƣ hai glycosides tim khác, digoxin digitoxin (thuốc dùng để điều trị lâm sàng suy tim sung huyết điều kiện liên quan) Gần nhà hóa học Nhật Bản phát khả kháng khuẩn gây bệnh sốt rét sống đời nhiên chƣa chứng minh thành phần có tác dụng công dụng Nhiều thuốc cổ truyền Kalanchoe Pinnata đƣợc giải thích nghiên cứu lâm sàng đƣợc tiến hành Nó đƣợc sử dụng làm thuốc giảm đau, chống dị ứng, chống phản vệ (làm giảm phản ứng dị ứng), chống viêm, antitumorous, antiulcerous, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng histamine, kháng siêu vi, trầm cảm hệ thần kinh trung ƣơng, giải nhiệt (giảm sốt) gastroprotective (bảo vệ dày), ức chế miễn dịch (ngăn chặn số tế bào miễn dịch), immunomodulator (điều biến số tế bào miễn dịch overactive), vết thƣơng côn trùng, giãn cơ, thuốc an thần [27] Kháng khuẩn: Sự diện hợp chất phenolic sống đời có khả chống vi khuẩn Lá nƣớc ép tƣơi đƣợc chứng minh vai trò quan trọng hoạt động kháng khuẩn Staphylococcus, E coli, Shigella, Bacillus Pseudomonas [11]; Chống ung thƣ: Các có chứa nhóm chất gọi bufadienolides Nó có cấu trúc tác động tƣơng tự nhƣ hai glycoside tim khác digoxin digitoxin (thuốc đƣợc sử dụng để điều trị lâm sàng suy tim sung huyết số bệnh liên quan) Bufadienolides Kalanchoe chứng minh nghiên cứu lâm sàng có tính kháng khuẩn, phịng ngừa ung thƣ [21] Bersaldegenin-1,3,5-orthoacetate ức chế tăng trƣởng số tế bào ung thƣ; Chống giun kí sinh: Trích xuất nƣớc ép Kalanchoe đƣợc chứng minh ngăn ngừa điều trị leishmaniasis (một bệnh ký sinh trùng phổ biến nƣớc nhiệt đới đƣợc truyền qua vết thƣơng hở) ngƣời động vật [16]; Chống côn trùng: Bryophyllin A cho thấy hoạt động mạnh mẽ chống lại ấu trùng côn trùng tằm [22]; Chống dị ứng: Công dụng truyền thống Kalanchoe trị bệnh hơ hấp ho đƣợc giải thích nghiên cứu chứng minh nƣớc ép có tiềm chống histamine chống dị ứng Trong nghiên cứu (với chuột lợn guinea) nƣớc ép bảo vệ chống lại chất hóa học gây phản ứng phản vệ tử vong chọn lọc ngăn chặn thụ thể histamine phổi; Chống viêm: Các nghiên cứu thể khẳng định Kalanchoe làm giảm sốt, kháng viêm, giảm đau tác dụng giãn Hiệu ứng chống viêm đƣợc giải thích phần tăng khả hệ miễn dịch [24]; An thần: Trong nghiên cứu động vật kalanchoe cung cấp trích xuất an thần Cơng dụng phần trích xuất làm tăng nồng độ chất truyền thần kinh não gọi GABA (gamma aminobutyric axit) [13]; Phịng, chống lt: Trích xuất bảo vệ chuột khỏi loét, gây cảm ứng nhƣ căng thẳng, aspirin, ethanol histamine giảm căng thẳng Hyper [16] Các có chứa hydroxyproline chữa lành vết thƣơng [18]; Chất chống oxi hóa: Lá có chứa hợp chất phenolic nhƣ axit phenolic Quercetin chất chống oxy hóa [9], [24]; 10 Chống kí sinh trùng sốt rét: Những nghiên cứu gần tập trung làm sáng tỏ khả chữa bệnh sốt rét sống đời, nhiên chƣa cho kết rõ ràng thành phần có cơng dụng cho tác dụng [8], [23] 11 Chống tác nhân gây đột biến: Obaseiki-et al Ebor điều tra chiết dung môi hữu hoạt động ức chế đột biến gây hoạt động ethyl methanesulfonate TA100 S typhimurium TA1002 hoạt động chống lại tác động ngƣợc gây 4nitro-phenylenediamine-o 