TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN TRẦN VIỆT TIÊN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR VÀ RT-PCR TRONG CHẨN ĐOÁN WSSV (White Spot Syndrome virus) VÀ GAV (Gill-associated virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Ths. NGUYỄN MINH HẬU Ks. TRẦN THỊ MỸ DUYÊN 2007 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu i LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản, Bộ Môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này Cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài Thầy Nguyễn Minh Hậu, chị Trần Thị Mỹ Duyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Các thầy, cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm đại học Gia đình và bạn bè luôn ở bên tôi trong suốt thời gian qua Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ii TÓM TẮT Đề tài được thực hiện nhằm xác định khả năng ứng dụng phương pháp RT- PCR và PCR trong nghiên cứu tác nhân GAV và WSSV trên tôm sú giống ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong 169 mẫu tôm sú giống được phân tích bằng kit IQ2000 YHV/GAV và WSSV thì có 10,7% mẫu cho kết quả dương tính với GAV và 4,2% mẫu cho kết quả dương tính với WSSV. Sáu mẫu dương tính với GAV được chọn để thực hiện qui trình của Cowley et al., 2000. Sản phẩm PCR cho kết qu ả ở 317 bp. Sau đó tiếp tục xác định khả năng ứng dụng khi kết hợp qui trình RT-PCR của Cowley et al. (2000) và qui trình RT-PCR phát hiện gen β-actin (Oanh, 2007) thì phát hiện đồng thời ARN tt của tôm ở vị trí 216 bp và GAV ở vị trí 317 bp. Việc phát hiện cho thấy khả năng ứng dụng β-actin làm đối chứng ARN của tôm trong kỹ thuật RT-PCR. Dựa trên kết quả đạt được, qui trình tương tự đối với WSSV cũng được thực hiện dựa theo qui trình phát hiện WSSV của OIE (2006). Theo qui trình này, sản phẩm PCR sẽ cho kết quả ở 941 bp và phát hiện đồng thời gen β-actin của tôm. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH SÁCH BẢNG v DANH SÁCH HÌNH vii CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1 Tổng quan về tình hình nuôi tôm 3 2.1.1 Trên thế giới 3 2.1.2 Ở Việt Nam 4 2.2 Tổng quan về tình hình dịch bệnh trên tôm 5 2.2.1 Trên thế giới 5 2.2.2 Ở Vi ệt Nam 8 2.3 Sơ lược về GAV 9 2.3.1 Tác nhân gây bệnh 9 2.3.2 Phân bố 10 2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm 10 2.3.4 Phương thức lây nhiễm 10 2.3.5 Phương pháp chẩn đóan 10 2.3.6 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (RT-PCR) phát hiện GAV 13 2.4 Sơ lược về WSSV 15 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 15 2.4.2 Phân bố 16 2.4.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm 16 2.4.4 Phương thức lây nhiễ m 17 2.4.5 Phương pháp chẩn đóan 17 2.4.6 Phương pháp phòng và xử lí bệnh 19 2.4.7 Một số nghiên cứu liên quan đến phương pháp (PCR) phát hiện WSSV 20 2.5 Phương pháp PCR 22 2.6 Phương pháp RT-PCR 24 2.7 Ứng dụng của kĩ thuật PCR trong thủy sản 25 CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu iv 3.2 Vật liệu nghiên cứu 26 3.2.1 Dụng cụ 26 3.2.2 Hóa chất 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 28 3.3.1 Phương pháp thu mẫu 28 3.3.2 Phát hiện GAV với Kit IQ2000YHV/GAV 28 3.3.3 Qui trình RT- PCR phát hiện GAV (Cowley et al., 2000) 30 3.3.4 Qui trình RT-PCR phát hiện gen β - actin của tôm (Oanh, 2007) 34 3.3.5 Phát hiện WSSV với Kit IQ2000WSSV 36 3.3.6 Ly trích mẫu 38 3.3.7 Phương pháp đo hàm lượng ADN, ARN bằng máy so màu quang phổ 39 3.3.8 Khuếch đại ADN (OIE, 2006) 39 3.3.9 Xử lí số liệu 41 CHƯƠNG IV: KẾT QU Ả VÀ THẢO LUẬN 42 4.1 Khảo sát tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên GAV, WSSV của tôm sú giống ở một số tỉnh ĐBSCL 42 4.2 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện GAV trên tôm theo phương pháp của Cowley et al., 2000 43 4.3 Thực hiện qui trình RT-PCR phát hiện gen β-actin của tôm (Oanh, 2007) 45 4.4 Xác định khả năng ứng dụng của qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và gen β-actin trên tôm 47 4.5 Thực hiện qui trình PCR phát hiện WSSV trên tôm theo OIE (2006) 48 CH ƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Đề nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 62 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu v DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Diện tích, sản lượng và giá trị xuất khẩu hàng năm của nuôi trồng thủy sản Bảng 2.2: Sản lượng thủy sản phân theo khu vực địa phương (ĐV: Tấn) Bảng 2.3: Ước tính giá trị sản lượng thất thoát do dịch bệnh trên tôm ở Châu Á và Châu Mĩ Bảng 3.1: Trình tự 4 đoạn mồi sử dụng trong qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000 ) Bảng 3.2: Trình tự 2 đoạn mồi sử d ụng trong qui trình RT-PCT phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Bảng 3.3: Trình tự 4 đoạn mồi sử dụng trong qui trình PCR (OIE, 2006) Bảng 3.4: Thành phần hóa chất tham gia vào quá trình trộn hỗn hợp A tạo cDNA Bảng 3.5: Thành phần hóa chất tham gia vào quá trình trộn hỗn hợp B tạo cDNA Bảng 3.6: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 của qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) Bảng 3.7: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại bước 2 của qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) Bả ng 3.8: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuyếch đại của qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Bảng 3.9: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 của qui trình OIE (2006) Bảng 3.10: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 của qui trình OIE (2006) Bảng 4.1: Hàm lượng ARN của 6 mẫu phân tích Bảng 4.2: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và gen β – actin trên tôm Bảng 4.3: Hàm lượng ADN của 3 mẫ u phân tích Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vi Bảng 4.4: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 theo qui trình của OIE (2006) Bảng 4.5: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 theo qui trình của OIE (2006) Bảng 4.6: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 1 theo qui trình của OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi Bảng 4.7: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại bước 2 theo qui trình của OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tă ng gấp đôi Bảng 4.8: Hàm lượng ADN của 3 mẫu phân tích ly trích bằng DTAB/CTAB Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu vii DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Sản lượng nuôi tôm nuôi và đánh bắt trên thế giới Hình 2.2: Sản lượng tôm nuôi một số nước trên thế giới. Hình 2.3: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001. Hình 2.4: Tôm bị nhiễm GAV. Mang tôm chuyển sang màu vàng. Hình 2.5: Tôm bị nhiễm GAV. Tòan thân tôm chuyển sang màu đỏ. Hình 2.6: Tôm bị nhiễm GAV. Tế bào biểu mô có hiện tượng nhân kết đặc Hình 2.7: Cơ quan lymphoid nhiễm GAV, mũi tên chỉ sự hiện diện của vi rút Hình 2.8: Cơ quan lymphoid của tôm nhiễm GAV, mũi tên chỉ s ự hiện diện của vi rút khi lai In situ. Hình 2.9: Quan sát GAV dưới kính hiển vi điện tử. Hình 2.10: Vi-rút nhuộm âm ở trong huyết tương của tôm sú nhiễm bệnh WSSV, một số thể vi-rút có đuôi Hình 2.11: Vỏ của một tôm sú ấu niên bị bệnh đốm trắng Hình 2.12: Lát cắt mô dạ dày của tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh đốm trắng Hình 2.13: Lát cắt mang của tôm P.chinensis ấu niên bị bệnh baculovirus đốm trắng Hình 3.1: Minh h ọa kết quả chạy PCR phát hiện YHV/GAV theo kit IQ2000 Hình 3.2: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện GAV theo qui trình RT- PCR (Cowley et al., 2000) Hình 3.3: Minh họa kết quả chạy PCR theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) Hình 3.4: Minh họa kết quả chạy PCR phát hiện WSSV theo kit IQ2000 Hình 4.1: Tỉ lệ cảm nhiễm GAV trên tôm sú giống