TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TÔ VŨ AN TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TÔ VŨ AN TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ MAU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.s TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2008 MỤC LỤC Phần I: Giới thiệu 1 Mục tiêu của đề tài 2 Nội dung nghiên cứu 2 Phần II: Tổng quan tài liệu 3 2.1 Tình hình nuôi tôm biển 3 2.1.1Trên thế giới 3 2.1.2 Việt Nam 4 2.1.3 Đồng bằng sông Cửu Long 4 2.1.4 Cà Mau 5 2.2 Tình hình dịch bệnh trong nuôi tôm 6 2.2.1 Trên thế giới 6 2.2.2 Trong nước và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long 6 2.3 Ảnh hưởng của bệnh đốm trắng đến nghề nuôi tôm 7 2.4 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh đốm trắng 8 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 8 2.4.2 Triệu chứng…… 8 2.4.3 Phương thức lây truyền và loài cảm nhiễm 8 2.4.4 Chẩn đoán…………………………… 9 24.5 Phòng ngừa và xử lý bệnh 9 2.4 Một số nghiên cứu bệnh đốm trắng 10 2.6 Kỹ thuật PCR và các ứng dụng 14 2.6.1 Quy trình 14 2.6.2 Những ứng dụng của PCR 15 2.6.3 Hạn chế 15 Phần III: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu 17 3.2.1 Mẫu vật 17 3.2.2 Dụng cụ 17 3.2.2.1 Dụng cụ thu mẫu 17 3.2.2.2 Dụng cụ phân tích PCR 17 3.2.3 Hóa chất 17 3.2.3.1 Phân tích PCR 17 3.4 Phương pháp Nested-PCR 17 3.4.1 Qui trình ly trích DNA 18 3.4.2 Qui trình khuếch đại 18 3.4.3 Cách chuẩn bị phản ứng 18 3.4.4 Chạy điện di 18 3.4.5 Đọc kết quả 19 3.5 PCR-genotyping 19 3.5.1 PCR-Genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 19 3.5.1.1 Điều kiện phản ứng 19 3.5.1.2 Thành phần hóa chất tham gia phản ứng PCR-genotyping 19 3.5.1.3 Đọc kết quả 20 3.5.2 PCR-Genotyping khuếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 21 3.5.2.1 Điều kiện phản ứng 21 3.5.2.2 Thành phần hoá chất tham gia phản ứng PCR-genotyping 21 3.5.2.3 Đọc kết quả 22 Phần IV: Kết quả và thảo luận 23 4.1 Kết quả xác định sự hiện diện của WSSV trong các mẫu tôm 23 4.2 Kết quả phân tích PCR-genotyping 27 4.2.1 Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94. 27 4.2.1.1 Phản ứng PCR-genotyping (ORF94) thực hiện theo qui trình của Trần Thị Mỹ Duyên, (2006) 27 4.2.1.2 Kết quả phân tích các mẫu WSSV thu tại Cà Mau (PCR-genotyping-ORF94) 29 4.2.2 Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 32 4.2.3 Mối liên hệ giữa số vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 35 Phần V: Kết luận và đề xuất 37 5.1 Kết Luận 37 5.2 Đề xuất 37 Phần VI: Tài liệu tham khảo 38 Phần VII: Phụ lục 42 DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1: Thể hiện tỉ lệ cảm nhiễm WSSV 25 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu tôm trong các ao có dấu hiệu đốm trắng tại Cà Mau bằng gel 1% 25 Hình 4.3: Kết quả điện di kiểm tra 10 mẫu sau khi giảm thể tích 28 Hình 4.4: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên mẫu WSSV thu ở Cà Mau 30 Hình 4.5: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 trên mẫu