Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 250 SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Phạm Thanh Hương 1 , Nguyễn Thiện Nam 2 , Từ Thanh Dung 2 và Nguyễn Anh Tuấn 2 ABSTRACT All isolates were screened against 16 antimicrobial agents by disk diffusion method and were also tested for determination of minimal inhibitory concentration (MIC) of 64 isolates (43 E. ictaluri isolates and 21 A. hydrophila isolates) to 5 antibiotics with broth dilution method. The results showed that majority of E. ictaluri isolates susceptibility to beta-lactam antimicrobial group such as ampicillin, amoxicillin and cefalexin. Highly resistance was detected to streptomycin (84.1%), chloramphenicol (74.5%), enrofloxacin (74.5%). E. ictaluri isolates showed fully resistance to flumequin, trimethoprim+sulfamethoxazol. Whereas, A. hydrophila were highly susceptive with fenicol, tetracyclines, quinolones antimicrobial groups, Highly resistance to streptomycin (55.7%) and trimethoprim + sulfamethoxazol (32.8%). Remarkably, in this study detected 96% and 23% A. hydrophila isolates had multi-resistance. The lowest MIC values of E. ictaluri isolates was ampicillin (MIC 90 = 48.5 µg/mL) and A. hydrophila was enrofloxacin (MIC 90 = 6.1 µg/mL). The confugation experiments showed that E. ictaluri isolates can transfer of antimicrobial resistant genes to E. coli RC85. Likely, transconjugants (Ei-R) can transfer this genes to A. hydrophila isolates. Both E. ictaluri isolates and transconjugants (Ei-R) also were extracted plasmid. Keywords: antimicrobial susceptibility testing, conjugation, resistance plasmid Title: Study on antimicrobial resistance of Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila isolates caused diseases on striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in the Mekong River Delta TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành làm kháng sinh đồ với 16 loại kháng sinh và xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 64 chủng vi khuẩn (43 chủng E. ictaluri 1 Chi cục Thủy sản Cần Thơ 2 Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 251 và 21 chủng A. hydrophila) trên với 5 loại kháng sinh bằng phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng. Kết quả cho thấy đa số vi khuẩn E. ictaluri nhạy cao với kháng sinh: ampicillin, amoxicillin và cefalexin, trong khi đó kháng cao với kháng sinh: streptomycin (84,1%), enrofloxacin (74,5%) và chloramphenicol (74,5%). Kháng hoàn toàn với flumequin, trimethoprim +sulfamethoxazol. Ngược lại, vi khuẩn A. hydrophila nhạy cao với nhóm fenicol, tetracyclines, quinolones, kháng cao với kháng sinh streptomycin (55,7%) và trimethoprim+sulfamethoxazol (32,8%). Nghiên cứu phát hiện có 96% chủng vi khuẩn E. ictaluri và 23% chủng vi khuẩn A. hydrophila biểu hiện sự đa kháng. Kết quả xác định giá trị MIC đối với vi khuẩn E. ictaluri thì ampicillin cho giá trị MIC thấp nhất (MIC 90 = 48,5 µg/mL), đối với vi khuẩn A. hydrophila thì enrofloxacin có giá trị MIC thấp nhất (MIC 90 = 6,1 µg/mL). Thí nghiệm tiếp hợp, vi khuẩn E. ictaluri có khả năng truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn E.coli, cũng như vi khuẩn sau khi tiếp hợp (transconjugants) Ei-R có khả năng chuyển gen kháng thuốc này sang vi khuẩn A. hydrophila. Nghiên cứu bước đầu ly trích plasmid của các chủng vi khuẩn E. ictaluri và chủng lai Ei-R kháng thuốc từ thí nghiệm tiếp hợp. Từ khóa: Kháng thuốc kháng