Hình 4.2: Tỉ lệ cảm nhiễm WSSV trên tôm sú giống Hình 4.3: Kết quả chạy PCR bước 2 (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu viii Hình 4.4: Kết quả chạy PCR bước 2 (6 mẫu) theo qui trình RT-PCR (Cowley et al., 2000) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác nhau Hình 4.5: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 và 124 Hình 4.6: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình RT-PCR phát hiện gen β – actin (Oanh, 2007) với mẫu 123 pha loãng với hàm lượng khác nhau Hình 4.7: Kết quả chạy PCR theo qui trình mRT-PCR phát hiện GAV và β – actin trên tôm Hình 4.8: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình của OIE (2006) Hình 4.9: Kết quả ch ạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) với hàm lượng khuôn và mồi tăng gấp đôi Hình 4.10: Kết quả kiểm tra ADN trên gel với agarose 1% Hình 4.11: Kết quả chạy PCR bước 2 mẫu 142 (với 4 hàm lượng ADN khuôn) theo qui trình OIE (2006) Hình 4.12: Kết quả chạy PCR bước 2 theo qui trình OIE (2006) của mẫu ly trích bằng DTAB/CTAB Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU Hiện nay ngành nuôi trồng thủy sản đã và đang ngày càng có vai trò quan trọng, đem lại hiệu quả kinh tế cao. Đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), ngành nuôi trồng thủy sản đã trở thành thế mạnh của vùng trong những năm gần đây. Tổng diện tích có tiềm năng phát triển khả năng nuôi trồng thủy sản trong vùng trên 1.200.000 ha bằng gần 55% diện tích nuôi của cả nước (B ộ thủy sản, 2006). Ngành thủy sản với sự phát triển nhanh của mình đã tạo ra hàng loạt việc làm, nuôi trồng thủy sản chủ yếu ở qui mô hộ gia đình nên đã trở thành nguồn thu hút một lực lượng lao động đông đảo tham gia vào tất cả công đoạn sản xuất, làm giảm sức ép của nạn thiếu việc làm trên cả nước. Tuy nhiên ở khá nhiều nơi do phát triển ồ ạt, tự phát, thiếu quy hoạch người nuôi chưa có hiểu biết cơ bản về kỹ thuật nuôi tôm nhất là chưa nhận thức đúng mức về nguy cơ ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong quá trình nuôi tôm nên năng suất thấp, tổn thất là điều không tránh khỏi, gây khó khăn về đời sống kinh tế cho người nuôi tôm. Hiện nay có nhiều loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi tôm nhưng nguy hiểm nh ất là bệnh do vi-rút gây ra như vi-rút gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus - WSSV), vi-rút gây hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus - TSV), vi-rút gây bệnh đầu vàng (Yellow Head Virus - YHV) Đặc biệt là vi-rút gây bệnh liên kết mang (Gill- associated Virus - GAV) bệnh này xuất hiện đầu tiên vào năm 1996 ở Queensland, Úc (Spann et al., 1997). Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của ngườ i nuôi không cho phép phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phương pháp như lai In situ, Western blot, PCR, RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược điểm vừa kể trong việc phát hiện GAV, WSSV trên tôm sú giúp người nuôi phát hiện kịp thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây ra, nâng cao năng suất (Phan Quốc Việt và ctv, 2003). Do đó đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR và RT-PCR trong chẩn đoán WSSV (White Spot Syndrome Virus) và GAV (Gill associated virus) trên tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu [...]... tài Xác định khả năng ứng dụng qui trình RT -PCR và PCR trong chẩn đoán phát hiện sớm vi-rút GAV, WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long Nội dung của đề tài 1 Xác định tỉ lệ cảm nhiễm tự nhiên của GAV và WSSV trên tôm giống xét nghiệm tại Khoa Thủy sản từ tháng 2-5/2007 sử dụng kit IQ2000YHV /GAV và kit IQ200 0WSSV 2 Thực hiện qui trình RT -PCR phát hiện GAV ở tôm sú theo phương pháp... Thực hiện qui trình RT -PCR phát hiện gen β – actin ở tôm sú theo Oanh (2007) 4 Xác định khả năng ứng dụng qui trình mRT -PCR phát hiện GAV và β - actin 5 Thực hiện qui trình PCR phát hiện WSSV trên tôm sú theo OIE (2006) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 2 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình nuôi tôm 2.2.1 Trên thế giới Trung Nghề nuôi tôm biển có lịch sử... liệu phân tử và so sánh về bệnh lí giúp ích rất nhiều trong việc nghiên cứu dịch tễ học của bệnh trong việc tìm hiểu nguồn gốc gây bệnh và ngăn ngừa việc lây lan Đến năm 2000, Cowley et al đã phát hiện GAV (gill-asociated virus) và LOV (Lymphoid Organ Virus) trên P.mondon bằng kỹ thuật RT-nested PCR Kỹ thuật này sử dụng 2 cặp mồi GAV5 /6 để khuếch đại bước 1 cho sản phẩm ở 618 bp và cặp mồi GAV1 /2 khuếch... nucleocapside và virion cứu liệu ĐH Cần dục Nhưng lại liệu học tập và nghiên trong tế của GAV trên 100% cơ quan lymphoid của tôm giống cỡ 1,2g Sử dụng phương pháp RT -PCR và phân tích trình tự từ tôm bố mẹ và trứng được thụ tinh nhân tạo thì thấy kiểu di truyền cả bố và mẹ đều hiện diện trong trứng tuy nhiên kiểu di truyền của tôm mẹ chiếm ưu thế hơn Từ dữ liệu RT-nested PCR về mức độ nhiễm trên trứng, nauplii,... nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996, khoảng 360.000 ha Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung và ở đồng bằng sông Hồng, sông Thái Bình ở miền Bắc (http://www.vietlinh.com.vn/ html/tintuc) 4 Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh từ những năm 90 và đặc biệt là từ sau năm 2000, Việt Nam trở thành một trong. .. vùng gen tương ứng của YHV (Yellow Head Virus) phân lập từ Thái Lan và GAV (GillAsociated Virus) phân lập từ Úc 3 vùng được chọn để so sánh nằm trong vùng ORF1b Trước tiên ở vùng gen khoảng 577 bp sử dụng cặp mồi GAV5 và GAV6 để khuếch đại thì nhận thấy YHV và GAV giống nhau 85,1% trình tự nucleotide và 95,8% trình tự amino acid Khi sử dụng cặp mồi 10F và 144R thì không thể phát hiện được GAV nhưng phân... tôm bố mẹ và cả trên giáp xác ở Ấn Độ Cặp mồi được sử dụng để phát hiện WSSV trên P.japonicus là PJ1/2 và cặp mồi sử dụng cho tôm P.mondon là PM1/2 Tất cả những mẫu tôm giống và tôm bố mẹ khỏe đều cho kết quả âm tính với 2 cặp mồi này Tuy nhiên ở những mẫu nhiễm WSSV ở mức độ trung bình thì chỉ cặp mồi PM cho kết quả Khi tiến hành kiểm tra trên giáp xác thì phát hiện 1 mẫu ấu trùng Artermia vài mẫu cua... planipes và Charybdis lucifera cho kết quả dương tính với WSSV Kết quả cho thấy WSSV không chỉ phổ biến trên tôm mà còn ở cả trên giáp xác ở Ấn Độ Trung Hsu et al (1999) đã nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp PCR trong việc phát hiện WSSV trên tôm Thơ @ Tài liệu kiểm tra những mẫu ADN tâm Học liệu ĐH Cầnbố mẹ Ông đã tiến hànhhọc tập và nghiên cứu ly trích âm tính và cho kết quả dương tính ở bước 2... quả âm tính với WSSV Trứng của 15 tôm còn lại chia thành 2 nhóm, nhóm nhiễm nhẹ (8 tôm) và nhóm trở nên nhiễm nặng (7) Những tôm trở nên nhiễm nặng sau khi đẻ thì 91% trứng của chúng cho kết quả dương tính với WSSV ở bước 2 Từ nghiên cứu này cho thấy, nên kiểm tra lại những tôm sau khi đẻ để loại những lỗi do âm tính giả, và loại bỏ những trứng mà tôm mẹ cho kết quả dương tính với WSSV ở bước 1 Mặc khác... tập và nghiên cứu Magbanua et al (2000) đã nghiên cứu về mức độ phổ biến và sự phân bố địa lí của vi-rút gây bệnh đốm trắng ở Phillipines từ thắng 5/1999 bằng kỹ thuật PCR và Western blot Tổng số 71 mẫu tôm kiểm tra vi-rút gây bệnh đốm trắng có 18 mẫu ở giai đoạn ấu trùng và 53 mẫu ở giai đoạn trưởng thành (56 – 160 ngày nuôi) Trong 71 mẫu kiểm tra có 51 mẫu (72%) cho kết quả dương tính với WSSV trong . và ctv, 2003). Do đó đề tài Ứng dụng kỹ thuật PCR và RT -PCR trong chẩn đoán WSSV (White Spot Syndrome Virus) và GAV (Gill associated virus) trên tôm. khả năng ứng dụng qui trình RT -PCR và PCR trong chẩn đoán phát hiện sớm vi-rút GAV, WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon) ở đồng bằng sông Cửu Long. Nội