thu ở Cà Mau 32 Hình 4.6: Kết quả điện di khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF125 trên mẫu WSSV thu ở Cà Mau 34 i DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR- genotyping (ORF94) 20 Bảng 3.2: Thành phần và nồng độ hoá chất thực hiện phản ứng PCR- genotyping (ORF125) 21 Bảng 4.1: Một vài thông tin về ao nuôi nhiễm WSSV trong các mẫu tôm tại Cà Mau 26 Bảng 4.2: Cường độ nhiễm của 10 mẫu kiểm tra 28 Bảng 4.3: Kết quả phân tích các nhóm vùng lặp lại thuộc ORF94 trong các ao tôm thu ở Cà Mau 29 Bảng 4.4: Kết qủa phân tích các nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125 trong các ao tôm thu tại Cà Mau 33 Bảng 4.5: Kết quả PCR-genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 35 ii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa đã tận tình chỉ dẫn trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Thủy Sản, các bạn lớp BHTS và NTTS K30 đã tận tình giúp đở trong suốt quá trình học tập và làm luận văn này. Xin cảm ơn cha, mẹ, chị, em là một chổ dựa vững chắc cho sự nghiệp và tương lai của bản thân. Tác giả Tô Vũ An TÓM TẮT Cà Mau là tỉnh có diện tích và sản lượng tôm nuôi cao nhất cả nước. Nhưng trong những năm gần đây thì tình hình dịch bệnh bùng phát ở nhiều nơi nó gây trở ngại đối với người nuôi tôm nhất là bệnh đốm trắng do tác nhân White Spot Syndrome Virus (WSSV). Theo những nghiên cứu gần đây cho thấy WSSV đã có nhiều biến đổi về mặt cấu trúc di truyền. Nghiên cứu được thực hiện để tìm hiểu về đặc điểm gen của virut gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi tại Cà Mau và khả năng ứng dụng của vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 trong nghiên cứu dịch tể học của Virut gây bệnh đốm trắng. Kết quả phân tích 60 mẫu tôm dương tính với WSSV của 12 ao trong tổng số 24 ao thu tại Cà Mau sử dụng phương pháp PCR- genotyping khuyếch đại vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 cho thấy có sự biến động về cấu trúc di truyền của WSSV trên tôm sú tại Cà Mau. Kết quả cho thấy số vùng lặp lại trên bộ gen của WSSV giữa các ao thì khác nhau. Trong cùng một ao nhiễm WSSV thì số vùng lặp lại thường giống nhau 9/12 ao đối với ORF94 và 10/12 ao đối với ORF125. Đối với ORF94 đã xác định được 7 nhóm vùng lặp lại (4 đến 10 vùng lặp lại) trong đó kiểu gen có 6, 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 24,6%. Còn ORF125 thì có 5 nhóm vùng lặp lại (từ 4 đến 8 vùng lặp lại) trong đó kiểu gen có 6 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất 47%. Sự khác biệt giữa các vùng lặp lại thuộc ORF94, và ORF125 trên bộ gen WSSV trong các ao tôm bệnh đốm trắng cho thấy đang tồn tại nhiều kiểu gen WSSV khác nhau có khả năng gây bệnh đốm trắng trên tôm. Kết quả nghiên cứu có thể ứng dụng trong nghiên cứu về sự lan truyền và phân bố WSSV, làm cơ sở cho việc phòng ngừa và kiểm soát sự bùng phát của bệnh đốm trắng do WSSV gây ra. 1 PHẦN I GIỚI THIỆU Cà Mau là tỉnh nằm ở tận cùng cực nam của tổ quốc có ba mặt giáp biển và hệ thống sông