2-aminofluorene TA98 12 Bảo vệ gan thận: Nƣớc ép tƣơi đƣợc sử dụng hiệu để điều trị vàng da khu vực Bundelkhand Ấn Độ Có tác dụng bảo vệ hiệu việc giảm gentamicin gây thận chuột, bao gồm chất chống oxy hóa hoạt động khử gốc oxi hố 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HĨA HỌC THỰC VẬT CỦA CHI KALANCHOE Cho đến giới tìm khoảng 33 chi Kalanchoe có gần 1400 lồi Riêng Việt Nam có 10 loài thuộc chi Kalanchoe Toàn đƣợc sử dụng nhƣng đƣợc dùng phổ biến 10 Thành phần hóa học có hợp chất phenolic bao gồm axit p-cumaric, syringic, axit caffeic, p-hydroxybenzoic Các axit nhƣ axit malic, isocitric, citric, succinic, fumaric, pyruvic, oxalacetic, lactic, oxalic số axit hữu khác Ngoài cịn có glucosid flavonoic nhƣ quercetin 3-diarabinosid, kaempferol 3glucosid [27] Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, tác giả làm rõ thành phần cách trích xuất cơng dụng số axit có sống đời Cơng dụng nhóm axit bảo quản thực phẩm diệt khuẩn hiệu ứng chúng với vi khuẩn Nguyên tắc quan trọng chế hoạt động axit hữu với vi khuẩn axit hữu khơng phân li xâm nhập vào thành tế bào vi khuẩn làm gián đoạn sinh lý bình thƣờng số loại vi khuẩn mà gọi nhạy cảm với pH, có nghĩa chúng khơng thể chịu đƣợc thay đổi pH lớn bên thể Trong số có vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp C.perfringens, Listeria monocytogenes, Campylobacter Khi khuếch tán thụ động axit hữu vào vi khuẩn, nơi mà độ pH gần trung tính, axit phân li giảm pH bên vi khuẩn, làm giảm ngừng phát triển vi khuẩn Mặt khác, phần anion axit hữu khơng thể khỏi vi khuẩn mẫu phân ly tích tụ vi khuẩn phá vỡ nhiều chức trao đổi chất, dẫn đến tăng áp suất thẩm thấu, không tƣơng thích với tồn vi khuẩn Dựa vào cấu tạo gốc R gắn vào -COOH chia axit thành nhóm sau: 1.6.1 Nhóm axit phenolic Hợp chất phenolic lớp hợp chất hữu bao gồm nhóm hidroxyl (-OH) gắn với nhóm hydrocacbon thơm Mặc dù tƣơng tự nhƣ hợp chất ancol nhƣng lớp phenol có thuộc tính chúng có nhóm hidroxyl khơng liên kết với ngun tử cacbon no Chúng có tính axit tƣơng đối cao vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử ôxy liên kết tƣơng đối lỏng lẻo nguyên tử ơxy với ngun tử hiđrơ nhóm hidroxyl Tính axit nhóm hidroxyl phenol nói chung nằm khoảng trung gian rƣợu axit cacboxylic (pKa chúng thông thƣờng nằm khoảng 10 - 12) 42 Este diisooctyl phtalat 5.22 Este Metyl-3,7,11,15tetrametyl 2.7 hexadecantrien-4,6,10-oat Este Dietyl malat 33.39 Este Etyl myristat 1.04 Este Etyl pentadecanoat 0.51 Axit hexadecen-9-oic 1.11 Axit Hexadecanoic 3.47 Este etyl palmitat 19.74 Este etyl oleat 1.71 43 Axit stearic 2.29 Este etyl stearat 21.55 Este dioctyl adipat 0.95 Este Dioctyl phtalat 2.92 Este metyl-3,7,11,15tetrametyl hexadecan- 1.19 6,10,14-trienoic 3.3.4 Thử hoạt tính sinh học dịch chiết nƣớc 3.3.4.1 Thử hoạt tính kháng khuẩn Kết thử hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết nƣớc đƣợc biểu diễn bảng Bảng 3.7 Ức chế vi khuẩn Gram dương Nồng độ ức chế 50% phát triển vi sinh vật nấm kiểm định –IC50 (  g/ml) Gram (+) Nấm Gram (-) Pseudomonas Bacillus Lactobacillus Salmonnella