sinh, tiếp hợp vi khuẩn, plasmid kháng kháng sinh. 1 GIỚI THIỆU Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nước ngọt được nuôi phổ biến nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Cá tra có giá trị xuất khẩu cao nên trong những năm gần đây nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL phát triển rất mạnh đã đưa năng suất nuôi tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, để đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, người nuôi không ngừng thâm canh hóa, do đó vấn đề dịch bệnh trên cá tra xảy ra thường xuyên hơn và thiệt hại nhiều hơn. Trong số các bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL phổ biến và gây thiệt hại nhiều nhất là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Dung et al., 2004). Hiện nay người nuôi cá sử dụng thuốc kháng sinh một cách phổ biến để phòng trị bệnh vi khuẩn trong nuôi thủy sản ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới (Dung et al., 2008; Cabello, 2006). Do người nuôi thủy sản sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách và không đúng quy định nên gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Vì thế, các nhà khoa học đã nghiên cứu tìm thấy sự kháng thuốc kháng sinh trên nhiều loài vi khuẩn gây bệnh trên tôm, cá (Sarter et al., 2007; Akinbowale et al., 2007). Sự kháng thuốc kháng sinh gián tiếp trong vi sinh vật có thể được hình thành thông qua các gen trên nhiễm sắc thể hoặc thông qua plasmid, cấu trúc tự sao chép mang gen trong tế bào chất (Prescott et al., 2000). Trong đó, sự kháng thuốc kháng sinh thông qua plasmid là rất nguy hiểm, bởi vì các loài vi khuẩn kháng thuốc có thể truyền các gen Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 252 kháng thuốc không chỉ trong cùng 1 loài mà cả các loài vi khuẩn khác, ngay cả vi khuẩn gây bệnh cho người và các động vật trên cạn (Aoki, 1988). Chính vì thế, việc phát hiện các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh là rất cấp thiết, nhằm cung cấp thông tin cho việc sử dụng thuốc kháng sinh có hiệu quả và đảm bảo an toàn sức khỏe của con người. 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Chủng vi khuẩn Nghiên cứu được thực hiện trên 126 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ và 61 chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila từ cá tra bị bệnh xuất huyết ở các tỉnh ĐBSCL từ năm 2008 – 2009 (Bảng 1). Tất cả các chủng vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993) dựa trên dòng chuẩn E. ictaluri (CCUG 18764), thông qua các các chỉ tiêu cơ bản (nhuộm gram, oxidase, catalase, O/F) và bộ kít API 20E. Bảng 1: Địa điểm thu mẫu và số lượng chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila Tỉnh thu mẫu Năm E. ictaluri A. hydrophila Cần Thơ 2008 - 2009 51 20 Trà Vinh 2008 - 2009 17 7 An Giang 2008 - 2009 8 6 Bến Tre 2009 15 3 Vĩnh Long 2009 20 14 Đồng Tháp 2009 10 9 Sóc Trăng 2009 5 2 Tổng số chủng vi khuẩn 126 61 2.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ Phương pháp làm kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn: The Clinical và Laboratory Standards Institute (CLSI) của Anonymous (2006), sử dụng môi trường Mueller-Hinton Agar (MHA, Merck, Darmstadt, Germany), với 16 loại kháng sinh: ampicillin (AM/10 µg), amoxcillin (AMX/25 μg), cefalexin (CN/30 μg), florfenicol (FFC/30 µg), chloramphenicol (CHL/30 µg), streptomycin (SM/10 µg), gentamicin (GM/30 µg), tetracycline (TE/30 µg), doxycycline (DO/30 μg), enrofloxacin (ENR/5 μg), norfloxacin (NOR/5 μg), ciprofloxacin (CIP/5 μg), flumequin (FM/30 µg), trimethoprim + Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 253 sulfamethoxazol (SXT/1,25/23,75 µg), rifampin (RA/30 μg), colistin (CS/50 μg) (Bio-rad, Marnes-la-Coquettle, France). 