ngòi chằng chịt nên rất thuận lợi cho nghề nuôi trồng thủy sản phát triển. Từ những đầu thập niên 80 nghề nuôi trồng thủy sản ở Cà Mau (đặc biệt là nghề nuôi tôm sú) đã dần dần phát triển với hình thức nuôi quãng canh truyền thống nhưng năng suất nuôi thấp. Để tăng năng suất thì việc chuyển đổi từ hình thức nuôi quãng canh truyền thống sang bán thâm canh và thâm canh là rất cần thiết. Do hiệu quả kinh tế mà nghề nuôi tôm đem lại nên diện tích và sản lượng tôm nuôi ở Cà Mau không ngừng tăng trong những năm gần đây. Xuất khẩu thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của tỉnh và trong khu vực. Việc thâm canh hóa trong nuôi tôm sú không những tăng năng suất mà còn làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Theo thống kê của Bộ Thủy sản mỗi năm có hàng nghìn hecta ao nuôi tôm thương phẩm phải thu hoạch sớm do bệnh trong đó 80% là bệnh đốm trắng. Đây là bệnh nguy hiểm chúng có khả năng lây lan nhanh trong ao và gây thiệt hại lớn (có thể gây chết đến 100% sau 3 - 10 ngày nhiễm bệnh) mà còn có khả năng lây lan qua các khu vực lân cận qua nguồn nước hay các loài giáp xác. Nhưng mức độ gây hại của chúng rất khác nhau ở các vùng và các vụ trong năm (có những ao tôm bị nhiễm đốm trắng thì tôm chết rất nhanh nhưng cũng có ao nuôi bị nhiễm đốm trắng tôm vẫn phát triển bình thường đến khi thu hoạch). Vấn đề này cũng có nhiều giả thiết được đặt ra như: điều kiện môi trường, quản lý và chăm sóc sức khỏe tôm nuôi, tác nhân gây bệnh: sự biến đổi kiểu gen WSSV. Do vậy, Đề tài: "Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon) tại Cà Mau" được thực hiện. [...]...M c tiêu c a Tìm hi u v tài c i m gen c a virus gây b nh m tr ng trên tôm sú nuôi t i Cà Mau và kh năng ng d ng c a vùng l p l i thu c ORF94, ORF125 trong nghiên c u d ch t h c c a virus gây b nh m tr ng N i dung nghiên c u * Xác nh s hi n di n c a WSSV trong các m u tôm sú thu ư c t i Cà Mau b ng phương pháp Nested-PCR * Phân tích các dòng... nuôi tôm d ng sinh thái (Phùng Văn, 2005) Năm 2008, Cà Mau có di n tích nuôi tôm 249.000 ha, g m 35.000 ha r ng - tôm, 40.000 ha lúa - tôm, 1.000 ha tôm - vư n, 900 ha tôm công nghi p, còn l i là di n tích chuyên tôm d ng sinh thái (Nguy n Ti n Hưng, 2008) 2.2 Tình hình d ch b nh trong nuôi tôm 2.2.1 Trên th gi i Phong trào nuôi tr ng th y s n trên th gi i ngày càng phát tri n m nh m nh t là ngh nuôi tôm. .. ngàn hecta ao nuôi tôm thương ph m ph i thu ho ch s m do b nh trong ó 80% là b nh m tr ng Năm 2003 Sóc Trăng có 16.346 ha b thi t h i hoàn toàn chi m 40% di n tích, cu i năm 2004 di n tích tôm nuôi b m t tr ng là 18.231 ha 7 2.4 c i m c a tác nhân gây b nh m tr ng 2.4.1 Tác nhân gây b nh B nh m tr ng do virus gây h i ch ng (Penaeid) WSSV ư c tìm th y m tr ng WSSV gây ra trên tôm he nhóm tôm he và các loài... i trên các vùng l p l i c a WSSV ã tìm ra trư c 11 ây, bao g m ORF94, ORF125 và ORF75 tìm th y v i s l n l p l i t 2 i v i ORF94, có 13 ki u gen ư c n 16 Trong ó l p l i 7 l n chi m 11,3%, không có m u nào