aeruginosa subtilis fermentum >0,57.10-4N >0,57.10-4N >0,57.10-4N Escherichia Pseudomonas Candida enterica coli aeruginosa albicans >0,57.10-4N >0,57.10-4N >0,57.10-4N >0,57.10-4N  Kết luận: Mẫu thử thể hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định nồng độ >0,57.10-4N 3.3.4.2 Thử hoạt tính chống oxy hố Peroxydaza  Kết quả: Mẫu thể hoạt tính chống oxi hố Peroxydaza nồng độ >0,57.10-4  Nhận xét: Dịch chiết axit sống đời thể hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định hoạt tính chống oxi hoá peroxydaza nồng độ 44 0,57.10-4 Nồng độ thấp, ta nhận thấy dịch chiết axit từ sống đời có chứa hợp chất có hoạt tính sinh học cao 45 KẾT LUẬN Trong trình nghiên cứu đề tài đạt số kết nhƣ sau: Độ ẩm trung bình sống đời tƣơi Kalanchoe Pinnata (Lamk.) Pers là: 92,3%, hàm lƣợng tro trung bình là: 1,06% Nguyên liệu cho nhiều axit tƣơi, dung môi chiết cho tổng lƣợng axit nhiều C2H5OH Xác định axit phân cực yếu phƣơng pháp phổ GC-MS cho thấy có 13 axit hữu khác tồn dạng axit tự este Đặc biệt có axit tồn dạng este có nồng độ cao nhƣ: malic 33.39%, panmitic 19.74%, stearic 21.55% Thử hoạt tính kháng sinh vật kiểm định hoạt tính chống oxy hoá peroxydaza cho kết mẫu dịch chiết thể hai hoạt tính nồng độ >0,57.10-4N KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu xác định lƣợng axit đặc biệt nhóm axit phenolic tổng lƣợng hợp chất phenol sống đời có ứng dụng quan trọng Nghiên cứu, xác định thành phần hóa học lá, thân, rễ sống đời đƣợc trồng khu vực thổ nhƣỡng khác để khảo sát mở rộng phát triển sau 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Hoàng Minh Châu, Từ Văn Mặc, Từ Vọng Nghi (2002), Cơ sở hố học phân tích, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội [2] Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y hoc, Hà Nội [3] Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý hóa lý, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội [4] Bùi Xn Vững (2009), Giáo trình mơn Phương pháp phân tích cơng cụ, ĐHSP Đà Nẵng Tiếng Anh [5] Anjoo Kamboj, Ajay Kumar Saluja (2009), Bryophyllium pinnatum (Lam.) Kurz: Phytochemical and parmacological profile, Pharmacognosy Review, 364-374 [6] Anna L (2004), “Antiproliferative and apoptotic effects of selective phenolic acids on T47D human breast cancer cells: potential mechanisms of action”, Breast Cancer Res, (2), 63-74 [7] Babich H, Sedletcaia A, Kenigsberg B (2002), "In vitro cytotoxicity of protocatechuic acid to cultured human cells from oral tissue: involvement in oxidative stress" [8] Chenniappan, K and M Kadarkarai (2010), “In vitro antimalarial activity of traditionally used Western Ghats plants from India and their interactions with chloroquine against chloroquine-resistant Plasmodium falciparum”, Parasitol Res, (10.1007), - 10 [9] Fatimatuzzahrra Bt Mohd Fadzel (2008), “Extraction and comparision of total Phenolic content from Malaysian grown Kalanchoe Pinnata”, Univesiti Teknologi MARA [10] Fred M (2005), “Ferulic acid stabilizes a solution of vitamins C and E and doubles its photoprotection of skin”, J Invest Dermatol, (4), 32 – 38 47 [11] Joseph, B., RM Priya PAM Helen and S Sujatha (2010), “Bio-active compounds in essential oil and its effects of antimicrobial, cytotoxic activity from the Kalanchoe Pinnata (L.) Leaf”, Biotechnol, (9), 10-14 [12] Joseph, S Sridhar, Sankarganesh, Justinraj and Biby T Edwin Sridhar (2010), “Rare Medicinal Plant-Kalanchoe Pinnata”, Indian J Exp, Biol, (52), 230236 [13] Joseph, S Sridhar, Sankarganesh, Justinraj and Biby T Edwin Sridhar (2010), “Rare Medicinal Plant-Kalanchoe Pinnata”, Indian J Exp, Biol, (52), 230236 [14] Lin HH, Chen JH, Huang CC, Wang CJ (2007), "Apoptotic effect of 3,4dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/p38 MAPK signaling activation", Int J Cancer, (11), 2306–2316 [15] Magareth B.C.Gallo, Miranda J Sarachinc, Biological Activities of Lupeol, International of journal ò Biomedical and Pharmaceutical Sciences 3, 46-66 [16] Muzitano, MF, LW Tinoco, C Guette, CR Kaiser, B Rossi-Bergmann and SS Costa (2006), “The antileishmanial activity assessment of unusual flavonoids from Kalanchoe pinnata”, Phytochemistry, (67), 2071-2077 [17] Nakamura Y, Torikai K, Ohto Y, Murakami A, Tanaka T, Ohigashi H (2000), "A simple phenolic antioxidant protocatechuic acid enhances tumor promotion and oxidative stress in female ICR mouse skin: dose-and timing-dependent enhancement and involvement of bioactivation by tyrosinase", Carcinogenesis, (10), 1899–1907 [18] Nayak, BS, JR Marshall and G Isitor (2010), “Wound healing potential of ethanolic extract of Kalanchoe pinnata Lam”, Indian J Exp, Biol, (48), 572576 [19] Paulo S (2005), “Role of NADPH oxidase-mediated generation of reactive oxygen species in the mechanism of apoptosis induced by phenolic acids in HepG2 human hepatoma cells”, Arch Pharm Res,(10), 9-17 [20] Simoes-Wust, AP, M Graos, CB Duarte, R Brenneisen and M Hamburger (2010), “Juice of Bryophyllum pinnatum (Lam.) inhibits oxytocin-induced 48 increase of interacellular calcium concentration in human myometrial cells”, Phytomedicine, (17), 980-986 [21] Supratman, U., T Fujita, K Akiyaa, H Hayashi, A Murkami, H Sakai, K Koshimizy and H Ohigashi (2001), “Anti-tumor promoting activity of bufadienolides from Kalanchoe pinnata and K daigremontiana X tubiflora”, Biosci Biotechnol Biochem, (65), 947-949 [22] Supratman, U., T Fujita, K Akiyama and H Hayashi (2000), “New insecticidal bufadienolide, bryophyllin C, from Kalanchoe pinnata”, Biosci Biotechnol Biochem, (64), 1310-1312 [23] Willcox, ML and G Bodeker (2004), “Traditional herbal medicines for malaria”, BMJ, (329), 1156-1159 [24] Yadav, NP and VK Dixit (2003), “Hepatoprotective activity of leaves of Kalanchoe pinnata Pers”, J Ethnopharmacol, (86), 197-202 [25] http://ars.usda.gov/is/AR/archive/oct06/nuts1006.htm, (11/01/2011) [26] http://en.wikipedia.org/wiki/Citric_acid, (11/02/2011) [27] http://rain-tree.com/coirama.htm, (15/05/2011) [28] http://www.rauhoaquavietnam.vn/default.aspx?tabID=5&ID=20&LangID= 1&NewsID=1042&PageNum=22 49 MỤC LỤC Trang nhiệm vụ khoá luận tốt nghiệp i Lời cảm ơn ii Danh mục bảng iii Danh mục hình vẽ, đồ thị iv MỞ ĐẦU Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CÂY SỐNG ĐỜI 1.2 PHÂN BỐ 1.3 ĐẶC ĐIỂM CÂY SỐNG ĐỜI 1.4 CÔNG DỤNG CÂY SỐNG ĐỜI 1.5 CÁC TÁC DỤNG DƢỢC LÝ CỦA CÂY SỐNG ĐỜI 1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HĨA HỌC THỰC VẬT CỦA CHI KALANCHOE 1.6.1 Nhóm axit phenolic .10 1.6.1.1 Axit caffeic 11 1.6.1.2 Axit ferulic 11 1.6.1.3 Axit protocatechuic 12 1.6.2 Axit béo 12 1.6.3 Axit hữu phân cực 13 1.6.3.1 Axit malic 14 1.6.3.2 Axit citric 14 Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 17 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Phân tích trọng lƣợng 17 2.2.1.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 17 2.2.1.2 Xác định hàm lƣợng tro nguyên liệu 18 2.2.1.3 Xác định khối lƣợng axit béo 18 2.2.2 Phƣơng pháp chiết tách 18 50 2.2.2.1 Chiết đơn giản lần 18 2.2.2.2 Chiết đơn giản, nhiều lần 18 2.2.3 Phƣơng pháp chuẩn độ axit – bazơ 19 2.2.4 Phƣơng pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) 19 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 22 3.1.1 Xử lý nguyên liệu, xác định tổng axit sống đời tƣơi, khô phƣơng pháp chuẩn độ cân 22 3.1.2 Định danh thành phần axit dịch chiết sống đời phổ GC-MS 24 3.1.3 Thử hoạt tính sinh học dịch chiết H2O 24 3.2 TIẾN HÀNH THỰC NGHIỆM .25 3.2.1 Thu nguyên liệu 25 3.2.2 Xử lí nguyên liệu 25 3.2.3 Xác định số đại lƣợng vật lí 25 3.2.3.1 Xác định độ ẩm 25 3.2.3.2 Xác định hàm lƣợng tro sống đời 26 3.2.4 Xác định tổng lƣợng axit hữu 26 3.2.4.1 Chiết Soxhlet dung môi C2H5OH 27 3.2.4.2 Chƣng ninh H2O 28 3.2.4.3 Ngâm kiệt ete dầu hỏa 29 3.2.4.4 Chiết Soxhlet dung môi CHCl3 30 3.2.5 Định danh xác định thành phần axit dựa vào phổ GC-MS .30 3.2.5.1 Chƣng ninh KOH 31 3.2.5.2 Chiết C2H5OH 31 3.2.6 Thử hoạt tính sinh học dịch chiết H2O 31 3.2.6.1 Thử hoạt tính kháng sinh vật kiểm định 32 3.2.6.2 Thử khả chống oxi hóa 33 3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.3.1 Khảo sát đại lƣợng vật lý 34 3.3.1.1 Độ ẩm 34 51 3.3.1.1 Hàm lƣợng tro 34 3.3.2 Kết xác định tổng lƣợng axit sống đời tƣơi khô phƣơng pháp chuẩn độ cân 35 3.3.3 Kết xác định axit dịch chiết tƣơi sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS 36 3.3.3.1 Kết phổ GC-MS dịch chiết chƣng ninh KOH 36 3.3.3.2 Kết phổ GC-MS dịch chiết soxhlet dung môi C2H5OH 38 3.3.4 Thử hoạt tính sinh học dịch chiết nƣớc 43 3.3.4.1 Thử hoạt tính kháng khuẩn 43 3.3.4.2 Thử hoạt tính chống oxy hố Peroxydaza 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 52 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐH SƢ PHẠM Độc lập - Tự - Hạnh phúc KHOA HOÁ NHIỆM VỤ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Trƣơng Văn Cƣơng Lớp : 08SHH Tên đề tài Nghiên cứu xác định axit hữu sống đời (Kalanchoe pinnata) xã Hoà Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng Nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị Nguyên liệu: sống đời tƣơi khơ Dụng cụ, thiết bị: cốc thuỷ tinh 250ml, bình tam giác 250ml, bình cầu 500ml, ống sinh hàn hồi lƣu, phễu chiết, chiết soxhlet, bếp đun bình cầu, lị sấy, lo nung, cân phân tích Nội dung nghiên cứu + Xác định số số nhƣ độ ẩm, hàm lƣợng tro tƣơi + So sánh, xác định tổng lƣợng axit chiết đƣợc dung môi khác từ phƣơng pháp chiết khác + Định danh số axit phổ GC-MS + Thử hoạt tính kháng khuẩn kháng oxi hóa dịch chiết tƣơi Giáo viên hƣớng dẫn: GS.TS Đào Hùng Cƣờng Ngày giao đề tài: 25/11/2010 Ngày hoàn thành: 15/09/2011 Chủ nhiệm khoa Giáo viên hƣớng dẫn (Kí ghi rõ họ tên) (Kí ghi rõ họ tên) 53 Sinh viên hoàn thành nộp báo cáo cho Khoa ngày tháng năm 2012 Kết điểm đánh giá Ngày tháng năm 2012 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Kí ghi rõ họ tên) 54 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn thầy giáo GS.TS Đào Hùng Cƣờng tận tình hƣớng dẫn, bảo động viên em suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo giảng dạy môn thầy cô công tác phịng thí nghiệm dạy dỗ, giúp đỡ cho em suốt thời gian học tập nghiên cứu trƣờng Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Phạm Thị Thanh An - Học viên cao học khố 2008 - 2011 tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em thời gian làm đề tài Đà Nẵng, ngày 12 tháng 05 năm 2012 Trƣơng Văn Cƣơng 55 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 3.1 Kết xác định độ ẩm sống đời 33 Bảng 3.2 Kết xác định tỉ lệ tro sống đời sấy khô 33 Bảng 3.3 Tổng lƣợng axit sống đời tƣơi khô 34 Bảng 3.4 Một số chất đƣợc định danh GC-MS mẫu 36 Bảng 3.5 Một số chất đƣợc định danh GC-MS mẫu 39 Bảng 3.6 Một số axit đƣợc xác định dịch chiết sống đời tƣơi 40 Bảng 3.7 Ức chế vi khuẩn Gram dƣơng 42 56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên hình Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12 Hình 3.13 Hình 3.14 Hình 3.15 Hình 3.16 Hình 3.17 Hình 3.18 Hình 3.19 Cây sống đời Axit caffeic Axit ferulic Axit protocatechuic Axit malic Axit citric Cây sống đời Soxhlet Cấu trúc khối máy sắc kí khí Lá sống đời tƣơi, cắt nhỏ Bột sống đời sấy khô, xay nhỏ Bã rắn, dịch trƣớc tẩy màu Dịch chiết sau tẩy màu Dịch sau chƣng ninh Dịch axit chuẩn độ NaOH Chiết dịch ngâm với KOH Axit hóa HCl đặc Dịch CHCl3 đƣợc chiết KOH Kết tủa axit béo Mẫu Mẫu Đồ thị biểu diễn phụ thuộc tổng lƣợng axit vào dung môi Phổ đồ GC-MS dịch chiết chƣng ninh KOH MS este diisooctyl phtalat MS este dioctyl hexandioat Phổ đồ GC – MS dịch chiết soxhlet C2H5OH MS este etyl palmitat MS axit stearic Trang 10 10 11 13 13 16 17 19 24 24 26 26 27 27 28 28 29 29 30 30 35 36 37 37 38 39 40 ... Liên, huyện Hoà Vang, thành phố Đà Nẵng? ?? Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần axit hữu sống đời Từ đóng góp vào nguồn thơng tin, tƣ liệu khoa học cấy sống đời, tạo sở khoa... có sống đời Để góp phần vào nguồn tƣ liệu lồi sống đời nhƣ phát triển tác dụng chữa bệnh tuyệt vời nó, tơi lựa chọn đề tài ? ?Nghiên cứu xác định axit hữu sống đời (Kalanchoe pinnata) xã Hoà Liên,. .. phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng: sống đời hái xã Hòa Liên, huyện Hòa Vang, TP Đà Nẵng - Phạm vi nghiên cứu: + Xác định số số nhƣ độ ẩm, hàm lƣợng tro tƣơi + So sánh, xác định tổng lƣợng axit chiết