TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN CHƯNG THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TRẦN THỊ TUYẾT HOA 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com i LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần Thơ đã tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội học tập thêm những kiến thức thực tế. Chân thành cảm ơn anh Mai Nam Hưng (lớp cao học khoá 14) đã nhiệt tình hỗ trợ cung cấp mẫu tôm thu ở Cà Mau năm 2008. Xin cám ơn tập thể các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy Sản. Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và em gái đã động viên trong suốt thời gian làm luận văn cũng như trong khoảng thời gian học Đại học. Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức khỏe và thành công trong cuộc sống. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ii TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm hiểu sự khác nhau về kiểu gen của WSSV ở hai thời điểm và hai khu vực khác nhau bằng phương pháp PCR - Genotyping (ORF94 và ORF125). Kết quả cho thấy có sự khác nhau về kiểu gen của WSSV ở năm 2006 và năm 2008 và cả ở 2 khu vực Cà Mau và Bạc Liêu khi phân tích 231 mẫu ở 23 ao, thuộc 2 đợt thả giống liên tiếp trong cùng một ao nuôi ở mô hình quãng canh cải tiến (QCCT) thuộc tỉnh Cà Mau 2008 và so sánh kiểu gen của các dòng virus này với các nghiên cứu trước đây (năm 2006). Kết quả nghiên cứu cho thấy, năm 2008, kiểu gen thuộc ORF94 có 12 nhóm vùng lặp lại (VLL), từ 4 - 16 vùng lặp lại trong đó 11-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất (35,8%, 43/120 tổng số mẫu), ORF125 có 8 nhóm vùng lặp lại từ 3 - 14 vùng lặp lại, trong đó 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất (53,8%, 64/119 tổng số mẫu). Năm 2006 cho thấy có 5 nhóm vùng lặp lại thuộc ORF125, từ 4 - 8 vùng lặp lại (Cà Mau) và có 6 nhóm từ 3 - 8 vùng lặp lại (Bạc Liêu), trong đó kiểu gen có 6-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất ở cả hai khu vực (Cà Mau là 59,7%, Bạc Liêu là 24,1%). Sự nhiễm nhiều kiểu gen (ORF94 và ORF125) của WSSV trong cùng 1 ao ở mô hình nuôi QCCT năm 2008 là phổ biến và sự nhiễm kép nhiều kiểu gen trong cùng một mẫu tôm cũng phong phú hơn so với năm 2006. Nghiên cứu còn cho thấy, sự nhiễm bệnh ở các đợt nuôi tôm liên tiếp ở mô hình QCCT chủ yếu là do nguồn tôm giống gây ra. Từ đó có thể thấy khả năng ứng dụng tốt phương pháp PCR Genotying trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ……………………………………….i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vi Chương I - GIỚI THIỆU 1 Chương II - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Tình hình bệnh đốm trắng trên tôm 3 2.1.1 Trên thế giới 3 2.1.2 Ở Việt Nam 4 2.2 Một số vấn đề liên quan đến virus gây đốm trắng - WSSV 5 2.2.1 Hình thái học của WSSV 5 2.2.2 Cấu trúc protein 5 2.2.3 Gen và phân loai học 6 2.2.4 Sự biến đổi về gen và độc lực của các dòng virus 7 2.2.5 Vật chủ cảm nhiễm 7 2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật PCR - genotyping 8 2.3 Phương pháp chẩn đoán PCR 9 2.3.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 9 2.3.2 Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến phản ứng PCR 9 2.3.3 Úng dụng của kỹ thuật PCR 10 Chương III - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 11 3.2 Vật liệu nghiên cứu 11 3.2.1 Dụng cụ và hoá chất 11 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu 12 3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com iv 3.3.2 Phương pháp PCR-genotyping 14 Chương IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 4.1 Phân tích mẫu thu năm 2008 16 4.1.1 Kết quả phân tích PCR-WSSV-IQ2000 16 4.1.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping 19 4.1.2.1 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF94 19 4.1.2.2 Kết quả phân tích PCR-Genotyping thuộc ORF125 25 4.2 Kết quả phân tích mẫu axit nucleic trử năm 2006 với PCR-Genotyping thuộc ORF125 30 4.3 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 33 4.4 So sánh sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau và Bạc Liêu vào năm 2006 và 2008 35 Chương IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Đề xuất 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC I 42 PHỤ LỤC II 43 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com v DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 - Tỉ lệ nhiễm bệnh so với tổng số mẫu phân tích 16 Bảng 4.2 - Các ao có mẫu tôm và mẫu cua dương tính được phân tích 18 Bảng 4.3 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 19 Bảng 4.4 -Số vùng lặp lại của ORF94 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu mẫu 24 Bảng 4.5 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu thu tỉnh Cà Mau năm 2008 25 Bảng 4.6 - Số vùng lặp lại của ORF125 tương ứng với từng ao qua từng đợt thu mẫu 29 Bảng 4.7 - Kết quả phân tích số vùng lặp lại thuộc ORF125 mẫu axit nucleic trử ở Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 32 Bảng 4.8 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008 33 Bảng 4.9 - Số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở Bạc Liêu vào năm 2006 và năm 2008 34 Bảng 4.10 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008 35 Bảng 4.11 - Số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở Bạc Liêu vào năm 2006 và năm 2008 36 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com vi DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 - Hình thái virion của WSSV (Durand et al., 1996) 5 Hình 4.1 - Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng gel agarose 1,5% 17 Hình 4.2 - Các vùng lặp lại thuộc ORF94 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 20 Hình 4.3 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm thả giống đợt 1 21 Hình 4.4 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF94 ở đợt tôm thả giống đợt 2 21 Hình 4.5 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 26 Hình 4.6 - Sự nhiễm kép của WSSV trong cùng một mẫu thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2008 26 Hình 4.7 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm nuôi đợt 1 27 Hình 4.8 - Tỉ lệ phần trăm về số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở đợt tôm nuôi đợt 2 27 Hình 4.9 - Tỉ lệ phần trăm số vùng lặp lại thuộc ORF125 ở 2 tỉnh Cà Mau và Bạc Liêu năm 2006 30 Hình 4.10 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Bạc Liêu năm 2006 . 31 Hình 4.11 - Các vùng lặp lại thuộc ORF125 ở mẫu thu Cà Mau năm 2006 31 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 1 Chương I GIỚI THIỆU Đồng Bằng Sông Cửu Long trong đó, Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng theo thống kế là 3 vùng nuôi tôm lớn ở Miền Nam Việt Nam với nhiều mô hình nuôi phong phú đa dạng. Tuy nhiên, khi dịch bệnh xảy ra (bắt đầu xuất hiện vào năm 1994 và kéo dài đến nay) do nhiều nguyên nhân khác nhau đã dẫn đến thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Trong đó, bệnh đốm trắng là một trong những bệnh gây thiệt hại đáng kể đến năng suất tôm nuôi. Bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus (WSSV) gây ra trên tôm xuất hiện sớm nhất ở Đài Loan năm 1991, sau đó thì phân bố rộng khắp nơi ở các khu vực nuôi tôm trên thế giới. WSSV gây bệnh trên tôm nước mặn, tôm nước ngọt và được phát hiện nhiễm trên nhiều đối tượng khác nhau. Từ khi bệnh xuất hiện đến nay có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu về phương thức lan truyền, vật chủ cảm nhiễm, độc lực, thành phần cấu tạo và đã hoàn thành về phân loại học WSSV, vv,…và đặc biệt đã giải trình tự bộ gen ba dòng WSSV ở Đài Loan, Trung Quốc và Thái Lan. Khi so sánh 3 bộ gen này với nhau, tìm thấy sự thay đổi về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 trên 3 dòng virus này. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, vai trò ứng dụng của việc tìm hiểu sự thay đổi kiểu gen thuộc ba vùng mã hoá này là rất lớn. Theo nghiên cứu của Dieu et al., (2004) và Hoa et al., (2005) cho thấy dựa vào sự khác nhau về số vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 của WSSV có thể xác định được nguồn gốc, phạm vi lan truyền của bệnh từ nơi phát sinh và cũng như sự khác nhau của các dòng WSSV. Do đó, các vùng lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125 có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu về dịch tể học của WSSV ở Việt Nam. Vì vậy, đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR Genotyping trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú” được thực hiện nhằm mục tiêu: Tìm hiểu các vùng lặp lại thuộc ORF94, ORF125 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú thu ở Bạc Liêu và Cà Mau vào năm 2006 và năm 2008. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2 Nội dung nghiên cứu - Phân tích các dòng WSSV thu ở Bạc Liêu và Cà Mau (năm 2006 và 2008) với phương pháp PCR genotyping (thuộc ORF94 và ORF125) - So sánh sự khác nhau về kiểu gen vùng lặp lại thuộc ORF94 và ORF125 ở Cà Mau và Bạc Liêu ở năm 2006 và 2008. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com [...]... PCR- genotyping để xác định số lần lại của trình tự 54 bp bằng đoạn mồi ORF94 Kết quả cho thấy đã tìm ra được 12 dòng WSSV với số lần lặp lại khác nhau như 6-, 7-, 8-, 9-, 1 0-, 1 1-, 1 2-, 1 4-, 1 5-, 1 7-, 1 9-, 2 0- vùng l ặp lại Trong đó các mẫu có 8 vùng lặp lại chiếm đa số Các mẫu tôm này được thu từ 55 ao tôm phát bệnh ở Thái Lan Qua đó cho thấy tiềm năng sử dụng trong nghiên cứu về dịch tể học của bệnh. .. nuôi tôm bị bệnh thấp nhất là Khánh Hoà (14,3%), cao nhất là Ninh Thuận (52,4%) Tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này có giảm Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II, tại các tỉnh Nam Bộ khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng trên mẫu tôm có biểu hiện bệnh thu ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56% Bệnh do virus đốm trắng gây chết tôm. .. nuôi tôm bị nhiễm bệnh Nghệ An có 9, 1- 47,8% diện tích nuôi tôm bị bệnh virus đốm trắng Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh có 67 ha bị bệnh virus đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết Ở các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, cũng có đến hơn 100 ha nuôi tôm bị bệnh Tại các tỉnh miền Trung và Nam Trung Bộ, theo Phòng Bệnh học thủy sản (Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III), địa phương. .. LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thời gian thực hiện: Từ 25/12/2008 – 30/04/2009 Địa điểm phân tích mẫu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thuỷ sản - Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ và hoá chất Dụng cụ: - Que nghiền - Eppendorf 1,5ml, 0,5 ml, 0,2ml - Bộ pipette, găng tay - Đầu col 200µl và 1000µl - Máy ủ - Máy PCR - Thiết... của bệnh đốm trắng trong việc tìm hiểu nguồn gốc gây bệnh và ngăn ngừa việc lây lan Tiếp sau đó Dieu et al., (2004) nghiên cứu dịch tể học phân tử của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm ở VN Mẫu được thu ở 8 nơi khác nhau ở Việt Nam, trong đó 6 mẫu thu tại bờ biển miền Trung và 2 mẫu thu tại miền Nam - Việt Nam Những mẫu dương tính với PCR sẽ được phân tích tiếp theo kỷ thuật PCR- genotyping sử dụng các... nghiệm, trong thực tế chỉ 1 vài loài thu từ ngoài tự nhiên dương tính với WSSV bằng phương pháp PCR Nhưng nhận định cho thấy các loài này không là vật chủ thiết yếu của WSSV, nhưng chúng có khả năng là vật chủ trung gian gây bệnh (Trích dẫn từ C M Escobedo-Bonilla1 et al., 2008) 2.2.6 Một số nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đốm trắng bằng kỹ thuật PCR- genotyping Vào năm 2003 Wongteerasupaya et al., ứng dụng. .. 100 bp plus 3.2.2 Vật liệu nghiên cứu - Mẫu axit nucleic trữ năm 2006 (67 mẫu - Cà Mau và 87 mẫu - Bạc Liêu) - Mẫu tôm sú thu ở tỉnh Cà Mau vào năm 2008 (231 mẫu, Cà Mau) 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp Nested - PCR phát hiện WSSV Theo tài liệu hướng dẫn sử dụng của bộ kit IQ-2000 WSSV (Công ty Farming... ưu thế ở 2 nghiên cứu này là khác nhau (ở Ấn Độ có 4-VLL chiếm ưu thế, còn ở nghiên cứu này là 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất) So với các nghiên cứu trước đây (ở trong nước), kiểu vùng lặp lại thuộc ORF125 ở nghiên cứu này tuy thu mẫu ở 2 huyện thuộc tỉnh Cà Mau nhưng nhóm kiểu gen xuất hiện lại phong phú hơn Ở nghiên cứu của Tô Vũ An (2008) chỉ tìm thấy 5 nhóm vùng lặp lại ( 4-, 5-, 6-, 7- và 8-VLL) ở 12... Ở mẫu tôm thả giống Lần 1 có 10 nhóm vùng lặp lại, gồm có 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 1 0-, 1 1-, 1 2-, và 13-VLL (Hình 4.7), trong đó 7-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất là 65,5% (38/58 mẫu thu lần 1 ở Cái Nước) Còn mẫu tôm thả giống lần 2 chỉ có 6 nhóm vùng lặp lại từ 3 - 9 vùng lặp lại, trong đó số vùng lặp lại chiếm ưu thế có 2 loại kiểu gen là 7-VLL và 8VLL chiếm tỉ lệ cao và gần tương đương với nhau (7-VLL chiếm... 8-, 9-, 1 0-, 1 1-, 1 2-, 1 3-, 1 4- và 15-VLL (Hình 4.3) Trong đó 14-VLL chiếm tỉ lệ cao nhất là 38,6% (22/65 so với tổng số mẫu lần 1) Tuy nhiên, ở mẫu cua thu kèm theo lần 1 không thấy nhiễm kiểu gen này Giống với Hoa et al., 2005 nghiên cứu kiểu gen thuộc ORF94 nhiễm trên cua và tôm trong cùng 1 ao, cho thấy, kiểu gen xuất hiện ở mẫu cua và mẫu tôm giống nhau là không phổ biến Ở mẫu cua, theo nghiên cứu . THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN. THỊ NGHIỄM ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR - GENOTYPING TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ LUẬN VĂN