có s l n l p l i 11 l n ho c 15 l n ư c tìm th y i v i ORF125, có 11 ki u gen khác nhau ư c tìm th y v i s l n l p l i t 2 n 14 S l n l p l i ư c tìm th y nhi u nh t là 7 l n chi m 47,1%, không tìm. .. i thu c ORF94, ORF125 2 PH N II T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Tình hình nuôi tôm bi n 2.1.1 Trên th gi i Trên th gi i ngh nuôi tr ng th y s n c bi t là ngh nuôi tôm bi n ã xu t hi n r t lâu nhưng nuôi tôm công nghi p ch m i xu t hi n nh ng năm 30 c a th k XX ( Nguy n Văn H o, 2003) Nuôi tôm công nghi p cung c p hơn 1/3 s n lư ng tôm nuôi, nhưng di n tích ch chi m kho ng 5% t ng di n tích T ó, nuôi tôm công... virus gây b nh i vùng l p l i thu c ORF94 d ng phương pháp PCRxác nh s vùng l p l i c a m tr ng trên 130 m u tôm sú thu t i Sóc Trăng, Trà Vinh K t qu nghiên c u cho th y WSSV có 5, 7, 8, 9, 12 vùng l p l i thu c ORF94 trong ó ki u gen có 8 vùng l p l i chi m t l cao nh t trên 50% Tri u Thanh Tu n, (2006) cũng s d ng phương pháp PCR-genotyping khu ch ORF94 xác nh s vùng l p l i c a virus gây b nh tôm. .. (1992), Vi t Nam, Thái Lan (1994 - 1996), ài Loan, Philippines (1993), V i các tác nhân gây b nh ch y u là vi khu n, virus, ký sinh trùng, n m Nhưng b nh do virus gây tác h i nghiêm tr ng nh t như MBV (Monodon Baculovirus), WSSV (White Spot Syndrome Virus) , YHV (Yellow Head Virus) …D ch b nh ã làm gi m s n lư ng tôm trên th gi i t 733.000 t n năm 1994 còn 712.000 t n năm 1995, còn 693.000 t n 1996 n năm... ORF14/15, và k t qu này cho th y ORF75 và ORF125 có ý nghĩa quan tr ng trong vi c nghiên c u d ch t h c c a b nh m tr ng sau này Vi t Nam Tran Thi Tuyet Hoa et al., (2005) s d ng phương pháp PCR-genotyping khuy ch thu c ORF94 trên các m u tôm nuôi và tôm gi ng c u ã xác Vi t Nam K t qu nghiên nh ư c s vùng l p l i thu c ORF94 c a WSSV trên tôm gi ng t 4 n 8 và trên tôm nuôi là 4 chi m t i vùng l p l i n... m tr ng n ngh nuôi tôm Năm 1960 ã phát hi n virus gây b nh trên trên giáp xác, b nh do virut là tr ng i l n cho ngh nuôi tôm, n năm 1990 xác nh c bi t là b nh do virut m tr ng Năm 1992, các ao nuôi thâm canh ã g p tr ng i v b nh 80% s tr i b th t b i t i Indonesia Năm 1994, b nh và làm t n th t l n Indonesia, n , n ngh nuôi tôm công nghi p ài Loan Năm 1996 m tr ng có hơn m tr ng gây t l ch t cao Trung... nhóm tôm he và các loài giáp xác khác: tôm nư c ng t, cua, tôm hùm, chân chèo và u trùng côn trùng B nh ư c báo cáo u tiên Nh t B n vào năm 1993 trên tôm nh p t Trung Qu c v nuôi (Tr n Th Tuy t Hoa, 2004) Trư c năm 2002, có 3 ch ng Baculovirus gây b nh m tr ng ho c còn g i là virus Trung Qu c Tuỳ t ng nư c nghiên c u chúng có tên g i và kích thư c khác nhau n h i ngh virus h c qu c t l n th 12 (Paris, . TÔ VŨ AN TÌM HIỂU SỰ BIẾN ĐỔI CỦA VÙNG LẶP LẠI THUỘC ORF94, ORF125 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) TẠI CÀ. khỏe tôm nuôi, tác nhân gây bệnh: sự biến đổi kiểu gen WSSV. Do vậy, Đề tài: " ;Tìm hiểu sự biến đổi của vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây