Thông tin tài liệu
LOGO
Chương 2: CÁC KỸ THUẬT
NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(tiếp theo)
Nguyen Thi Viet Anh
www.themegallery.com
Nội dung
1. Các kỹ thuật chính dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.2. Các enzym dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.3. Các vector nhân dòng dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp
1.1. Khái niệm
1.4. Nhân dòng gen (gene cloning)
2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA
2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA
2.3. Phương pháp PCR
2.4. Kỹ thuật xác định trình tự DNA
2.5. Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA)
2.6. Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR (AFLP, SSR)
1.5. Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen
2.7. Genomic và proteomic
www.themegallery.com
Ngân hàng bộ gen:
Thư viện DNA từ bộ gen (lắc cơ học, RE);
Khái niệm ngân hàng bộ gen (Bank of genomic DNA):
• Đoạn DNA được tách dòng (khác nhau do tế bào, bộ gen, RE,…);
• Bao gồm exon và intron;
• VD: ngân hàng bộ gen của vi khuẩn;
• tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gen và đã được tách
dòng trong tế bào chủ;
• Đầu tiên DNA 300.000-400.000 bp gắn vào YAC hoặc BAC, cắt
đoạn nhỏ trung bình 30.000-40.000 bp gắn vào cosmid, cuối cùng
là các đoạn trung bình 4.000 bp gắn vào plasmid để giải kí tự chuỗi.
2. Các kỹ thuật chính sử
dụng trong phân tích DNA
www.themegallery.com
2. Các kỹ thuật chính sử
dụng trong phân tích DNA
Bước 1: Dùng enzyme cắt giới hạn
Bước 2: DNA bị cắt thành nhiều
đoạn khác nhau
Bước 3: đoạn DNA
được đưa vào vector
www.themegallery.com
Ngân hàng cDNA
Bộ gen Eukaryotae (1,7% gen người-mã hoá protein);
Tập hợp cDNA được tổng hợp nhờ kỹ thuật phiên mã ngược
mRNA tương ứng (cDNA=complementary DNA);
Exon;
Enzyme reverse transcriptase, DNA polymerase;…
cDNA từ những đoạn gen đã được phiên mã ra mRNA (khác
biệt tuỳ vào tế bào của mô đã được biệt hoá và giai đoạn biệt
hoá) tổng hợp các ngân hàng cDNA trong từng loại tế bào,
từng loại mô của các cơ quan sẽ hình thành nên ngân hàng
cDNA của một cơ quan nào đó.
VD: rễ lúa
www.themegallery.com
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Kỹ thuật tạo
ngân hàng cDNA
Kỹ thuật phiên mã ngược
tạo cDNA:
Tách chiết và tinh sạch mRNA của
tế bào;
Sử dụng kỹ thuật PCR: các đoạn
mồi (primer) đặc hiệu, các loại
nucleotide tự do, DNA
polymerase…
mRNA tổng hợp nên cDNA;
Enzyme RNase H để phân huỷ sợi
khuôn RNA;
Tổng hợp sợi đơn cDNA thứ 2
www.themegallery.com
Kỹ thuật tạo
ngân hàng cDNA
Kỹ thuật phiên mã ngược tạo cDNA: có 2 nhóm
phương pháp chủ yếu:
Phiên mã ngược bằng phân huỷ hoàn toàn sợi khuôn mRNA
(cDNA có cấu trúc kẹp tóc-hairpin loop, S
1
nuclease cắt bỏ);
Phiên mã ngược tạo cDNA theo kỹ thuật RACE (rapid
amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhân nhanh đầu cuối
cDNA.
Video cDNA libraries
www.themegallery.com
Ưu điểm sử dụng ngân hàng cDNA:
Các dòng c-DNA chứa trình tự mã hoá liên tục của
một gen;
Những tế bào chuyên hoá sẽ tạo ra số lượng lớn của 1
loại protein;
Dễ chiết tách; giảm nhẹ việc xác định đúng dòng
mong muốn từ ngân hàng gen.
Kỹ thuật tạo
ngân hàng cDNA
[...]... www.themegallery.com Kỹ thuật RFLP Ứng dụng: Chọn lọc các cá thể; chọn giống động thực vật; Phát hiện các cặp gen nghiên cứu là đồng hợp hay dị hợp tử hay có liên kết gen…; Kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo quy luật Mendel; So sánh sự tiến hố của các lồi; So sánh sự khác nhau giữa các cá thể trong lồi www.themegallery.com Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR Kỹ thuật. .. www.themegallery.com www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA Các phương pháp xác định trình tự DNA thế hệ mới: Dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại dNTP www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật giải trình tự 454 pyrosequencing Kỹ thuật giải trình tự dựa trên sự nối với chất hố học 4 màu www.themegallery.com Kỹ thuật RFLP Kỹ thuật RFLP (dựa vào lai DNA/DNA):... đầy đủ trình tự các nucleotide của đoạn DNA www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA Phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA Phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA Hạn chế của phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert:... polymorphism (các đoạn DNA đa hình được khuếch đại chọn lọc); Các cặp mồi (primer) đặc hiệu khuếch đại đoạn DNA cần nghiên cứu; Thực hiện PCR lần thứ 2 với các mồi được nối thêm 1 hoặc 2 nucleotide ở đầu 3’ (hoặc 5’) của mồiđể nhân các đoạn DNA có tính đặc hiệu cao; Cho phép phân biệt mức độ giống nhau khác nhau của các đơn vị dưới lồi (quan hệ di truyền gần nhau) www.themegallery.com Kỹ thuật AFLP... RFLP=Restriction fragment length polymorphism; Dựa trên đặc điểm của các loại enzyme cắt giới hạn; Các đoạn cắt = các “dấu vân tay” (fingerprinting) đặt trưng cho từng loại phân tử; Bản đồ di truyền các kết quả của RFLP: xác định nguồn gốc hoặc kiểm tra mức độ tiến hố của các lồi sinh vật www.themegallery.com Kỹ thuật RFLP Bao gồm các bước: Tách chiết và tinh sạch DNA; Xử lí bằng enzyme cắt... (quan hệ di truyền gần nhau) www.themegallery.com Kỹ thuật AFLP www.themegallery.com Kỹ thuật AFLP www.themegallery.com Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa trên PCR Kỹ thuật SSR: SSR = Simple sequence repeat (các trình tự lặp lại đơn giản, Arbitrary primerPCR, PCR mồi tự chọn); www.themegallery.com Kỹ thuật SSR Các trình tự lặp lại đơn giản (simple sequence repeat): Hay còn gọi là microsatellite... www.themegallery.com Kỹ thuật RFLP Southern blotting: Phương pháp lai giữa các đoạn DNA mạch đơn của mẫu cần nghiên cứu với các mẫu dò đánh dấu phóng xạ (các đoạn oligo nucleotide đã biết trình tự) Gồm các bước: Cắt ADN bằng men giới hạn Điện di trên gel Biến tính ADN (NaOH & NaCl) Chuyển ADN sang màng (transfer) Lai với mẫu dò được đánh dấu bằng đồng vò phóng xạ Rửa màng lai Phát hiện phân tử lai... (hoặc ít nhất là một phần của đoạn cần khuếch đại) www.themegallery.com Phương pháp PCR Các dạng PCR mở rộng: RT-PCR (reverse transcripstase PCR): mRNA làm khn mẫu chuyển thành cDNA cho sự khuếch đại PCR; Real-Time PCR: PCR định lượng, có thể biết được số lượng DNA khuếch đại trong q trình khuếch đại; PCR-ELISA: kết hợp với miễn dịch trong chuẩn đốn www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự... định trình tự của DNA (sequencing) là biết được trình tự sắp xếp của 4 loại Nu trên chuỗi DNA www.themegallery.com Kỹ thuật xác định trình tự DNA Phương pháp hố học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert: 1 Đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở đầu 5’ của DNA; 2 Xử lí với hố học làm biến đổi 1 hay 2 base (dimethylsulphate làm biến đổi Guanine, hydrazine và NaCl làm biến đổi Cytosine…); 3 Các Nucleotide... Khn mẫu (DNA cần khuếch đại) ; Các đoạn mồi (primer ~18-25 Nucleotide); DNA polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase); Các nucleotide tự do (dNTP); Dung dịch đệm thích hợp; Video phản ứng PCR www.themegallery.com Phương pháp PCR Lợi ích: Khuếch đại các trình tự nucleotide đặc hiệu Thời gian thực hiện cực nhanh; Đơn giản và ít tốn kém; Độ tinh sạch của mẫu khơng cần cao Giới hạn: . LOGO
Chương 2: CÁC KỸ THUẬT
NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(tiếp theo)
Nguyen Thi Viet Anh
www.themegallery.com
Nội dung
1. Các kỹ thuật chính dùng.
2. Các kỹ thuật chính sử dụng trong phân tích DNA
2.1. Kỹ thuật chiết tách DNA và RNA
2.2. Kỹ thuật tạo ngân hàng cDNA
2.3. Phương pháp PCR
2.4. Kỹ thuật
Ngày đăng: 18/02/2014, 12:20
Xem thêm: Tài liệu Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo) doc, Tài liệu Chương 2: CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (tiếp theo) doc