2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration – MIC) xác định bằng phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trong môi trường lỏng, theo tiêu chuẩn của Clinical và Laboratory Standards Institute, 2006 (CLSI M49-A) với 5 loại kháng sinh có tính kháng và nhạy cao, đại diện cho các nhóm kháng sinh trong nghiên cứu này: ampicillin, chloramphenicol, enrofloxacin, oxytetracycline, streptomycin. Dòng vi khuẩn chuẩn E. coli ATCC 25922 được sử dụng như chủng đối chứng trong phương pháp này. Thí nghiệm thực hiện trên 43 chủng vi khuẩn E. ictaluri và 21 chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila đã được lập kháng sinh đồ ở trên. 2.4 Phương pháp xác định khả năng tiếp hợp của vi khuẩn Khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp của Sorum et al., (2003). Các dòng vi khuẩn mang gen kháng tetracycline (vi khuẩn cho gen kháng thuốc) được trộn với dòng vi khuẩn E. coli RC85 (vi khuẩn nhận gen kháng thuốc) nhạy với kháng sinh tetracycline với thể tích bằng nhau trong môi trường Luria-Bertani (LB) lắc ở nhiệt độ 37 o C trong thời gian thích hợp. Sau đó cho hỗn hợp vi khuẩn lên đĩa MHA có pha kháng sinh tetracycline (16 µg/ml) và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37 o C. Tần số chuyển gen kháng thuốc được đánh giá dựa trên mật độ của vi khuẩn cho gen kháng thuốc và mật độ của vi khuẩn E. coli sau khi đã tiếp hợp (thu được trên đĩa MHA có kháng sinh). 2.5 Phương pháp ly trích plasmid của vi khuẩn Plasmid của các chủng vi khuẩn được ly trích bằng bộ ly trích plasmid của Promega - TB225 (Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System). Điện di plasmid bằng gel agarose 0,7%, ở dòng điện 140V, trong 3 giờ. Gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (2 mg/ml) và chụp ảnh gel dưới ánh sáng UV 254 nm. Đọc kích thước phân tử của plasmid thông qua markers chuẩn 15 kb (Biorad). 3 KẾT QUẢ 3.1 Kết quả kháng sinh đồ Kiểm tra kháng sinh đồ được thực hiện trên 126 chủng vi khuẩn E. ictaluri, cho thấy các chủng vi khuẩn E. ictaluri đã giảm tính nhạy đối với 3 kháng sinh nhóm beta-lactam: ampicillin, amoxicillin và cefalexin. Kháng cao với các loại kháng sinh như: streptomycin, enrofloxacin, chloramphenicol, florfenicol, tetracycline và doxycycline. Đặc biệt, các chủng vi khuẩn này đã kháng hoàn toàn với flumequin, trimethoprim+sulfamethoxazol. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 254 Bảng 2: Tỉ lệ phần trăm chủng vi khuẩn kháng, nhạy và nhạy trung bình (TB) Nhạy (%) Nhạy TB (%) Kháng (%) TT Thuốc kháng sinh E ictaluri A.hydrophila E.ictaluri A. hydrophila E.ictaluri A.hydrophila Beta-lactam 1 Ampicillin 85,7 0 7,94 0 6,35 100 2 Amoxicillin 84,1 0 11,1 0 4,76 100 3 Cefalexin 86,5 0 11,1 1,64 2,38 98,4 Fenicol 4 Florfenicol 19,1 91,8 7,94 3,28 73 4,92 5 Chloramfenicol 14,3 91,8 10,3 4,92 75,4 3,28 Aminoglycosides 6 Streptomycin 9,5 8,2 6,35 36,1 84,1 55,7 7 Gentamicin 37,3 96,72 15,9 3,28 37,3 0 Tetracyclines 8 Tetracycline 19,8 75,4 11,1 9,84 69,1 14,6 9 Doxycycline 23 86,6 10,3 13,1 66,7 3,28 Quinolones 10 Enrofloxacin 9,52 96,7 15,1 3,28 75,4 0 11 Norfloxacin 38,1 90,1 27,8 8,2 34,1 1,64 12 Ciprofloxacin 44,4 88,5 19,1 6,56 36,5 4,92 13 Flumequin 0 80,3 0 14,8 100 4,9 Khác 14 Trimethoprim+ sulfamethoxazol 0 63,9 0 3,28 100 32,8 15 Rifampin 15,1 52,5 31 36,1 54 11,9 16 Colistin 0 1,64 5,56 72,1 94,4 26,2 Kết quả kháng sinh đồ của 61 chủng vi khuẩn A. hydrophila trong nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn A. hydrophila nhạy cao với các sinh trong nhóm fenicol, tetracyclines, quinolones, kháng cao với kháng sinh streptomycin và trimethoprim+sulfamethoxazol. Điểm nổi bật của các chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trong nghiên cứu này là hiện tượng đa kháng kháng sinh (vi khuẩn kháng ít nhất là 3 kháng sinh). Với 15 loại thuốc kháng sinh (colistin kháng tự nhiên với vi khuẩn E. ictaluri nên không tính colistin vào kiểu hình đa kháng của vi khuẩn E. Ictaluri) vi khuẩn E. ictaluri có kiểu đa kháng vớ i 10 loại thuốc kháng sinh chiếm tỷ lệ cao nhất (23,8%). Đối với vi khuẩn A. hydrophila có kiểu đa kháng với 3 loại thuốc kháng sinh chiếm tỷ lệ cao nhất (13,1%). Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 255 Hình 1: Tỷ lệ phần trăm chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila đa kháng kháng sinh 3.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu Tương tự như kết quả thực hiện kháng sinh đồ: 41 chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng với streptomycin chiếm tỷ lệ cao nhất (95,3%) với giá trị MIC 50 và MIC 90 cao ≥ 256 µg/mL. Tiếp theo là thuốc chloramphenicol và enrofloxacin có cùng số chủng kháng là 37 chủng (86,1%) nhưng giá trị MIC của chúng khác nhau, chloramfenicol có giá trị MIC 50 = 52,8 (µg/mL) và MIC 90 = 196,7 (µg/mL) cao hơn giá trị MIC của enrofloxacin là MIC 50 = 5,8 (µg/mL) và MIC 90 = 48,5 (µg/mL) và thấp nhất là ampicillin với 11 chủng kháng (25,6%). Bảng 3: Giá trị MIC của 5 loại thuốc kháng sinh đối với 43 chủng vi khuẩn E. ictaluri Giá trị MIC (µg/mL) và số chủng vi khuẩn Thuốc Kháng sinh <0,5 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 >256 Chủng kháng (%) MIC 50% MIC 90% AM 2 0 8 6 3 5 8 5 2 3 0 1 11 (25,6) 5,85 48,5 CHL 0 0 1 2 2 0 1 5 21 2 6 3 37 (86,1) 52,8 196,7 ENR 0 0 0 4 7 5 5 11 3 4 4 0 37 (86,1) 18,9 98,9 OXY 1 0 4 5 4 0 1 9 9 4 2 4 29 (67,4) 25,4 192,5 SM 0 0 0 0 0 1 2 0 0 2 0 38 41 (95,3) >256 >256 Theo tiêu chuẩn CLSI 2006, các chủng in đậm thể hiện tính kháng đáp ứng Giá trị MIC của các chủng vi khuẩn A. hydrophila với streptomycin là 64 (µg/mL), oxytetracycline có MIC 50 = 5,1 (µg/mL) và MIC 90 = 48 (µg/mL); chloramfenicol với MIC 50 = 4,9 (µg/mL) và MIC 90 = 12,7 (µg/mL). Thấp nhất E. ictaluri A. hydrophila Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 256 là enrofloxacin với giá trị MIC 50 và MIC 90 lần lượt là 1,28 (µg/mL) và 6,1 (µg/mL). Bảng 4: Giá trị MIC của 4 loại thuốc kháng sinh đối với 21 chủng vi khuẩn A. hydrophila Giá trị MIC (µg/mL) và số chủng vi khuẩn Thuốc kháng sinh <0,5 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 >256 Chủng kháng (%) MIC 50% MIC 90% CHL 0 0 0 3 6 7 3 0 1 0 1 0 5 (23,8) 4,95 12,7 ENR 2 4 3 6 1 4 1 0 0 0 0 0 6 (28,6) 1,28 6,1 OXY 1 0 0 4 5 4 2 1 3 1 0 0 5 (23,8) 5,1 48 SM 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 5 (100) 64 64 Theo tiêu chuẩn CLSI 2006, các chủng in đậm thể hiện tính kháng đáp ứng 3.3 Kết quả tiếp hợp vi khuẩn Kết quả tiếp hợp 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri và vi khuẩn E. coli RC85 cho thấy vi khuẩn E. ictaluri có khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc với tần số tiếp hợp dao động từ 1,61x10 -6 - 2,45x10 -3 , trung bình là 6,87± 9,79x10 - 4 . Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn Ei-R đều kháng 4 thuốc kháng sinh: tetracycline, streptomycin, trimethoprim+sulfamethoxazol và chloramphenicol giống như vi khuẩn E. ictaluri. Riêng đối với kháng sinh flumequin thì có 8 chủng Ei-R cho kết quả nhạy trung bình với kháng sinh này, dù 8 chủng E. ictaluri tiếp hợp với chúng có tính kháng với flumequin. Kết quả tiếp hợp của 5 chủng vi khuẩn Ei-R với vi khuẩn A. hydrophila thì có 4 vi khuẩn Ei-R tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn A. hydrophila. Tần số tiếp hợp trung bình trong thí nghiệm này là 5,71±7,1x10 -6 . Kiểu đa kháng thuốc của 4 chủng vi khuẩn sau khi tiếp hợp Ae-R kháng với tetracycline, streptomycin, flumequin, trimethoprim+sulfamethoxazol và chloramphenicol giống hoàn toàn với 4 chủng vi khuẩn Ei-R đã tiếp hợp với chúng. 3.4 Kết quả tách chiết plasmid Plasmid của vi khuẩn được chạy điện di trên gel agarose 0,7%, nguồn điện 140V, kết quả chạy điện di được quan sát dưới tia UV cho kết quả như Hình 2. Kết quả chạy điện di 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri có xuất hiện 2 vạch plasmid giống nhau trong khoảng 2-4 kb. Đối với 3 chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng tetracycline đều có xuất hiện 2 vạch plasmid gần nhau và có kích thước trong khoảng 63-147 kb (giếng 6,7,8). Riêng chủng vi khuẩn nhạy với tetracycline (kí hiệu E72, giếng 9) không có xuất hiện 2 vạch plasmid này. Các chủng vi khuẩn E. coli RC85 trước khi tiếp hợp và các chủng vi khuẩn Ei-R chỉ xuất hiện 1 vạch plasmid giống nhau, tương đương 15 kb. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 257 Hình 2: Kết quả điện di các mẫu plasmid Giếng 1: vi khuẩn E. coli 39R861. Giếng 2: vi khuẩn E. coli RC85 trước khi tiếp hợp. Giếng 3-5: vi khuẩn Ei-R sau khi tiếp hợp. Giếng 6-8: vi khuẩn E. ictaluri kháng tetracycline. Giếng 9: vi khuẩn E. ictaluri nhạy tetracycline. Giếng 10: thang marker chuẩn 15 kb. 4 THẢO LUẬN Cùng với sự phát triển của nghề nuôi cá da trơn công nghiệp trong những năm qua, thì bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá da trơn ngày càng phổ biến và gây thiệt hại đáng kể, đặc biệt là các nhóm vi khuẩn gây bệnh gram âm. Vì thế, người nuôi thủy sản sử dụng thuốc kháng sinh một cách tràn lan, không kiểm soát được để phòng trị bệnh thủy sản. Kết quả cho thấy sự kháng thuốc của các chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi thủy sản ngày càng phổ biến, nguy hiểm hơn là có sự truyền gen kháng thuốc từ vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản sang vi khuẩn khác trong môi trường đất, nước, và cả các chủng vi khuẩn gây bệnh ở người, gây ra tác động động xấu cho môi trường và sức khỏe của cộng đồng. Với kết quả của nghiên cứu này, dễ nhận thấy nhóm beta-lactam nhạy cao (>84%) với vi khuẩ n E. ictaluri, nhưng kháng hoàn toàn (ampicillin, amxocillin) và kháng cao (cefaxin) với vi khuẩn A. hydrophila. Vi khuẩn E. ictaluri trong nghiên cứu này có tính nhạy cao với nhóm thuốc beta-lactam do chúng không có khả năng tiết ra enzyme β-lactamase làm vỡ vòng β-lactam (Stock và Wiedemann, 2001). Tuy nhiên, trong số 126 mẫu vi khuẩn E. ictaluri của nghiên cứu này có một tỷ lệ nhỏ (< 7%) số chủng kháng với nhóm beta- Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 258 lactam. Đây cũng là vấn đề cần phải lưu ý, vì hiện nay theo nghiên cứu này vi khuẩn E. ictaluri đã kháng cao với nhiều loại thuốc kháng sinh khác, ngoại trừ nhóm beta-lactam. Ở Việt Nam, thuốc kháng sinh chloramphenicol hiện đang bị nghiêm cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy sản, do thuốc này có độc tính rất mạnh là nguyên nhân gây ra hiện tượng thoái hóa tủy xương (Dowling, 2006). Một điểm đáng chú ý từ kết quả làm kháng sinh đồ trong nghiên cứu này là có trên 70% số chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng với nhóm fenicol. So với các nghiên cứu trước đây cho thấy nhóm thuốc fenicol nhạy cao với vi khuẩn Edwardsiella spp. (Depaola et al., 1995; Shu-Peng et al., 2000) Đối với các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập tại Việt Nam từ những năm trước đây, cũng cho kết quả nhạy cao với florfenicol (Crumlish et al., 2002; Dung et al., 2004). Nguyên nhân, vi khuẩn tăng tính kháng nhanh với các thuốc kháng sinh nhóm fenicol do vi khuẩn đề kháng thông qua nhiều cơ chế khác nhau như: vi khuẩn có khả năng đào thải thuốc kháng sinh ra khỏi tế bào thông qua kênh protein (efflux protein) có trên thành tế bào vi khuẩn; mã hóa gen liên quan đến integron (Arcangioli et al., 1999; Cloeckaert et al., 2000) và thông qua plasmid (Keys et al., 2000). (Trích dẫn bởi Miranda và Zemelan, 2002). Vì thế, cần phải thận trọng khi sử dụng thuốc này để điều trị bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản. Tương tự, nhóm kháng sinh tetracyclines trong nghiên cứu này kháng cao đối với vi khuẩn E. ictaluri do cơ chế kháng đáp ứng đối với nhóm thuốc tetracyclines, khi thuốc này được sử dụng qua thời gian dài trị bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra sẽ tạo ra các chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng tetracycline. Nhiều nhà khoa học cho rằng các chủng vi khuẩn kháng cao với nhóm thuốc tetracyclines liên quan đến việc sử dụng thuốc kháng sinh này quá rộng rãi và phổ biến trong nuôi trồng thủy sản, chúng có khả năng truyền gen kháng thuốc này sang vi khuẩn khác thông qua R-plasmid (Reimschuessel và Miller 2006; Alderman và Hasting, 1998; Depaola et al., 1988). Đối với nhóm quinolones trong nghiên cứu này, vi khuẩn E. ictaluri kháng cao với 2 loại thuốc flumequin (100%) và enrofloxacin (75,4%). Trong khi đó, nghiên cứu của Stock và Wiedemann (2001) và Dung et al., (2008) xác định vi khuẩn E. ictaluri nhạy với các thuốc kháng sinh thuộc nhóm quinolones. Ngoài ra nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2010) chỉ xác định có 8% chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng flumequin với MIC 90% khá thấp (4 µg/mL) và enrofloxacin cũng rất thấp (5%). Ngoài ra, vi khuẩn E. ictaluri trong nghiên cứu này giảm tính nhạy đối với norfloxacin (34,1%) và ciprofloxacin (36,5%), Cần lưu ý rằng ở Việt Nam, thuốc norfloxacin và ciprofloxacin là hai loại kháng sinh nằm trong danh mục hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Do đó, việc dùng thuốc kháng sinh này trong thủy sản phải hết sức cẩn trọng và cần được kiểm soát chặt chẽ bởi các cơ quan có thẩm quyền về thuốc và thực phẩm nhằm đảm bảo an toàn cho sức khỏe của cộng đồng. Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ 259 Đặc biệt, nhóm thuốc aminoglycosides trong nghiên cứu này gồm streptomycin và gentamicin. Trong đó, streptomycin cho kết quả kháng cao với cả vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila, nhưng gentamcin chỉ giảm tính nhạy với vi khuẩn E. ictaluri và nhạy cao với vi khuẩn A. hydrophila. Theo Prescott et al., (2000) và Tolmasky (2000) vi khuẩn lờn với một kháng sinh trong nhóm aminoglycosides này, nhưng có thể nhạy cảm với một thuốc kháng sinh khác cùng nhóm aminoglycosides. Vi khuẩn kháng nhanh với thuốc streptomycin do thông qua trung gian các plasmid, nhưng vi khuẩn lờn gentamicin chậm do có liên quan đến đột biến nhiễm sắc thể. Nghiên cứu đã phát hiện có đến 96% chủng vi khuẩn E. ictaluri thể hiện sự đa kháng với kiểu hình đa kháng với 10 loại kháng sinh là cao nhất (23,8%). So với nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam (2010) phát hiện có đến 97,5% số chủng E. ictaluri đa kháng thuốc và kiểu hình kháng với 8 loại kháng sinh chiếm cao nhất. Tuy nhiên nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2010) xác định chỉ có 73% chủng vi khuẩn E. ictaluri là biểu hiện đa kháng. Ngoài ra nghiên cứu còn ghi nhận có 23% ch ủng vi khuẩn A. hydrophila biểu hiện đa kháng. Từ những kết quả trên, có thể khẳng định rằng, hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp hơn, nhất là sự đa kháng ngày càng tăng về số chủng và số lượng thuốc kháng sinh. Hiện tượng kháng thuốc càng trở nên nghiêm trọng hơn, khi trong môi trường nuôi thủy sản có sự kháng thuốc hình thành gián tiếp thông qua thể R-plasmid. Các R-plasmid này có thể làm trung gian giúp vi khuẩn kháng một hay nhiều loại thuốc kháng sinh (Aoki và Takahashi, 1987; Aoki, 1988; Kruse và Sorum, 1994). Plasmid của 3 chủng vi khuẩn E. ictauri kháng với tetracycline trong nghiên cứu này đều xuất hiện 2 vạch plasmid có kích thước trong khoảng 63- 147 kb. 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết quả kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn E. ictaluri nhạy cao (> 84%) với nhóm beta-lactam và kháng cao với các kháng sinh còn lại. Vi khuẩn A. hydrophila nhạy cao (>75%) với nhóm fenicol, tetracyclines và quinolones, kháng cao với streptomycin (55,7%) và trimethoprim + sulfamethoxazol (32,8%). Đặc biệt nghiên cứu phát hiện có 96% chủng vi khuẩn E. ictaluri và 23% chủng vi khuẩn A. hydrophila biểu hiện sự đa kháng. Vi khuẩn E. ictaluri có khả truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn E. coli RC85 với tần suất tiếp hợ p là: 6,87±9,79x10 -4 . Đặc biệt, vi khuẩn Ei-R có khả năng truyền gen kháng thuốc này sang vi khuẩn A. hydrophila với tần suất tiếp hợp trung bình là 5,71±7,1x10 -6 . Bước đầu xác định được plasmid của vi khuẩn E. ictaluri kháng thuốc có kích thước trong khoảng 63-147 kb. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng gia tăng. Chính vì thế, đòi hỏi người nuôi phải thận trọng, tuân thủ đúng quy định trong [...]... Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy, 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 137-142 Từ Thanh Dung, Freddy Haesebrouck, Nguyễn Anh Tuấn, Partrick Sorgeloos, Margo Baele và Annemie Decostere, 2010 Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan, thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng bằng. .. freshwater Chilean salmon farms The Science of the Total Environment 293: 207-218 Nguyễn Thiện Nam, Phạm Thanh Hương, Trần Duy Phương, Từ Thanh Dung, 2010 Nghiên cứu sự đa kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ 2010: 14b 200-210 Prescott, J.F., J.D Baggot and R.D Walker, 2000 Antimicrobial therapy in veterinary medicine... Pangasius hypophthalmus cultured in the Mekong Delta Vietnam Journal of fish disease 25: 733-736 Depaola, A., A.F Pauline, R.M McPhearson and S.B Levy, 1988 Phenotypic and genotypic characterization of tetracycline and oxytetraxycline resistance Aeromonas hydrophila from cultured channel catfish (Ictalurus punctatus) and their environments Applied and Environmental Microbiology 40: 18611863 Depaola, A.,... khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ vi c sử dụng, nhà khoa học cần có những nghiên cứu sâu, rộng hơn từ đó đề ra những biện pháp khắc phục hiệu quả, nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người TÀI LIỆU THAM KHẢO Akinbowale, L.O, H Peng and D.M Barton, 2007 Antimicrobial resistance in bacteria isolated from aquaculture sources in Australia Journal of Applied Microbiology 103: 1364-5072 Alderman,... human and animal heath Kruse, H and H Sorum, 1994 Transfer of multiple drug resistance plasmids between bacterial of diverse origin in natrual microenvironments Applied and Environment Microbiology 60: 4015-4021 Miranda, C.D and R Zemelman, 2002 Antimicrobial multiresistance in bacteria isolated from freshwater Chilean salmon farms The Science of the Total Environment 293: 207-218 Nguyễn Thiện Nam, Phạm... antibiotic resistance - potential for consumer health risks International Journal of Food Science and Technology 33: 139-155 Aoki, T and A Takahashi, 1987 Class D tetracycline resistance determinants of R-plasmids from fish pathogens Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda and Pasteurella piscisida Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31: 12701280 Aoki, T., 1988 Drug-resistance plasmids from fish pathogens... susceptibility of Edwardsiella tarda, E ictaluri and E hoshinae Antimicrobial Agents Chemotherapy 45: 2245-2255 Sorum, H., T.M L’Abee-Lund, A Solberg, and W Anette, 2003 IntegronContaining IncU R plasmids pRAS1 and pAr-32 from the fish pathogen Aeromonas salmonicida Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47: 1281290 Tolmasky, M.E., 2000 Bacterial resistance to aminoglycosisedes and betalactames: The Tn1331 transposon... for environment Environment of Microbiology 8: 1137-1144 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006 Methods for broth dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals; informational supplement, M49-A, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, NJ Crumlish, M., T.T Dung, J.F Turnbull, N.T.N Ngoc, and H.W Fugerson, 2002 Identification of Edwardsiella ictaluri. .. Publishing Ltd, Oxford 241-248 Dung, T.T., F Heasebrouck, N.A Tuan, P Sorgeloos, M Baele and A Decostere, 2008 Antimicrobial susceptibility pattenrn of Edwardsiella ictaluri isolates from natural outbreaks of Bacillary Necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam Microbial Drug Resistance 14: 311-316 260 Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ European Medicines Agency... Sorgeloos, Margo Baele và Annemie Decostere, 2010 Hiện trạng kháng thuốc kháng sinh trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan, thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng bằng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ 15A: 162-171 261 . 250 SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU. số các bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL phổ biến và gây thiệt hại nhiều nhất là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh xuất huyết do vi